Estudo da Frequência Temporal e Padronização de uma PCR Multiplex. para a Detecção de Oxacilinases em Isolados Clínicos de Pseudomonas.

(1)

FERNANDA VILLAS BOAS PETROLINI

Estudo da Frequência Temporal e Padronização de uma PCR Multiplex

para a Detecção de Oxacilinases em Isolados Clínicos de Pseudomonas

aeruginosa

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Mestre em Ciências.

São Paulo 2013

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ii

Estudo da Frequência Temporal e Padronização de uma PCR Multiplex

para a Detecção de Oxacilinases em Isolados Clínicos de Pseudomonas

aeruginosa

Orientadora: Profª. Drª. Ana Cristina Gales Co-orientador: Dr. Rodrigo Cayô da Silva

Este trabalho foi realizado com o auxílio financeiro fornecido pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (Processo número 2012/17148-8).

São Paulo 2013

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iii

Petrolini, Fernanda Villas Boas

Estudo da Frequência Temporal e Padronização de uma PCR Multiplex para a Detecção de Oxacilinases em Isolados Clínicos de Pseudomonas

aeruginosa.

Fernanda Villas Boas Petrolini - São Paulo/SP - Brasil, 2013. xx, 130f.

Tese (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia. Departamento de Medicina, Disciplina de Infectologia.

Tese (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação Ciências Básicas em Infectologia Título em Inglês: Temporal Frequency and Standardization of a Multiplex PCR for Detection of Oxacilinases in Pseudomonas aeruginosa Clinical Isolates. 1. β-lactamase, 2. Pseudomonas aeruginosa, 3. Oxacilinases.

(4)

iv

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA

Chefe do Departamento: Professora Drª Maria Tereza Zanella

Coordenador do curso de Pós-graduação: Professor Dr. Ricardo Sobhie Diaz

Chefe da Disciplina de Infectologia: Prof. Dr. Celso Francisco Hernandes Granato

São Paulo 2013

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v

Estudo da Frequência Temporal e Padronização de uma PCR Multiplex

para a Detecção de Oxacilinases em Isolados Clínicos de Pseudomonas

aeruginosa

BANCA EXAMINADORA:

Presidente:

Profa_{. Dr}a_{. Ana Cristina Gales}

Professora Adjunta e Diretora do Laboratório ALERTA da Disciplina de Infectologia do Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.

Titulares:

Prof. Dr. Afonso Luís Barth

Professor Associado do Departamento de Análises da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS.

Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari

Professor Titular da Disciplina de Infectologia do Departamento de Medicina e Diretor do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP.

Profa_{. Dr}a_{. Marinês Dalla Valle Martino}

Professor Adjunto da Disciplina de Microbiologia do Departamento de Ciências Patológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e Médica-coordenadora do Setor de Microbiologia do Laboratório Clínico da Sociedade Beneficente Israelita Brasileira Hospital Albert Einstein (SBIBHAE).

Suplente:

Prof. Drª. Antonia Maria de Oliveira Machado

Diretora Técnica do Laboratório de Microbiologia do Instituto Paulista de Doenças Infecciosas e Parasitárias e Diretora Técnica do Laboratório Central do Hospital São Paulo - Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP.

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vi

Dedico este trabalho aos meus pais, Fernando e CéliaFernando e CéliaFernando e CéliaFernando e Célia, por toda

dedicação, entusiasmo, auxílio, e amor incondicional. Eles que serão

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vii

As minhas irmãs, Ana Elise e MaríliaAna Elise e MaríliaAna Elise e MaríliaAna Elise e Marília, que sem perceberem,

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viii

Ao meu namorado, amigo e companheiro RodrigoRodrigoRodrigo, pelo apoio, Rodrigo

incentivo e compreensão pela minha ausência, que apesar de tudo

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ix

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por me compartilhar estes momentos inesquecíveis, traçando-me os traçando-melhores caminhos a seguir, a força que traçando-me proporcionou pela ausência da minha família, aos amigos, a saúde e a sabedoria.

Minha orientadora Profa_{. Dr}a_{. Ana Cristina Gales, inicialmente pela confiança, pela} amizade, pela dedicação e ensinamentos durante a realização desse trabalho e pelo convívio sempre estimulante junto ao grupo LEMC/ALERTA.

Ao professor Prof. Dr. Antônio Carlos Campos Pignatari, pela dedicação ao grupo LEMC/Alerta.

Agradeço aos professores Dr. Afonso Luís Barth, Dr. Antônio Carlos Campos Pignatari, Dra_{. Marinês Dalla Valle Martino e Drª. Antonia Maria de Oliveira Machado por} terem gentilmente aceitado participar de minha banca de defesa.

Ao meu pai Fernando Aparecido Petrolini e a minha mãe Célia Maria Villas Boas Petrolini, pelos primeiros ensinamentos, pela dedicação, atenção e carinho. Sempre compartilhando todos os momentos da minha vida, me apoiando, traçando-me os melhores caminhos a seguir. Amo vocês...

As minhas irmãs, Ana Elise e Marília, que apesar da minha ausência elas sempre estão comigo. Que a força da nossa amizade, vença todas as nossas diferenças.

(10)

x

Ao meu namorado Rodrigo Ribeiro dos Santos primeiramente pela nossa amizade, e agradecer os momentos de grande ternura em que sempre me estendeu a mão.

A toda minha família, em especial o Tio Jaime, a Tia Ana, a Camila, Tia Edith, Edson, Ernani, Tia Irani e todos que compartilharam minhas decisões e me apoiaram em todos os momentos, que me ajudaram nesta conquista de forma direta ou indireta.

Ao meu co-orientador Dr. Rodrigo Cayô da Silva, pelos seus ensinamentos, pelos momentos de descontração no laboratório e pelos momentos em que deixou de realizar seus experimentos para me auxiliar.

A minha grande amiga Eloiza Helena Campana, que sempre me auxiliou em minhas decisões, obrigado pelos momentos compartilhados, pelas nossas risadas, pelo carinho e atenção em que sempre me proporcionou. “Amiga é como vento: às vezes perto, às vezes longe, mas eterno em nossos corações.”

Aos amigos dos laboratórios ALERTA e LEMC por todo apoio, carinho, e também pelos alegres momentos de descontração, especialmente Adriana Nicoletti, Bruna Nonato, Cecília Carvalhaes, Dandara Corsi, Danilo Xavier, Jhonatha Moura, Lorena Fehlberg, Marina Visconde, Milene Quiles, Raquel Girardello com quem compartilho quase diariamente as experiências do mundo acadêmico.

Ao Prof. Dr. Carlos Henrique Gomes Martins pela iniciação científica, aprendizado e amizade. Conduzindo-me os caminhos da pesquisa.

(11)

xi

(12)

xii

Cada sonho que você deixa para trás é um pedaço do seu futuro que deixa de existir...

Steve Jobs Steve JobsSteve Jobs Steve Jobs

(13)

xiii SUMÁRIO

1. Introdução ... 1

2. Revisão Bibliográfica ... 5

2.1. Pseudomonas aeruginosa ... 6

2.2. Epidemiologia das Infecções Causadas por P. aeruginosa ... 7

2.3. Opções Terepêuticas ... 9

2.4. Mecanismos de Resistência aos β-lactâmicos em P. aeruginosa ... 9

2.4.1. Produção de β-lactamase ... 11

2.4.1.1. Cefalosporinases do Tipo AmpC ... 13

2.4.1.2. β-lactamases de Espectro Limitado ... 15

2.4.1.3. β-lactamases de Espectro Ampliado (ESβLs) ... 15

2.4.1.3.1. Oxacilinase do Tipo ESβL ... 19

2.4.1.4. Carbapenemases de Classe A ... 20

2.4.1.5. Metalo-β-lactamases (MβLs)... 22

2.4.2. Impermeabilidade de Membrana Externa ... 25

2.4.3. Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo ... 27

2.4.3.1. MexAB-OprM... 28 2.4.3.2. MexCD-OprJ... 28 2.4.3.3. MexEF-OprN... 29 2.4.3.4. MexXY-OprM... 30 2.4.3.5. MexJK...30 2.4.3.6. MexGHI-OpmD e MexVW... 31

