Para pesquisa das substâncias inalteradas e metabolitos foram selecionados, para cada molécula, os iões mais característicos de acordo a sua abundância relativa e especificidade. Na tabela 14 estão representados os iões selecionados com base no padrão de fragmentação das substâncias após derivatização com TFAA, no entanto, os únicos compostos que conseguiram ser identificados inequivocamente foram o padrão interno (PI), a BZP, e a TFMPP (figura 28).
Tabela 14- Substâncias identificadas com base nos respetivos iões selecionados com base no padrão de
fragmentação, após derivatização com o anidrido trifluoroacético (TFAA).
Substância Ião
(m/z) Padrão de fragmentação
PI
232
90
Tabela 14 (Cont.)- Substâncias identificadas com base nos respetivos iões selecionados com base no
padrão de fragmentação, após derivatização com o anidrido trifluoroacético (TFAA).
BZP
175
181
91
Tabela 14 (Cont.)- Substâncias identificadas com base nos respetivos iões selecionados com base no
padrão de fragmentação, após derivatização com o anidrido trifluoroacético (TFAA).
TFMPP
200
229
92
Figura 28- (A) Cromatograma representativo de uma solução de calibração (vermelho) contendo padrão interno (verde), BZP (amarelo) e TFMPP (azu) injectada no GC-MS
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5.3. 2- Estudo do perfil metabólico da BZP e
TFMPP, isoladamente e em mistura, após
incubação com hepatócitos primários de rato
Como já foi referido na secção 2, a BZP e a TFMPP partilham algumas vias metabólicas, o que, consequentemente, pode dar lugar a competição entre elas por transportadores membranares, enzimas, proteínas plasmáticas, etc, e originar alterações no metabolismo das substâncias quando administradas em conjunto. Por este motivo, foi feito um estudo preliminar para avaliar esta possível interação ao nível do metabolismo e eventuais repercussões em termos de toxicidade. Foram analisados os sobrenadantes de duas concentrações de mistura A para dois níveis de citotoxicidade distintos (EC60 e EC10). Em paralelo, selecionaram-se sobrenadantes resultantes da incubação com os compostos BZP e TFMPP individualmente nas mesmas concentrações em que as substâncias estavam presentes na mistura A.
Para a quantificação das substâncias foi necessário traçar a curva de calibração para a BZP e a TFMPP, sem que no entanto tenham sido conseguidos bons níveis de linearidade (tabela 15).
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Tabela 15- Curvas de calibração para a BZP e TFMPP.
Substância Curva de Calibração Equação da
recta R
2
BZP y=268,34x-1,1181 0,9579
TFMPP
y=194,57x+1,1394 0,9533
Com base na metodologia utilizada, apenas foi possível quantificar a BZP nos sobrenadantes das células expostas à substância individual e à mistura A. Os sobrenadantes testados após a exposição à TFMPP isoladamente e na mistura A não revelaram a presença do composto, não obstante as concentrações de TFMPP estarem dentro da gama de linearidade do método, sendo possível detetar a TFMPP para concentrações de padrões mais baixas do que as concentrações testadas (isoladamente e na mistura). Relativamente à BZP observou-se, para ambas as concentrações de mistura A testadas, que a quantidade detetada nos sobrenadantes das células expostas à mistura foi superior à quantidade detetada nas células expostas às mesmas concentrações de BZP isoladamente (tabela 16). Com o método utilizado não foi possível identificar qualquer metabolito, quer da BZP, quer da TFMPP.
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Tabela 16- Concentração (mM) quantificada pelo método de GC-MS, nos sobrenadantes dos hepatócitos
primários de rato expostos à BZP, à TFMPP e à mistura A em duas concentrações distintas (EC60 e EC10).
Mistura A Concentração detetada de BZP (mM)
Real Individual Mistura
EC60 1,716 0,522 0,812
EC10 0,848 0,232 0,255
Concentração detetada de TFMPP (mM)
EC60 0,104 n.d n.d
EC10 0,052 n.d n.d
Concentração real: concentração de BZP e de TFMPP com que os hepatócitos primários de rato foram incubados isoladamente e na mistura A para dois níveis de citotoxicidade (EC60 e EC10).
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6- DISCUSSÃO
97 As piperazinas constituem um grupo de drogas recreativas que surgiram na década de 90 e, pelos seus efeitos psicoativos, fácil aquisição e crença errada de se tratarem de substâncias relativamente seguras, constituem uma das classes de drogas recreativas sintéticas mais vendidas, apesar do seu estatuto ilegal em alguns países (Lee et al. 2011; Sheridan et al. 2007; Wood et al. 2008).
Estas drogas são muitas vezes consumidas em associação, como uma “alternativa segura” à MDMA e também com o intuito de aumentar os efeitos desejados. No entanto, a toxicidade das misturas tem sido negligenciada e a maioria dos estudos científicos incidem sobre a toxicidade dos compostos individuais, subestimando o risco real associado aos “cocktails” de drogas (Dias da Silva et al. 2013b). As informações disponíveis acerca da segurança, propriedades farmacológicas e toxicológicas, contra-indicações, interações e advertências de consumo destas drogas são ainda atualmente muito limitadas, pelo que as consequências para a saúde são ainda pouco conhecidas e difíceis de prever (Gee and Fountain 2007; Staack and Maurer 2005; Zawilska 2011).
No âmbito da presente dissertação interessa-nos, em particular, aprofundar o estudo das interações entre as piperazinas de forma a prever e explicar alguns dos seus efeitos uma vez que, tal como já verificado para outras drogas de abuso, pensa-se que o co-consumo destas substâncias, devido à sua ingestão acidental ou deliberada de misturas, pode contribuir em parte para os eventos de intoxicações inesperadas (Antia et al. 2009b; Dias da Silva et al. 2013c). Uma vez que o número de combinações possíveis entre estas drogas é, em teoria, infinito e impossível de testar quer in vivo, quer in vitro, torna-se preemente a implementação de metodologias adequadas à previsão de efeitos de mistura, como forma de avaliação de risco.
Como já foi referido, o presente trabalho de investigação teve como objetivos: (i) verificar potenciais interações entre duas drogas de abuso do tipo das piperazinas, a BZP e a TFMPP, (ii) determinar se estas mesmas interações podem ser estimadas com recurso a dois modelos farmacológicos, o modelo de AC e o modelo de AI, (iii) estudar os mecanismos subjacentes à sua toxicidade e (iv) estudar eventuais alterações no perfil metabólico das drogas resultantes das suas interações.
Quer por questões éticas, quer por questões económicas, os ensaios foram realizados em dois modelos celulares in vitro que se consideraram mais adequados para o estudo de hepatotoxicidade e metabolismo, nomeadamente os hepatócitos primários de rato e a linha celular humana HepaRG.
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