Identificação de enzimas por espectrometria de massas

A espectrometria de massas é uma ferramenta utilizada para a identificação de moléculas puras ou em misturas através da sua ionização e uma posterior separação por razão massa/carga desses íons. Essa análise gera um espectro de massas usado para identificar a molécula na amostra (KINTER; SHERMAN, 2000).

O ensaio de espectrometria de massas foi realizado com os mesmos sobrenadantes utilizados nos ensaios anteriores. Os espectros referentes ao experimento de comparação dos fungos T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30 foram processados com um banco Uniprot contendo todas as sequências de Trichoderma sp. depositadas (70.317 sequências; 32.779.763 resíduos).

Identificou-se um total de 225 proteínas finais validadas, sendo 148 em T. erinaceum (F3) (133 exclusivas), 52 em T. reesei WT e 61 em RUT C30 (Figura 17) (Apêndice I).

T. erinaceum T. reesei RUT C30

N ú m er o d e id en ti fi ca çõ es 0 20 40 60 80 100 120 140 160

Figura 17: Gráfico representando a quantidade de identificações por espectrometria de massas em relação aos três fungos submetidos à análise (à esquerda). Diagrama de Venn (à direita) com os números de proteínas que são encontradas em comum entre os fungos, sendo que o T. erinaceum tem o maior número de proteínas exclusivas (133 identificações).

T. erinaceum

T. reesei

Dado que o número de peptídeos que são submetidos à fragmentação no experimento de espectrometria de massas é limitado (KALLI et al., 2013; ZERCK, 2013), proteínas que são muito abundantes podem atrapalhar a identificação de proteínas menos abundantes, podendo isso explicar um menor número de proteínas identificadas em T.reesei WT e RUT C30. Somado a isso, as diferenças enzimáticas encontradas na espectrometria de massas podem também ser relacionadas com os diferentes padrões de bandeamento em gel de SDS PAGE 15%, representado na Figura 18.

Figura 18: Gel de poliacrilamida 15% contendo 10µg de cada uma das triplicatas biológicas dos sobrenadantes dos fungos analisados. A maior parte das proteínas que pareciam ter um aumento de secreção em RUT C30 estavam entre 40 e 100 kDa e os padrões encontrados em T. erinaceum e T. reesei demonstravam ser distintos.

Como visto no gel, o fungo RUT C30 parece ter modificações quanto a secreção de proteínas principalmente entre 40kDa e 70kDa. Em relação aos fungos selvagens, foi notada uma diferença grande no padrão de bandeamento e a partir da massa teórica conseguiu-se inferir que as xilanases tem por volta de 25kDa e 35kDa e as β-glicosidases, por volta de 80kDa em T. eninaceum (F3), foco do trabalho. Além disso, quando comparamos as enzimas que estão sendo secretadas nos dois fungos selvagens, demonstra-se a importância de continuar estudos com a linhagem de T. erinaceum (F3). Isso porque, em comparação com o T. reesei WT e ao RUT C30, eles secretam apenas 7 enzimas em comum, enquanto 133 identificações são exclusivas do fungo isolado (Figura 17).

Considerando os grupos enzimáticos e os fungos estudados, foi possível analisar proporcionalmente a secreção destes. Como o foco deste trabalho é entender quais enzimas diferenciadas o fungo T. erinaceum (F3) possui principalmente em relação à degradação de xilanas, celobioses e xilobioses temos que do total de enzimas encontradas no secretoma deste, 67% eram glicosil hidrolases, enquanto em T. reesei WT tem-se 61% e 69% em RUT C30, ou seja, a proporção de GHs em relação a outras proteínas secretadas de T. erinaceum

(F3) ficou mais próxima a de um fungo já modificado. Em relação aos outros grupos enzimáticos também importantes, como PLs, CEs e AAs, a porcentagem de proteínas secretadas encontradas foi próxima, considerando os 3 fungos analisados (Figura 19).

Figura 19: Divisão das enzimas secretadas pelos fungos analisados de acordo com a classificação do banco de dados CAZy (Carbohydrate Active Enzymes), enfatizando principalmente a diferença na secreção de glicosil hidrolases, maiores responsáveis na degradação da biomassa lignocelulósica.