(14)

xiv 3.Objetivos ... 34 3.1. Objetivo Principal ... 35 3.2. Objetivos Secundários ... 35 4.Apresentação ... 36 5.Artigo Científico ... 38 6.Discussão ... 72 7. Conclusão... 86 8.Referências Bibliográficas ... 89

(15)

xv

ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AIM - “Australian imipenemase metalo-β-lactamase” AmpC - cefalosporinases cromossomais

BHI - “Brain Heart Infusion”

CHDLs - Carbapenem- Hydrolyzing Class D β-Lactamase CIM - Concentração inibitória mínima

CLSI - “Clinical and Laboratory Standards Institute” CTX-M - cefotaximases

CXA-101 - Nova cefalosporinases anti-pseudomonas DDST - Sinergismo de disco duplo

DHP-1 - Dehidropeptidase-1

DIM - “Dutch Imipenemase metalo-β-lactamase”

ESAC -“ Extended-spectrum AmpC” ou AmpC de espectro extendido ESβL - β-lactamases de Espectro Ampliado

ES-OXA - Oxacilinases de espctro ampliado FIM - “Florence imipenemase metalo-β-lactamase” GES - “Guiana Extended Spectrum”

GIM - “German imipenemase metalo-β-lactamase” IMI - “Imipenem-hydrolyzing β-lactamase”

IMP - “imipenemase metalo-β-lactamase”

KHM - “Kyorin Health Science metalo-β-lactamase” KPC - “Klebsiella pneumoniae carbapenemase” MβLs - Metalo-β-lactamases

(16)

xvi NHSN - National Healthcare Safety Network NMC-A - “not metalloenzyme carbapenemase”

NNIS - National Nosocomial Infections Surveillance System OMP - “Outer Membrane Protein”

OXA - Oxacilinases

PBPs - Proteínas Ligadoras de Penicilinas PCR - Reação em Cadeia da Polimerase PME - Pseudomonas aeruginosa ESβL PFGE - “Pulsed-Field Gel Electrophoresis” RND - “multidrug efflux pump”

SHV - “sulphydryl variable”

SIM - “Seul imipenemase metalo-β-lactamase” SME - “Serratia marcescens enzyme”

SPM - “São Paulo metalo-β-lactamase” TEM - “Temoniera”

TMB - “Tripoli metalo-β-lactamase”

(17)

xvii

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Características funcionais e moleculares dos principais grupos de β-lactamases.______________________________________________________ 15 Tabela 2. Positive controls of different classes of oxacilinases used in the standardization

of PCR reactions used in this study.___________________________________ 60 Tabela 3. Primers and thermal cycling conditions for amplification and sequencing of

oxacilinases encoding genes described in P. aeruginosa evaluated in this study.___________________________________________________________ 61 Tabela 4. Different groups of oxacilinases described in P. aeruginosa based on ClustalW

dendrogram and their respective variants according with the spectrum of activity.__________________________________________________________ 63 Tabela 5. Antimicrobial susceptibility profile among the 41 OXA-producing P. aeruginosa

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xviii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Desenho esquemático, apresentando os principais mecanismos de resistência em P. aeruginosa. __________________________________ 13 Figura 2. Amplicons generated by multiplex PCR in a 2% agarose gel. M - molecular

weight (100 bp); line 1, negative control; line 2, OXA-18 group (806 bp); line 3, OXA-1 group (601 bp); line 4, OXA-2 group (504 bp); and line 5, OXA-10 group (237 bp)._________________________________________________ 66 Figure 3. Strain-tailored double-disk synergy test (DDST) for phenotypic detection of

acquired oxacilinases in P. aeruginosa clinical isolates.__________________ 67 Figura 4. Distribution of the 128 cefepime non-susceptible P. aeruginosa isolates

producers of acquired β-lactamases during the period of study (1997-2011)._________________________________________________________ 68 Figura 5. Temporal distribution of β-lactamases encoding genes among the cefepime

non-susceptible P. aeruginosa isolates according to year of isolation (1997-2011)._________________________________________________________ 69 Figura 6. Dendrogram of the 128 cefepime non-susceptible P. aeruginosa isolates

producers of acquired β-lactamases according to the PFGE patterns (A) and ERIC-PCR profiles only for blaCTX-M-2-producing isolates (B).______________ 70

(19)

xix RESUMO

Inicialmente um dendrograma foi realizado para a classificação das diferentes oxacilinases descritas em isolados de P. aeruginosa em grupos. Com base nisso, reações de PCR multiplex e/ou convencional foram padronizadas utilizando iniciadores específicos para a detecção e sequenciamento dos diferentes grupos de oxacilinases, diferenciando as oxacilinases de espectro restrito e ES-OXA descritas em P. aeruginosa. A partir dessa padronização, foi avaliada a presença desses genes em uma coleção de 231 isolados clínicos de P. aeruginosa não susceptíveis à cefepima no período de 1997-2011 provenientes do Hospital São Paulo - UNIFESP, localizado na cidade de São Paulo. A identificação bacteriana dos isolados clínicos de

P. aeruginosa foram identificados pela técnica de MALDI-TOF MS e confirmado pela presença

do gene cromossomal blaOXA-50 codificador de uma oxacilinase de espectro restrito. Os genes pesquisados nos isolados clínicos estudados foram as oxacilinases: blaOXA-1; blaOXA-2; blaOXA-5; blaOXA-10; blaOXA-18; blaOXA-20; blaOXA-45; blaOXA-46; blaOXA-50; blaOXA-198, as MBL’s blaIMP; blaVIM; blaSIM; blaGIM; blaSPM; blaGIM; as ESβL blaCTX-M; blaGES; blaTEM; blaSHV; e as carbapenemases blaKPC; blaGES-5. Genes codificadores de oxacilinases foram observados em 17,7% dos isolados avaliados, sendo o gene blaOXA-56 o mais frequentemente encontrado, seguido pelo gene blaOXA-2 (1,3%) e blaOXA-4 (0,90%). Além desses, outros genes codificadores de β-lactamase foram também encontrados:

blaCTX-M-2 (31,6%), blaSPM-1 (5,6%), blaSHV-5 (2,2%), blaGES-1 (1,7%) e blaTEM-1 (0,4%). Uma co-produção de OXA-2 com GES-1 e OXA-56 com GES-1 ou SPM-1 também foram observadas. Uma disseminação clonal foi observada entre os isolados produtores de OXA-2, OXA-4 e SHV-5. No entanto, uma heterogeneidade clonal foi observada entre os isolados produtores de OXA-56 e CTX-M-2, as β-lactamases mais frequentes nos períodos de 1997-2001 e 2004-2011, respectivamente. Uma grande diversidade de β-lactamases foi observada entre os isolados de P.

aeruginosa não susceptíveis à cefepima durante o período de 15 anos de estudo, e tais enzimas

estão relacionadas à resistência às cefalosporinas de amplo espectro em um hospital universitário e terciário brasileiro.

(20)

xx ABSTRACT

First a dendrogram was obtained to classify the different oxacilinases described in P. aeruginosa in groups. Based on that, a multiplex and a single PCR reactions was standardized using specific primers to detect and sequence all narrow and extended-spectrum oxacilinases. After that, it was evaluated the presence of oxacilinases encoding genes among a collection of 231 Cefepime Non-Susceptible Pseudomonas aeruginosa (CNS-PSA) isolates from 1997 to 2011 in Brazil. All isolates harbored the chromosomal encoded narrow-spectrum blaOXA-50 gene and were the identified as P. aeruginosa by MALDI-TOF MS. The frequency of oxacilinases among the CNS-PSA was 17.7%, been the most prevalent OXA gene was blaOXA-56 followed by blaOXA-2 (1.3%) and blaOXA-4 (0.90%). Besides those, other β-lactamase genes were also found: blaCTX-M-2 (31.6%), blaSPM-1 (5.6%), blaSHV-5 (2.2%), blaGES-1 (1.7%) and blaTEM-1 (0.4%). Co-production of OXA-2 with GES-1 and OXA-56 with GES-1 or SPM-1 were also detected. Clonal dissemination was observed among the isolates producing OXA-2, OXA-4 and SHV-5. However, clonal heterogeneity was observed among those isolates producing OXA-56 and CTX-M-2, the most frequent β-lactamases in the periods of 1997 to 2001 and of 2004 to 2011, respectively. A diversity of β-lactamases was observed among CNS-PSA conferring resistance to broad-spectrum cephalosporins in a Brazilian tertiary teaching hospital during a 15-year period.

