Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo

Com a descrição dos sistemas de efluxo, descobriu-se que a resistência de P.

aeruginosa é determinada pela interação entre a impermeabilidade da membrana e o efluxo ativo

dos agentes antimicrobianos (Strateva & Yordanov 2009). O sequenciamento do genoma de P.

aeruginosa permitiu a identificação de 12 sistemas de efluxo da família RND denominados Mex,

do inglês “multidrug efflux pump”, de expressão constitutiva e codificada por operons sempre regulados pelo produto de um gene regulador proximal. Dez desses sistemas foram caracterizados até o momento: MexAB-OprM (ABM), MexCD-OprJ (CDJ), MexEF-OprN (EFN), MexXYOprM (XY), MexJK-OprM, MexGHI-OpmD, MexVW-OprM, MexPQ-OpmE, MexMN-OprM e TriABC-OpmH (Lister et al., 2009; Strateva & Yordanov 2009). O primeiro sistema de efluxo do tipo RND caracterizado nesse micro-organismo foi o MexAB-OprM (Poirel et al., 2001a). De todos os sistemas de efluxo da família RND caracterizados em P. aeruginosa, somente ABM, CDJ, EFN e XY têm sido relacionados, até o momento, à resistência intrínseca e adquirida a uma ampla variedade de agentes antimicrobianos de importância clínica. Os outros sistemas Mex de P. aeruginosa provavelmente possuem limitada significância clínica, uma vez que, são capazes de ejetar um número menor de antimicrobianos e sua expressão não foi detectada nos isolados clínicos (Poirel et al., 2001a).

Em 2010, o trabalho publicado por Xavier e colaboradores evidenciou que os sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexXY-OprM eram frequentemente mais transcritos que os sistemas

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Página 28 de efluxo MexEF-OprN e MexCD-OprJ em isolados clínicos de P. aeruginosa em um hospital universitário e terciário da cidade de São Paulo. Resultados semelhantes foram reportados no estudo brasileiro de Fehlberg e colaboradores em 2012, no qual verificou-se que o sistema de efluxo mais expresso foi o MexXY-OprM.

2.4.3.1. MexAB-OprM

MexAB-OprM é o sistema de efluxo mais importante em P. aeruginosa, por expressar constitutivamente um importante papel na resistência intrínseca e adquirida a múltiplos antimicrobianos nesta espécie bacteriana (Masuda et al., 2000). A bomba ejeta os seguintes antimicrobianos: os β-lactâmicos, os inibidores de β-lactamases, as fluoroquinolonas, os macrolídeos, as tetraciclinas, o cloranfenicol, a novobiocina, as sulfonamidas, o trimetoprim e as tiolactomicinas (Narita et al., 2003). Curiosamente, esse sistema ejeta também o meropenen, mas não o imipenem (Yoneyama et al., 2000).

A expressão do sistema MexAB-OprM é regulada pela proteína MexR, sendo codificada pelo gene mexR (Saito et al., 2003). A hiperexpressão desse sistema é observada em três tipos de cepas de P. aeruginosa mutantes: nalB, nalC e nalD. Os mutantes nalB apresentam alterações na sequência de DNA do gene, enquanto nos mutantes nalC e nalD a hiperexpressão do operon mexAB-oprM é determinada por alterações em outros genes reguladores. As cepas mutantes nalC carregam uma mutação no gene PA3721 e possui a capacidade de inibir a atividade repressora de MexR (Saito et al., 1999).

2.4.3.2. MexCD-OprJ

Diferentemente do sistema de efluxo MexAB-OprM, o sistema MexCD-OprJ não é expresso em cepas selvagens de P. aeruginosa, e assim não contribui para resistência

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Página 29 intrínseca. Dessa forma, sua expressão pode ser observada entre mutantes nfxB, resultante de mutação no gene repressor da transcrição desse sistema de efluxo, localizado no operon

mexCD-oprJ. Esses mutantes demonstram resistência às quinolonas, às tetraciclinas, ao

cloranfenicol, à acriflavina, ao brometo de etídio, ao triclosan e aos solventes orgânicos (Masuda

et al., 1996; Poole et al., 1996).

Os mutantes nfxB são classificados em dois tipos: nfxB tipo A, que apresenta resistência à ofloxacina, à eritromicina e às cefalosporinas de quarta geração, e nfxB tipo B resistentes à tetraciclina e ao cloranfenicol, em adição aos agentes mencionados para o tipo A (Chuanchuen

et al., 2001). A seleção desses mutantes pode ser realizada com exposição dos isolados clínicos de P. aeruginosa às fluoroquinolonas (Wolter et al., 2007).