(21)

DA

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Introdução

Página 2 A descoberta dos antimicrobianos e a sua utilização na prática clínica, ocasionou um progresso inquestionável na medicina no século XX. Apesar disso, o desenvolvimento de novos antimicrobianos não acompanha a velocidade com que as bactérias adquirem resistência a esses compostos e se disseminam pelos hospitais. A resistência bacteriana pode ser ocasionadas pela presença de mecanismos intrínsecos ou adquiridas e a associação desses mecanismos leva ao fenômeno da multirresistência limitando drasticamente as opções terapêuticas para o tratamento das infecções causadas por esses patógenos. Muitos antimicrobianos que antes eram capazes de combater às infecções bacterianas em pacientes hospitalizados não são mais eficazes devido à evolução da resistência bacteriana.

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista humano e que apresenta alta

capacidade de adaptação ao ambiente hospitalar, fruto de mínimas exigências nutricionais. Muitas vezes, as infecções causadas por esse patógeno são difíceis de serem tratadas devido à resistência natural dessa espécie, bem como a sua notável capacidade em adquirir novos mecanismos a vários grupos de antimicrobianos. Dados do “National Nosocomial Infections Surveillance System – NNIS" atualmente esse programa é chamado como National Healthcare Safety Network (NHSN), reportam esse patógeno como o terceiro agente mais frequentemente associado a infecções pulmonares ou do sítio cirúrgico, o quarto patógeno mais frequente em infecção do trato urinário e o quinto mais comum em hemoculturas de pacientes com sepse

(Richards et al., 2000). Dados publicados no Brasil, pelo programa de vigilância SENTRY, mostraram que P. aeruginosa foi o patógeno mais frequentemente isolado em pacientes com pneumonia hospitalar, o terceiro patógeno mais frequente em pele e tecidos moles e o quinto patógeno mais comum em infecções da corrente sanguínea nos hospitais avaliados pelo programa (Gales et al., 2012).

(23)

Introdução

Página 3 Os agentes β-lactâmicos têm sido utilizados amplamente no tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa, no entanto, a resistência a esses antimicrobianos nessa espécie tem aumentado drasticamente nas últimas duas décadas devido principalmente, à produção de β-lactamases. A crescente incidência dessas enzimas e o fato de estarem relacionadas às falhas terapêuticas elevam ainda mais o tempo de hospitalização, os custos e as taxas de mortalidade. Além disso, o crescente uso de cefalosporinas de amplo espectro para o tratamento de infecções hospitalares causadas por esse micro-organismo ocasionou o aumento da prevalência de P.

aeruginosa produtoras de β-lactamases de espectro ampliado, conhecidas como ESβLs (Picão

et al., 2009a).

A evolução das ESβLs do tipo oxacilinases (OXA) é semelhante à das enzimas TEM e SHV, as quais se originaram a partir de enzimas estruturalmente semelhantes, porém, de espectro mais restrito (Poirel et al., 2010a). A primeira ESβL do tipo OXA foi originalmente descrita em isolados de P. aeruginosa na Turquia (Poirel et al., 2010a) e, atualmente, existem relatos da ocorrência de amostras de P. aeruginosa produtoras de oxacilinases do tipo ESβLs em todos os continentes, evidenciando a grande disseminação desses determinantes de resistência (Poirel et al., 2010a).

Amostras de P. aeruginosa resistentes à cefepima, mas sensíveis à ceftazidima, são frequentemente isoladas pelos laboratórios de microbiologia clínicos brasileiros. Esse fenótipo de resistência pode ser consequente à hiperexpressão do sistema de efluxo MexXY-OprM ou à presença de ESβL do tipo CTX-M-like, ou ainda decorrente da presença de enzimas do tipo OXA

(Aubert et al., 2001; Picão et al., 2009a; Hocquet et al., 2006; Xavier et al., 2010). P. aeruginosa é a grande produtora das OXAs do tipo ESβL e, como já houve descrições de oxacilinases entre os membros da família Enterobacteriaceae no Brasil (Strateva & Yordanov 2009; Poirel et al., 2010a; Zavascki et al., 2010), levanta a hipótese de que a frequência dessas enzimas em

(24)

Introdução

Página 4 isolados brasileiros de P. aeruginosa poderia ser alta. Como a maioria dos genes codificadores de OXA do tipo ESβL encontra-se em plasmídeos, tranposons e/ou integrons, eles teriam a sua disseminação facilitada no ambiente hospitalar e contribuiríam para a possível elevada frequência de isolados de P. aeruginosa produtoras de ES-OXA (Poirel et al., 2010b).

Apesar de terem a sua atividade inibida pelo cloreto de sódio, a detecção das OXA do tipo ESβL em isolados de P. aeruginosa por métodos fenotípicos é mascarada pela presença concomitante de outros mecanismos de resistência. A alta prevalência de metalo-β-lactamases (MβL), especialmente a SPM-1 (Toleman et al., 2002), a produção induzível de AmpC cromossômica (Philippon et al., 2002), a alta prevalência da ESβL CTX-M-2 e a hiperexpressão de sistemas de efluxo (Hocquet et al., 2006), que já foram reportadas em amostras de P.

aeruginosa isoladas no Brasil (Picão et al., 2009a; Xavier et al., 2010; Fehlberg et al., 2012a), podem dificultar ainda mais a detecção dessas enzimas nos isolados brasileiros de P.

aeruginosa. Sendo assim, a presente tese objetivou a padronização de uma PCR multiplex para

a detecção de oxacilinases de espectro ampliado, bem como as demais oxacilinases já descritas em P. aeruginosa, além de avaliar a frequência dessas enzimas em isolados clínicos de P.

(25)

EA exä|áûÉ

(26)

Revisão Bibliográfica

Página 6 2.1. Pseudomonas aeruginosa

O gênero Pseudomonas teve sua classificação taxonômica descrita a mais de 100 anos e com o passar do tempo vem sofrendo revisões. Este gênero pertence à família

Pseudomonadaceae e, em 1992, foi subdividida em outros gêneros, como Burkholderia,

Stenotrophomonas, Comamonas, Shewanella, Ralstonia, Methylobacterium, Sphingomonas,

Acidovorax e Brevundimonas (Murray et al., 2010). O gênero Pseudomonas compreende duas mil espécies já descritas e sendo P. aeruginosa a espécie mais importante e estudada (Murray et

al., 2010).

P. aeruginosa são bacilos Gram negativos não fermentadores da glicose, ligeiramente

curvados, não esporulados, que medem aproximadamente 0,5 a 1 µm de largura por 1,5 a 5 µm de comprimento. Esta espécie usualmente é móvel, possuindo um ou vários flagelos polares, utiliza glicose e outros carboidratos oxidativamente e em geral são citocromo oxidase positivas

(Koneman et al., 2001; Blondel-Hill et al., 2007). A confirmação da identificação da espécie P.

aeruginosa pode ser realizada pela oxidação da glicose e da xilose, produção de oxidase,

produção de arginina, crescimento entre 37ºC à 42ºC em caldo “Brain Heart Infusion” (BHI), redução do nitrito em nitrato e inabilidade de utilizar a maltose em meio de amônia com sais e açúcares, bem como por não fermentar carboidratos (Murray et al., 2010).

Esse micro-organismo é metabolicamente versátil, capaz de crescer em meios de cultura pobres, compostos simplesmente de sais minerais, glicose e ágar. As colônias de P. aeruginosa podem ser identificadas rapidamente no meio de cultura devido à pigmentação e ao odor de frutas característico (Gillardi, 1980). As colônias podem apresentar morfologia variada, mas geralmente se apresentam como colônias planas e difusas. No exame direto não é facilmente distinguida de outros bacilos Gram negativos não fermentadores e baseado em suas

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Revisão Bibliográfica

Página 7 características bioquímicas, a P. aeruginosa também pode ser identificada por métodos automatizados (Pitt et al., 1997; Mandell et al., 2010; Murray et al., 2010).

P. aeruginosa produz no mínimo quatro pigmentos distintos: piocianina (azul), pioverdina

(amarelo-esverdiado), piorrubina (vermelho) e piomelanina (marrom escuro). A piocianina é um pigmento solúvel tanto em água quanto em clorofórmio, sendo encontrada em aproximadamente 80% dos isolados, e sua produção é estimulada pela presença de glicerol, magnésio, potássio e ferro. A pioverdina é solúvel em água, mas não em clorofórmio, sendo encontrada em outras espécies fluorescentes de Pseudomonas spp.. A piorrubina é solúvel em água e insolúvel em clorofórmio, e a piomelanina é quimicamente distinta da melanina animal. Esses dois pigmentos são raros, sendo produzidos por menos de 2% dos isolados clínicos (Visca et al., 1992).

2.2. Epidemiologia das Infecções Causadas por P. aeruginosa

O gênero Pseudomonas spp. é um bacilo Gram negativo que possui habilidade de utilizar uma imensa variedade de substratos orgânicos como fonte de carbono. A espécie P.

aeruginosa está presente em diversos nichos ecológicos, podendo ser isolada de solo, água,

plantas e animais. Sendo assim, esse micro-organismo pode ser patogênico tanto para as plantas como para os animais (Pollack, 2000).

Este gênero possui necessidades mínimas nutritivas e possui alta tolerância a uma ampla variedade de temperaturas (4ºC a 42ºC) e condições físicas, e também apresenta resistência intrínseca a muitos antimicrobianos e desinfetantes, fatores esses que contribuíram para o sucesso ecológico e para o importante papel da P. aeruginosa como um patógeno oportunista (Pollack, 2000; Mandell et al., 2010). No ambiente hospitalar pode ser isolado de diversas fontes, principalmente de locais úmidos, como nos banheiros, nas pias, nos equipamentos de ventilação mecânica e de diálise. Embora raramente cause infecções em

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Revisão Bibliográfica

Página 8 indivíduos sadios, frequentemente causa infecção em pacientes hospitalizados e/ou imunocomprometidos, assumindo um importante papel como agente etiológico das infecções hospitalares (Mandell et al., 2010; Murray et al., 2010).

Isolados de P. aeruginosa podem colonizar transitoriamente o trato respiratório e gastrointestinal de pacientes hospitalizados, principalmente aqueles submetidos à ventilação mecânica ou hospitalizados por longos períodos. Desta maneira, somente o isolamento desse micro-organismo em pacientes hospitalizados não justifica a introdução de terapia antimicrobiana

(Murray et al., 2010). A gravidade das infecções por P. aeruginosa podem variar. Muitos casos, são relacionadas ao uso de dispositivos invasivos como pneumonia secundária à ventilação mecânica (Medell et al., 2013), bacteremia associada ao uso de cateter vascular (Almirante et

al., 2012), infecção urinária relacionada ao uso de sonda vesical (Ortega et al., 2013). Além disso, esse micro-organismo é capaz de causar infecção de sítio cirúrgico (Mackenzie et al., 2013), endocardite (Sousa et al., 2012), abscesso pulmonar (Alkhatib et al., 2012) e meningite

(Chang et al., 2010). Alguns fatores de risco para a aquisição de infecções por P. aeruginosa são: idade avançada, diabetes mellitus, hospitalização prolongada e uso prévio de antimicrobianos (Carmeli et al., 1999; Pollack, 2000). Além disso, P. aeruginosa é um importante patógeno em pacientes com fibrose cística, onde sua prevalência é elevada (Psoter et al., 2013)

e leva a um quadro de deterioração das funções pulmonares e ao comprometimento clínico observado nestes pacientes. Esses micro-organismos quando isolados de pulmões de pacientes com fibrose cística são totalmente distintos dos isolados clínicos de pacientes com infecções agudas, pelo mesmo patógeno. Esses patógenos apresentam um fenótipo mucóide, podendo estar relacionado pela resistência aos antimicrobianos e pela formação de biofilme (Gibson et al., 2003).

(29)

Revisão Bibliográfica

Página 9 Enquanto alguns estudos sugerem que P. aeruginosa seja transmitida de paciente para paciente (Hilf et al., 1989; Siegman-Igra et al., 1998), outros estudos sugerem que esse micro-organismo seja predominantemente adquirido a partir do meio ambiente (Paterson, 2002; Kang

et al., 2003; Masoud-Landgraf et al., 2012). Apesar dessa discordância quanto a real fonte de aquisição, P. aeruginosa é um dos mais prevalentes agentes causadores de infecções hospitalares em todo o mundo (Strateva & Yordanov 2009).

2.3. Opções Terapêuticas

As opções terapêuticas para o tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa incluem os aminoglicosídeos tais quais a gentamicina, a tobramicina e a amicacina e as fluoroquinolonas tais quais a ciprofloxacina, a levofloxacina, a moxifloxacina. Entre os antimicrobianos da classe dos β-lactâmicos, apresentam atividade contra P. aeruginosa e podem ser utilizados clinicamente: as penicilinas ticarcilina e piperacilina, incluindo suas respectivas associações com inibidores de β-lactamase, como o ácido clavulânico e o tazobactam; as cefalosporinas de amplo espectro como a ceftazidima, a cefepima e a cefoperazona; o monobactam aztreonam; e os carbapenens imipenem, meropenem e doripenem (Pappas et al., 2009). Quando os isolados de P. aeruginosa apresentam resistência aos carbapenens, o antimicrobianos de escolha, devido à co-resistência com outras agentes, são as polimixinas B e E, também chamada de colistina (Zavascki et al., 2010).

2.4. Mecanismos de Resistência aos β-lactâmicos em P. aeruginosa

P. aeruginosa é um dos principais micro-organismos patogênicos entre as bactérias

Gram negativas. Além da resistência intrínseca apresentada a muitos agentes antimicrobianos não relacionados estruturalmente, como a penicilina G, as aminopenicilinas e as cefalosporinas

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Revisão Bibliográfica

Página 10 de primeira e segunda geração (Mesaros et al., 2007), essa espécie apresenta uma notável capacidade de aquisição de outros mecanismos de resistência. Frequentemente esses mecanismos existem simultaneamente, o que confere resistência combinada a vários antimicrobianos (McGowan, 2006),como mostrado na Figura 1.

Figura 1. Desenho esquemático, apresentando os principais mecanismos de resistência em P.

aeruginosa. Figura modificada e obtida no site

(http://www.cyd.conacyt.gob.mx/193/Articulos/Endotoxinas/Imagenes/Img_membrana.jpg

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Página 11 2.4.1 - Produção de β-lactamases

A produção de β-lactamases é o principal mecanismo de resistência aos β-lactâmicos em bactérias Gram negativas, apresentando uma diversidade tanto estrutural como de espectro de atividade. Essas enzimas se concentram no espaço periplasmático, inativando os β-lactâmicos antes que eles atinjam as proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs) localizadas na membrana citoplasmática (Bush et al., 1995; Livermore & Woodford, 2006).

Diferentes tipos de β-lactamases já foram descritas e inúmeras tentativas de estabelecer um sistema de classificação para essas enzimas foram propostas ao longo dos anos. Duas classificações são consideradas as mais importantes: as classificações de Ambler e a de Bush, Jacoby e Medeiros (Ambler, 1980; Bush et al., 1995). A última classificação foi revista em 2010

(Bush & Jacoby, 2010). A Tabela 1 apresenta de modo simplificado a correlação entre a classificação molecular de Ambler (Ambler, 1980) e a de Bush e Jacoby (Bush & Jacoby, 2010).

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Página 12 Classificação de BUSH-JACOBY, 2010 Classificação de AMBLER, 1980 Características funcionais

Grupo Funcional Subgrupos Classe Molecular

1 C

Enzimas cromossômicas e plasmidiais encontradas em bactérias Gram negativas. Isoladamente, conferem resistência a todos os β-lactâmicos, exceto aos carbapenens. Não são inibidas pelo ácido clavulânico.

1e C Hidrólise aumentada à ceftazidima e não inibidas pelo ácido clavulânico. 2 A, D Grande maioria das enzimas é inibida pelo ácido clavulânico.

2ª A Penicilinases produzidas por Staphylococcus spp. e Enterococcus spp. Conferem alto grau de resistência às penicilinas.