2.4.3.3. MexEF-OprN

A expressão de MexEF-OprN também é representada por cepas selvagens de P.

aeruginosa. Este sistema é expresso em cepas denominadas nfxC, que apresentam resistência

a múltiplas drogas como às fluoroquinolonas, ao cloranfenicol e ao trimetoprim, como consequência da ejeção direta, e indiretamente ao imipenem (Hooper et al., 1992; Fukuda et al., 1995). A seleção de mutantes nfxC pode ser observada pela exposição às fluoroquinolonas

(Kumar & Schweizer 2005). Além disso, os mutantes nfxC, apresentam aumento da sensibilidade aos β-lactâmicos e aos aminoglicosídeos, com isso a diminuição da expressão de outros sistemas como MexAB-OprM e MexXY-OprM (Okamoto et al., 2002; Wolter et al., 2004b). Essa transcrição é dependente da presença de MexT, uma proteína ativadora da sua transcrição, codificada por um gene localizado à montante do operon de MexEF-OprJ. A transcrição de mexT é suficiente para ativar a expressão desse operon (Maseda et al., 2004).

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Página 30 Acredita-se que MexT possui uma função regulatória repressora, porque possui propriedade ativadora da expressão gênica, implicando na inibição pós-transcricional da expressão da porina OprD. Sendo assim, a resistência ao imipenem exibida pelos mutantes nfxC é explicada pela redução da expressão de OprD e não como consequência direta da extrusão do imipenem por esse sistema (Kolayli et al., 2004; Wolter et al., 2004a). Além disso, com a hiperexpressão de MexEF-OprN em mutantes nfxC é observada o aumento da expressão de fatores de virulência em P. aeruginosa (Maseda et al., 2004).

2.4.3.4. MexXY-OprM

Diferentemente dos outros sistemas de efluxo em P. aeruginosa, o operon mexXY não possui o gene codificador de proteína de membrana externa. Para esta função o sistema utiliza a OprM, que exerce o mesmo papel de canal extrusivo como nos outros sistemas de efluxo (Poole 2001). Por causa da deleção desses genes, as cepas selvagens de P. aeruginosa apresentam sensibilidade aos aminoglicosídeos, à tetraciclina e à eritromicina, indicando que esse sistema é responsável pela resistência intrínseca de P. aeruginosa a esses antimicrobianos (Aires et al., 1999). Esse sistema quando está hiperexpresso também é capaz de causar resistência às fluorquinolonas (Mine et al. 1999).

2.4.3.5. MexJK

Ao contrário dos outros sistemas de efluxo, esse sistema exibe a mais restrita especificidade de substratos dos sistemas RND de P. aeruginosa (Chuanchuen et al., 2005a), essa bomba foi identificada como resultado da exposição ao triclosan, uma droga com atividade antibacteriana. A partir dessa exposição ao triclosan foi capaz de selecionar organismos que

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Página 31 apresentavam mutação do gene mexL e cujo produto de sua expressão exerce a função regulatória do operon mexJK-opmD (Chuanchuen et al., 2005b, Chuanchuen et al., 2001).

O sistema MexJK apresenta uma diferença em relação aos outros sistemas de efluxo, pois utiliza diferentes proteínas de membrana externa, dependendo do composto a ser ejetado. Para a ejeção de eritromicina e tetraciclina é utilizada a OprM, enquanto que OmpH é utilizada para a extrusão de triclosan (Chuanchuen et al., 2005a).

2.4.3.6. MexGHI-OpmD e MexVW

No sistema MexGHI-OpmD contém uma proteína de fusão MexH localizada no espaço periplasmático, uma proteína de membrana interna MexI que funciona como bomba e uma proteína de membrana externa OpmD que representa o canal extrusivo. Esse sistema também apresenta uma pequena proteína, MexG, cuja função é desconhecida. Esse sistema confere resistência à norfloxacina, ao brometo de etídio, à acriflavina e à rodamina 6G (Aendekerk et al., 2002).

O MexVW foi o sistema de efluxo da família RND mais recentemente caracterizado e demostra o seu funcionamento em conjunto com a proteína de membrana externa OprM, sendo assim, conferindo resistência às fluoroquinolonas, à tetraciclina, ao cloranfenicol, à eritromicina, ao brometo de etídio e à acriflavina (Li et al., 2003).