2b A β-lactamases de espectro limitado de bactérias Gram negativas. Inclui TEM-1, TEM-2 e SHV-1.

2be A β-lactamases de espectro ampliado, conferindo resistência às cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos.

2br A β-lactamases derivadas de TEM resistentes aos inibidores de β-lactamases (IRT). 2ber A Enzimas não inibidas pelo ácido clavulânico, tazobactam e sulbactam.

2c A Enzimas que hidrolisam a carbenicilina com maior eficiência. 2ce A Hidrólise aumentada de carbenicilina, cefepima e cefpiroma.

2d D Enzimas que hidrolisam a cloxacilina (oxacilina); fracamente inibidas pelo ácido clavulânico.

2de D Enzimas que hidrolisam a cloxacilina (oxacilina) e oxinimo-β-lactâmicos.

2df D Enzimas que hidrolisam a cloxacilina (oxacilina) e carbapenens. 2e A Cefalosporinases inibidas pelo ácido clavulânico.

2f A Enzimas que hidrolisam carbapenens com sítio ativo serina, inibidas pelo ácido clavulânico.

3 3a, 3b, 3c B

Metalo-β-lactamases que conferem resistência aos carbapenens e todos os outros β-lactâmicos, com exceção dos monobactâmicos. Não são inibidas pelo ácido clavulânico.

4 EXC Enzimas não sequenciadas e, portanto, não são classificadas nos outros grupos .

Tabela 1 – Características funcionais e moleculares dos principais grupos de β-lactamases.

Abreviatura: EXC classe excluída da classificação mais atual (Adaptado de Bush & Jacoby, 2010). Em negrito encontra-se o grupo 2de, onde estão incluídas as OXAs do tipo ESβL.

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Página 13 A resistência mediada pelas β-lactamases, cujo o sítio ativo é serino-dependente é resultante da quebra da ligação amida no anel β-lactâmico. Primeiramente, a enzima associa-se de forma não covalente ao anel β-lactâmico e, então, o radical hidroxila livre do resíduo serina, presente no sítio ativo da enzima, ataca o anel β-lactâmico, formando uma ligação covalente de acil-éster. A hidrólise do éster formado libera a enzima, que ainda possui atividade hidrolítica e o antimicrobiano hidrolisado torna-se inativo (Livermore, 1995). Nas MβLs, o zinco presente no sítio ativo da enzima se associa a uma molécula de água e interage com o oxigênio do grupamento carboxila do anel β-lactâmico (Crowder et al., 2006, Tamilselvi & Mugesh, 2008).

2.4.1.1. Cefalosporinases do Tipo AmpC

As β-lactamases do grupo funcional 1 ou da classe molecular C (Tabela 1), também chamadas cefalosporinases cromossomais ou AmpC, são enzimas cromossômicas ou plasmidiais podendo ser induzíveis ou não (Bush et al., 1995; Jacoby, 2009; Philippon et al., 2002). Essas enzimas já foram descritas em diversos micro-organimos, principalmente naqueles pertencentes ao grupo CESP, sendo eles: Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia

marcescens, Providencia stuartii, P. aeruginosa e Morganella morganii, nos quais essas AmpC

são induzíveis, enquanto que nas espécies bacterianas E. coli e A. baumannii, não apresenta indução da enzima da AmpC (Jacoby, 2009; Strateva & Yordanov, 2009). Nos isolados clínicos de A. baumannii, não ocorre a indução da expressão da enzima AmpC porque nesta espécie o gene ampR está ausente (Bou & Martínez-Beltrán, 2000).

Nas bactérias que possuem a AmpC induzível, a enzima é controlada pela atividade de três proteínas: AmpG, AmpD e AmpR (Lodgee & Piddock, 1991; Jacobs et al., 1997; Jacoby, 2009). Na ausência de β-lactâmicos, a cefalosporinase é normalmente produzida em baixos níveis, mas na presença de β-lactâmicos indutores, como o imipenem e a cefoxitina, passam a

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Página 14 ser produzidas em grande quantidade (Ni et al., 2005; Jacoby, 2009). Essas enzimas hidrolisam as penicilinas e as cefamicinas com grande eficácia, e em baixa eficácia o aztreonam e as cefalosporinas de terceira geração, mas hidrolisam fracamente as cefalosporinas de quarta geração e os carbapenens (Ni et al., 2005; Jacoby, 2009). Entretanto, mutações nos genes

ampR e ampD podem causar a hiperprodução constitutiva de AmpC, ou seja, mesmo após a

retirada do agente indutor, a produção da β-lactamase não diminui (Normark, 1995). Esse fenótipo é conhecido como desreprimido e pode levar à resistência às cefalosporinas de quarta geração (Jacobs et al., 1997; Schmidtke & Hanson, 2006; Jacoby, 2009).

A resistência ou sensibilidade intermediária ao imipenem em isolados clínicos de P.

aeruginosa, está associado com a modificação da porina OprD, a produção de MβLs,

hiperexpressão de sistemas de efluxo e ao aumento da produção das cefalosporinases do tipo AmpC associada à diminuição da permeabilidade de membrana externa. Sendo assim, no estudo de Gutiérrez e colaboradores (2007) avaliando isolados clínicos de P. aeruginosa resistentes aos carbapenens, relataram a resistência ao imipenem, à inativação da OprD associada ou não com a hiperprodução de AmpC ou à hiperexpressão do sistema de efluxo MexAB-OprM. Já no estudo de Rodriguez-Martinez e colaboradores (2009), foi relatado a descrição de AmpCs de espectro ampliado, também chamadas de ESAC, do inglês “Extended-Spectrum AmpC”. Os genes codificadores de tais enzimas, apresentavam mutação no gene

blaAmpC, ocasionando substituição de aminoácido específico (T105A) no sítio ativo da enzima, resultando na ampliação do espectro hidrolítico da enzima, sendo, portanto, capazes de hidrolisar o imipenem.

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Página 15 2.4.1.2. β-lactamases de Espectro Limitado

As enzimas classificadas nos grupos 2b e 2c (Tabela 1) incluem as β-lactamases de espectro limitado e que são inibidas pelos inibidores de serino-β-lactamases. Essas enzimas apresentam potente atividade contra as penicilinas e as cefalosporinas de primeira e segunda geração. Essas β-lactamases, principalmente as do grupo 2c, hidrolisam carbenicilina com igual eficiência que hidrolisam a benzilpenicilina. Entre as enzimas pertencentes ao subgrupo 2b, TEM-1, TEM-2, TEM-90, TEM-110 e SHV-1 já foram identificadas em isolados clínicos de P.

aeruginosa, enquanto que, entre as β-lactamases pertencentes ao grupo 2c, as variantes PSE-1,

PSE-4, CARB-3, CARB-4 e AER-1 também já foram descritas nessa espécie (Strateva & Yordanov 2009; Zavascki et al., 2010).

2.4.1.3. β-lactamases de Espectro Ampliado (ESβLs)

As ESβLs foram descritas inicialmente em Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli e, posteriormente, se disseminaram para as demais espécies de enterobactérias, sendo também descritas em P. aeruginosa (Picão et al., 2009a). Estão incluídas nesse grupo enzimas da classe A (subclasse 2be) e da classe D de Ambler (subclasse 2de) (Tabela 1), que apresentam atividade hidrolítica contra as penicilinas, as cefalosporinas e o aztreonam. A maioria dessas enzimas é sensível à ação dos inibidores de serino-β-lactamase (Paterson & Bonomo, 2005). No início da década de 90, a produção de enzimas do tipo ESβL passou a ser observada também entre isolados clínicos de P. aeruginosa (Weldhagen et al., 2003) e, atualmente, já foram descritas os seguintes grupos de ESβL de classe A em P. aeruginosa: TEM, SHV, PER, VEB, GES, BEL e CTX-M (Strateva & Yordanov, 2009).

A ESβL do tipo TEM foi descrita e reportada pela primeira vez em um isolado clínico de

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Página 16 nome da paciente na qual foi inicialmente isolada, Temoniera (Paterson & Bonomo, 2005).

Dentre as 204 enzimas descritas (http://www.lahey.org/studies acessado em 04 de junho de 2013), até a realização desse trabalho, apenas cinco dessas enzimas tenham sido descritas em

P. aeruginosa, sendo elas: TEM-4, TEM-21, TEM-24, TEM-42 e TEM-116 (Mugnier et al., 1996;

Poirel et al., 1999; Marchandin et al., 2000; Dubois et al., 2005; David et al., 2008). Essas enzimas são codificadas por genes localizados, usualmente, em elementos genéticos móveis, migrando para diferentes plasmídeos entre micro-organismos da mesma espécie ou entre espécies diferentes (Paterson & Bonomo, 2005).

As ESβLs do tipo SHV recebem esta denominação de acordo com uma propriedade bioquímica da enzima variável sulfidrila (“sulphydryl variable”). Variantes deste tipo de ESβLs foram pouco reportadas em P. aeruginosa (Naas et al., 1999b; Poirel et al., 2004a; Neonakis et

al., 2003; Mansour et al., 2009). As variantes de SHV do tipo ESBL, SHV-2, SHV-5 e SHV-12, são distribuídas mundialmente. A variante SHV-2 foi originalmente detectada na França (Naas et

al., 1999b) e, posteriormente, na Tailândia, na Polônia e na Tunísia (Chanawong et al., 2001; Mansour et al., 2009). A SHV-5 foi descrita na Grécia e Tailândia (Chanawong et al., 2001; Neonakis et al., 2003; Poirel et al., 2004a), enquanto a SHV-12 foi identificada, na Tailândia e no Japão (Chanawong et al., 2001; Uemura et al., 2010). O fenótipo ESβL é caracterizado a partir de substituições de sequências proteicas que ocorrem no gene blaSHV-1 ampliando a capacidade hidrolítica das variantes (Paterson & Bonomo, 2005).

A β-lactamase PER-1 foi relatada pela primeira vez em 1993, sendo a sua primeira descrição a partir de um isolado de P. aeruginosa proveniente da Turquia (Nordmann & Naas 1994). Desde então, essa enzima foi descrita em isolados de P. aeruginosa de diversos países

(Claeys et al., 2000; Docquier et al., 2001; Luzzaro et al., 2001; Pagani et al., 2004; Llanes et al., 2006; Tato et al., 2006; Yamano et al., 2006; Empel et al., 2007; Erac et al., 2007; Szabo et al.,

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Página 17

2008). A variante PER-2 foi descrita a partir de um isolado de Salmonella Typhimurium proveniente da Argentina (Bauernfeind et al., 1996). Posteriormente, essa enzima foi identificada em isolados da família Enterobactereaceae, Acinetobacter spp. e P. aeruginosa de diferentes países latino-americanos e incluindo o Brasil (Vignoli et al., 2005; Celenza et al.,2006; Pasterán

et al., 2006).

A β-lactamase VEB-1 foi relatada pela primeira vez em um isolado de E. coli na França

(Naas et al., 1999b). Em 2007, houve uma grande disseminação dessa enzima entre isolados de

P. aeruginosa que apresentavam resistência à ceftazidima na Bulgária (Strateva et al., 2007) e, posteriormente, essa enzima foi identificada na Tailândia, Kuwait, Índia, Reino Unido e Irã (Poirel

et al., 2001a; Girlich et al., 2002; Aubert et al., 2004; Woodford et al., 2008; Mirsalehian et al.,

2010). Em 2005, uma nova variante, VEB-3, foi identificada em isolados de P. aeruginosa na China (Jiang et al., 2005).

Atualmente foram descritas vinte e duas enzimas pertencentes ao grupo GES (“Guiana Extended Spectrum”) até a realização desse trabalho (http://www.lahey.org/studies acessado em 04 de junho de 2013), e seu primeiro relato foi em um isolado de K. pneumoniae de um paciente que havia sido transferido de um hospital da Guiana Francesa para a França, em 1998 (Poirel et

al., 2000a). A partir do seu primeiro relato, diversas variantes de GES foram identificadas, tanto em isolados clínicos de enterobactérias, como também em P. aeruginosa e em Acinetobacter spp.. No Brasil, já foram relatadas GES-1 e GES-5 em P. aeruginosa e em Klebsiella ozaenae, GES-7 em K. pneumoniae (Castanheira et al., 2004a;Pellegrino et al., 2006; da Fonseca et al., 2007; Dropa et al., 2010; Picão et al., 2010) e GES-16 em Serratia marcescens (Barbosa et al., 2010). As β-lactamases do tipo GES foram inicialmente classificadas como ESβL por possuírem amplo espectro de ação, que incluíam penicilinas e cefalosporinas de amplo espectro, e por apresentarem atividade carbapenemase praticamente nula (Giakkoupi et al., 2000). Porém,

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Página 18 houve o surgimento de variantes deste grupo que apresentavam atividade frente aos carbapenens como a GES-2 em P. aeruginosa na África do Sul, a GES-5 no Brasil, a GES-13 na Grécia e a GES-18 na Alemanha (Picão et al., 2009c; Poirel et al., 2001c; Kotsakis et al., 2010; Bebrone et al., 2013).

A β-lactamase BEL-1 foi identificada em um isolado clínico de P. aeruginosa, procedente da Bélgica, em 2004. Este gene encontra-se inserido em um cassete cromossômico de um integron de classe 1, o In120, e parece estar restrito à Bélgica (Bradford, 2001). As β-lactamases BEL-1 e BEL-2, descrita em 2007 em um isolado de P. aeruginosa, só diferem pela substituição de um único aminoácido na posição 162 (Poirel et al., 2010c).

As ESβLs do tipo CTX-M ou cefotaximases, designadas assim por apresentarrem a cefotaxima como substrato preferencial, apresentam pouca similaridade com as β-lactamases do tipo TEM e SHV (Paterson & Bonomo, 2005), e seu primeiro relato ocorreu em um isolado clínico de E. coli recuperado na Alemanha (Bauernfeind et al., 1990) e, posteriormente, essas enzimas se disseminaram por todos os continentes (Yan et al., 2006). Essas β-lactamases são codificadas por genes localizados em plasmídeos, e acredita-se que essas ESβLs se originaram a partir da enzima cromossômica AmpC de Kluyvera ascorbata, devido ao seu alto grau de similaridade (Bonnet, 2004). Em 2006, as enzimas CTX-M-1 e CTX-M-43 foram identificadas em isolados clínicos de P. aeruginosa provenientes da Holanda e da Bolívia, respectivamente (al Naiemi et al., 2006; Celenza et al., 2006). A variante CTX-M-2 foi descrita em isolados de P.

aeruginosa procedentes de São Paulo e de Porto Alegre (Picão et al., 2009a; Picão et al.,

2009b).

As ESβLs do tipo OXA hidrolisam muito bem a oxacilina e a cloxacilina, fato este que deu origem ao nome do grupo, e não apresenta similaridade genética com as demais ESβLs e

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Página 19 são mais frequentemente descritas em P. aeruginosa (Poirel et al., 2010a). Essas enzimas serão abordadas com mais detalhes no item 2.4.1.3.1.

2.4.1.3.1. Oxacilinase do Tipo ESβL

As β-Lactamases de classe D ou oxacilinases (OXA) receberam esta designação por apresentarem atividade hidrolítica potente contra a oxacilina, a cloxacilina e a meticilina, ou seja, contra penicilinas resistentes às penicilinases. As oxacilinases são classificadas em três subgrupos diferentes de Bush (Bush & Jacoby, 2010), sendo eles: (i) 2d - oxacilinases de espectro restrito, presente em enterobactérias (ii) 2de – ES-OXA por hidrolisarem a oxacilina e os oximino-lactâmicos e (iii) 2df - conhecidas como “Carbapenem- Hydrolyzing Class D β-Lactamase” (CHDLs) (Bush & Jacoby, 2010; Poirel et al., 2010a). Embora alguns genes codificadores de enzimas do tipo OXA estejam localizados em integrons, outros podem ocorrer naturalmente no genoma de certas bactérias Gram negativas (Poirel et al., 2010a). Atualmente, já foram descritas 356 oxacilinases (http://www.lahey.org/studies acessado em 04 de junho de 2013), sendo que enfatizaremos as oxacilinases das subclasses 2d e 2de. As CHDLs, pertencentes ao subgrupo 2df foram quase que exclusivamente descritas em isolados de a A.

baumannii, e até o momento, somente a variante OXA-24/40 foi descrita em dois isolados

clínicos de P. aeruginosa na Espanha (Sevillano et al., 2009).

A evolução das oxacilinases do tipo ESβL a partir de enzimas estruturalmente semelhantes; porém, de espectro mais limitado, não se assemelha à evolução observada pelas enzimas do tipo TEM e SHV. As oxacilinases podem ser divididas em quatro subgrupos: OXA-1, OXA-2, OXA-10 e outros (Poirel et al., 2010a). No primeiro subgrupo, além da 1 e da 30 (cujas sequências de aminoácidos são idênticas), estão incluídas as enzimas 4, OXA-31, OXA-47 e OXA-224. Estas oxacilinases ocorrem com frequência entre amostras de

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Página 20 enterobactérias, embora tenham sido também identificadas em P. aeruginosa. Enquanto a OXA-47 apresenta espectro hidrolítico limitado, a OXA-31 é capaz de hidrolisar cefalosporinas de quarta geração e, portanto, é considerada uma ES-OXA. Posteriormente à caracterização inicial de OXA-1, pesquisadores evidenciaram que, assim como a OXA-31, esta enzima apresentava atividade hidrolítica contra cefepima (Aubert et al., 2001).

Pertencentes ao subgrupo 2, as enzimas 2, 3, 15, 32, 34, 36, OXA141, 161, 210 já foram identificadas em P. aeruginosa, sendo OXA-2, OXA-3 e OXA-21 oxacilinases de espectro limitado. As enzimas OXA-15, OXA-3OXA-2, OXA-34, OXA-36, OXA-141, OXA-161 e a OXA-210, por sua vez, apresentam poucas substituições na sequência de aminoácidos comparado à OXA-2, mas que levam à ampliação de seu espectro hidrolítico contra ceftazidima, sendo, portanto, consideradas ES-OXA (Danel et al., 1997; Poirel

et al., 2002a; Juan et al., 2009).

O grupo OXA-10 constitui as β-lactamases do tipo OXA mais prevalentes entre isolados clínicos de P. aeruginosa. As enzimas pertencentes ao subgrupo 10 incluem 7, OXA-10, OXA-11, OXA-13, OXA-16, OXA-14, OXA-16, OXA-17, OXA-19, OXA-28, OXA-35, OXA-56, OXA-74, OXA-142, OXA-145, OXA-147, OXA-183 e OXA-240, das quais somente a OXA-7, a OXA-10 e a OXA-56 apresentam espectro hidrolítico limitado (Poirel et al., 2001b; Poirel et al., 2010a).

Dentre as oxacilinases de espectro limitado que não são relacionadas às enzimas OXA-1, OXA-2 e OXA-10, as variantes OXA-5 e OXA-20 foram identificadas em isolados de P.

aeruginosa de diferentes regiões geográficas (Couture et al., 1992; Naas et al.,1998). Outras ES-OXA e que não pertencem a nenhum dos três grupos citados anteriormente foram também descritas em isolados de P. aeruginosa, sendo essas as variantes OXA-18, OXA-45 e OXA-46

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Página 21 Além das oxacilinases adquiridas do tipo ESβL e de espectro limitado, temos a OXA-50, descrita como uma oxacilinase cromossômica e intrínseca em P. aeruginosa, pertencente ao subgrupo 2df, apresentando um perfil de resistência a amoxicilina e a ticarcilina (Girlich et al., 2004). Entretanto, aOXA-198 descrita em um isolado de P. aeruginosa, é uma carbapenemase também pertencente ao subgrupo 2df e que apresenta resistência à maioria dos β-lactâmicos, incluindo o imipenem, mas apresentou uma sensibilidade intermediária ao meropenem. Contudo, o isolado manteve-se sensível à ceftazidima e ao aztreonam (El Garch et al., 2011).

2.4.1.4. Carbapenemases de Classe A

As serino-carbapenemases ou carbapenemases de classe A pertencem ao grupo 2f de Bush (Bush & Jacoby, 2010) e a classe molecular A de Ambler (Ambler, 1980). A primeira descrição de uma serino-carbapenemase foi à enzima SME-1 - “Serratia marcescens enzyme” que foi identificada, em 1982, em um isolado clínico de S. marcescens recuperado em Londres

(Bush et al., 1995; Poirel et al., 2007; Queenan & Bush 2007). As enzimas IMI-1 - “imipenem-hydrolyzing β-lactamase” e NMC-A - “not metalloenzyme carbapenemase” foram descritas, até o momento, unicamente em isolados clínicos de Enterobacter cloacae. Não existem relatos de bactérias produtoras destas enzimas no Brasil. Isolados produtores de SME, IMI ou NMC apresentam sensibilidade diminuída ou resistência às penicilinas, às cefalosporinas de primeira e segunda geração, ao aztreonam e ao imipenem, mantendo a sensibilidade às cefalosporinas de amplo espectro. Além disso, essas enzimas são inibidas pelos inibidores de serino-β-lactamases, como o ácido clavulânico e o tazobactam (Queenan & Bush, 2007). Os genes que codificam as enzimas SME, IMI e NMC estão localizados no cromossomo bacteriano, o que contribui para sua distribuição restrita a determinados micro-organismos em regiões geográficas específicas.

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Página 22 Dentre todas as carbapenemases de classe A descritas, as mais importantes e disseminadas são as enzimas do tipo KPC. Essas β-lactamases têm sido descritas com maior frequência tanto em isolados clínicos de enterobactérias, como em P. aeruginosa e também em

Acinetobacter spp. (Queenan & Bush, 2007; Robledo et al., 2010). A enzima KPC-1 - “Klebsiella

pneumoniae carbapenemase” foi descrita em 2001, na Carolina do Norte (EUA). Posteriormente,

foi verificado que as enzimas KPC-1 e KPC-2 eram idênticas. Atualmente, são identificadas treze variantes descritas (http://www.lahey.org/studies acessado em 04 de junho de 2013). São normalmente codificadas por genes localizados em plasmídeos e hidrolisam todos os agentes β-lactâmicos, incluindo penicilinas, cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenens (Queenan & Bush, 2007). Estas enzimas são inibidas pelos inbidores das serino-β-lactamase, como o ácido clavulânico, tazobactam e sulbactam. Elas também são inibidas pelo ácido borônico e seus derivados.

O primeiro relato da enzima KPC-2 foi detectado em isolados clínicos de K. pneumoniae em 2005, em São Paulo (Pavez et al., 2009). Posteriormente, ocorreu a produção dessa enzima procedentes do Rio de Janeiro, Recife, Paraíba (Fehlberg et al., 2012b; Monteiro et al., 2009; Peirano et al., 2009) e, em isolados clínicos de E. cloacae em Porto Alegre (Zavascki et al., 2009). Entretanto, o primeiro relato de KPC-2 em P. aeruginosa foi na Colômbia em 2007, seguido por relatos em Porto Rico, Trindade e Tobago e nos Estados Unidos (Akpaka et al., 2009; Poirel et al., 2010d; Robledo et al., 2011). Enquanto que no Brasil, o primeiro relato de KPC-2 em isolados clínicos de P. aeruginosa ocorreu em Recife (Jácome et al., 2012).

2.4.1.5. Metalo-β-lactamases (MβLs)

As MβLs classificadas no grupo funcional 3 e classe molecular B se diferem das outras carbapenemases em três principais aspectos: (i) requerem íons Zn+2 _{ou outros cátions divalentes}

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Página 23 como cofator no sítio ativo; (ii) são resistentes à ação dos inibidores das serino β-lactamases, embora sofram inibição por agentes quelantes como o EDTA, derivados do tiol e ácido dipicolínico; e (iii) não hidrolisam o monobactâmico aztreonam (Walsh et al., 2005). As MβLs são notáveis por seu amplo espectro de atividade, podendo degradar quase todas as classes de β-lactâmicos, e também por não serem inibidas por inibidores de serino-β-lactamases disponíveis comercialmente, tais como o ácido clavulânico, o sulbactam e o tazobactam (Payne et al., 1997a; Payne et al., 1997b; Laraki et al., 1999; Bebrone, 2007).

As MβLs são representadas em dois grupos distintos, as MβLs intrínsecas, ou seja, àquelas presentes no cromossomo bacteriano, e as adquiridas ou movéis, que incluem aquelas localizadas em estruturas genéticas móveis (Chen et al., 2003; Walsh et al., 1994). As MβLs intrínsecas são mais frequentemente documentados em bactérias do meio ambiente, como:

Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Bacteroides fragilis, Legionella gormannii, Myroides

odoratum e Stenotrophomonas maltophilia (Hirakata et al., 1998; Normand & Poirel, 2002), enquanto que as MβLs adquiridas foram reportadas mais frequentemente em P. aeruginosa e enterobactérias, mas podem ser codificadas por qualquer bacilo Gram negativo (Chen et al., 2003; Walsh et al., 1994; Walsh et al., 2005).

Desde o início da década de 90, novos genes que codificam MβLs têm sido descritos em patógenos clinicamente importantes, tais como: Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e membros da família Enterobacteriaceae (Poirel et al., 2000b; Riccio et al., 2000; Yan et al., 2001). Estes genes estão inseridos, quase sempre, em estruturas genéticas móveis. Atualmente, são conhecidas as seguintes subclasses de MβLs adquiridas: IMP - “imipenemase lactamase”, VIM - “Verona imipenemase lactamase”, SPM - “São Paulo β-lactamase”, GIM - “German imipenemase β-β-lactamase”, SIM - “Seul imipenemase metalo-β-lactamase”, KHM-1 - “Kyorin Health Science metalo-metalo-β-lactamase”, AIM - “Australian

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Página 24 imipenemase metalo-β-lactamase”, NDM - “New Delhi metallo-beta-lactamase 1”, DIM-1 - “Dutch Imipenemase metalo-β-lactamase”, TMB-1 - “Tripoli metalo-β-lactamase” e, mais recentemente a FIM-1 - “Florence imipenemase metalo-β-lactamase” (Osano et al., 1994; Lauretti et al., 1999; Toleman et al., 2002; Castanheira et al., 2004b; Lee et al., 2005; Yong et al., 2007; Sekiguchi et

al., 2008; Poirel et al., 2010a; El Salabi et al., 2009; Yong et al., 2009; Pollini et al., 2013). A primeira MβL adquirida (IMP-1) foi caracterizada em um isolado de S. marsecens no Japão. A partir de então, a produção de enzimas do tipo IMP foi observada em Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e em diversas espécies de enterobactérias. Até a realização deste trabalho, 44 variantes de IMP haviam sido identificadas (Walsh et al., 2005; Walsh, 2008), sendo que as variantes IMP-1, IMP-16 e IMP-18 já foram descritas em isolados brasileiros de P.

aeruginosa (Mendes et al., 2004a; Mendes et al., 2007; Xavier et al., 2006).

Em 1999, a segunda MβL, denominada VIM-1, foi caracterizada em uma amostra de P.

aeruginosa isolada em Verona, Itália. Desde então, foram descritas 39 variantes desta enzima.

Embora a maior parte destas descrições tenha ocorrido a partir de isolados recuperados na Europa, algumas variantes foram também identificadas nos continentes americano e asiático

(Queenan & Bush, 2007; Walsh et al., 2005; Walsh, 2008). Em 2004b, Mendes e colaboradores, relataram a primeira descrição de VIM-2 na America Latina. Um trabalho brasileiro em 2011, descrito por Paez e colaboradores descreveu a presença da enzima VIM-2 em amostras de P.

aeruginosa, na unidade de hematologia de um hospital universitário.

Em 2002, uma nova MβL adquirida foi descrita no Brasil, sendo nomeada de SPM-1, sigla para São Paulo metalo-β-lactamase. Essa MβL foi caracterizada a partir de um isolado de

P. aeruginosa recuperado do trato urinário de uma paciente hospitalizada no complexo Hospital

São Paulo (Toleman et al., 2002). Estudos posteriores relataram a produção de SPM-1 em isolados de P. aeruginosa hospitalares originários de diferentes regiões brasileiras, sendo que a

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Página 25 produção desta enzima parece ocorrer de forma endêmica no Brasil, relacionada inicialmente à disseminação clonal (Gales et al., 2003; Zavascki et al., 2005; Carvalho et al., 2006; Pellegrino et

al., 2006; Cipriano et al., 2007).

Em 2002, na Alemanha, foi descrita a MβL denominada GIM-1 descrita em isolados de

P. aeruginosa de pacientes hospitalizados em Dusseldorf (Castanheira et al., 2004b). Em 2005, outra MβL foi descrita em isolados clínicos de A. baumannii na Coréia, denominada SIM-1 (Lee

et al., 2005). Mais recentemente, foram descritas novas subclasses de MβLs adquiridas: a enzima AIM-1 foi recuperada em um isolado clínico de P. aeruginosa, na Austrália (Yong et al., 2007); a enzima KHM-1 foi recuperada em um isolado clínico de Citrobacter freundii, no Japão

(Sekiguchi et al., 2008); a enzima NDM-1 foi recuperada em um isolado clínico de K.

pneumoniae, na Índia (Yong et al., 2009); a enzima DIM-1 foi descrita em um isolado de P.

stutzeri (Poirel et al., 2010b); a enzima TMB-1 foi recuperada em um isolado clínico de P.

aeruginosa detectado da África (El Salabi et al., 2009); a enzima SMB-1 foi recuperada em um isolado clínico de Serratia marcencens, no Japão (Wachino et al., 2011) e recentemente, foi descrita a enzima FIM-1, recuperada em um isolado clínico de P. aeruginosa, na Itália (Pollini et

al.,2013).

2.4.2. Impermeabilidade de Membrana Externa

A membrana externa de micro-organismos Gram negativos são constituídas de fosfolipídeos, lipopolissacarídeos e por proteínas de membrana externa (OMP), dentre as quais se encontram as porinas. As porinas são proteínas capazes de formar canais constituídos de água no seu interior que permitem a difusão de solutos hidrofílicos através da membrana externa e a extrusão de produtos não utilizados pela célula bacteriana (Nikaido, 1994). A perda ou a diminuição da expressão dos genes que codificam as porinas causam a redução da entrada de

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Página 26 antimicrobianos na célula, diminuindo a concentração interna do antimicrobiano, o que pode conferir resistência aos β-lactâmicos (Quinn et al., 1988). Diferentes porinas podem ser encontradas na membrana externa de isolados de P. aeruginosa, como OprF, OprC, OprD e OprE (Fung-Tomc et al., 1995, Huang & Hancock, 1996, Livermore, 2001).

A proteína OprD é uma porina substrato-específica que facilita a difusão de aminoácidos e antimicrobianos para dentro da célula. Esta proteína é a principal entrada de carbapenens, mas não utilizada por outros β-lactâmicos. Contudo a perda dessa proteína, associada à expressão de sistemas de efluxo acarreta a diminuição da sensibilidade aos carbapenens, principalmente para o imipenem, e não para meropenem (Lister et al., 2009). Entretanto, a perda de outras porinas menos específicas, pode afetar o transporte de pequenos agentes hidrofílicos, tais como os aminoglicosídeos, as tetraciclinas e o cloranfenicol (Zavascki et al.,2010).

A resistência mediada pela OprD está relacionada a diminuição da transcrição e/ou mutações do seu respectivo gene oprD, que podem interromper o funcionamento da porina na membrana. Alguns desses mecanismos já caracterizados que diminuem a expressão de OprD incluem: (i) interrupção da transcrição da porina, sendo por deleções ou inserções na região do gene promotor; (ii) transcrição imatura do gene; (iii) corregulação com mecanismos que conferem resistências aos metais; (iv) diminuição da transcrição por meio de mecanismos de corregulação com o sistema de efluxo MexEF-OprN (Perron et al., 2004; Caille et al., 2007; Lister

et al., 2009).

Em 2006, Tamber e colaboradores relatou 19 proteínas com similaridade com a porina OprD. A análise filogenética dessas proteínas demonstraram dois grupos distintos, sendo um grupo menor que possuía alta similaridade com a porina OprD e um segundo grupo com maior semelhança com a porina Phak de Pseudomonas putida. Pertencentes ao grupo menor, seis proteínas descritas em P. aeruginosa (OpdJ, OpdI, OpdR, OpdO, OpdD e OpdQ) não tem