Dado que o grupo das hidrolases glicosídicas contribui mais em relação a enzimas de degradação, analisamos as classificadas dessa forma mais profundamente. Em número de proteínas identificadas, o T. erinaceum (F3) se sobressai em relação a GH3, GH10, GH12, GH18, GH31, GH 62, GH 64, GH71, GH72, GH76, GH92, GH115 e GH127 (Figura 20).

GH 3 GH 5 GH 6 GH 7 GH 10 GH 11 GH 12 GH 13 GH 15 GH 16 GH 17 GH 18 GH 28 GH 30 GH 31 GH 45 GH 51 GH 54 GH 55 GH 62 GH 64 GH 71 GH 72 GH 74 GH 76 GH 92 GH 115 GH 127 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 30 32 34 36 T. erinaceum T. reesei RUT C30 N ú me ro d e id en ti fi caç õ es

Figura 20: Número de identificações total referente a secreção de cada uma das Glicosil Hidrolases validadas

em T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30. Algumas das enzimas que foram encontradas têm scores validados para apenas um dos fungos.

As informações correspondentes a anotação do banco de dados, podem muitas vezes chegar apenas a nível de família proteica (GH), mas não de qual enzima correspondente. Isso porque, a plataforma CAZY agrupa as enzimas de acordo com a composição de aminoácidos, o que reflete as características estruturais melhor do que a sua especificidade de substrato e também fornece informações mecanísticas (HENRISSAT, 1991). Para o T. erinaceum, analisou-se primeiramente os grupos de enzimas principais na degradação de xilana (endoxilanases e β-xilosidases), celobiose (β-glicosidases) e cadeias laterais da hemicelulose (α-L-arabinofuranosidases e α-galactosidases).

Em relação às endoxilanases a anotação atingiu o nível da identificação em proteína e as famílias encontradas foram GH10 (com 6 proteínas) e GH11 (com 3 proteínas), totalizando 9 enzimas/identificações relacionadas. Quanto as β-xilosidases, a anotação chegou apenas em família, sendo que encontrou-se representantes das famílias GH5, GH31, GH51 e GH54 no exoproteoma de T.erinaceum (F3), podendo parte destas provavelmente se tratar da enzima em questão.

Considerando a degradação de celobiose, 7 enzimas pertencentes a família GH3foram encontradas, sendo destas, 5 anotadas como β-glicosidases.

As α-L-arabinofuranosidases a partir da análise da similaridade na seqüência de aminoácidos das regiões hidrofóbicas foram agrupadas em cinco famílias de glicosil- hidrolases principais: GH3, GH43, GH51, GH54 e GH62 (CANTAREL et al., 2009), porém, no presente trabalho, as enzimas identificadas na espectrometria de massas são pertencentes aos grupos GH51 e GH62. No grupo de α-galactosidases, a plataforma CAZY tem representantes em 8 famílias de hidrolases glicosídicas, entretanto, encontramos duas identificações relacionadas apenas para GH31 em T. erinaceum (F3).

De forma geral, analisando a degradação de celulose encontramos 14 famílias de GHs em T. erinaceum (F3). Comparativamente, encontrou-se 10 famílias em T. reesei WT e 11 famílias em RUT C30. Dessa forma, acredita-se que a variedade de enzimas distribuídas nas diversas famílias de glicosil hidrolases pode auxiliar numa maior eficiência sobre substratos mais complexos (ALISSON; VITOUSEK, 2005) (como a biomassa pré-tratada da hidrólise), entretanto, quando em substratos mais simples como carboximetilcelulose utilizado no ensaio enzimático, ter uma maior quantidade de enzimas pertencentes a uma mesma família, aumenta as atividades específicas do extrato em questão, como vimos o caso do RUT C30, com uma atividade específica de 250UI/mg de proteína no ensaio de CMCase, tendo ele uma maior quantidade de GH7s identificadas (endo e exoglucanases) quando comparado aos outros dois fungos analisados. Tal redundância gênica é uma característica presente em muitos fungos, variando entre 2 a 20 representantes da mesma categoria ou família. Isso indica que os fungos tem a capacidade de adequar a produção dos coquetéis enzimáticos considerando as condições ambientais (fonte de carbono, pH e força iônica), além da capacidade de aprimoramento evolutivo ao longo do tempo (PEREZ; MORALEDA- MUNOZ, 2011).

Porém, outro fator que deve ser considerado em relação ao número aumentado de determinados grupos de proteínas é o uso de um banco geral contendo todas as sequências de Trichoderma sp. provenientes do Uniprot para o processamento dos dados brutos da espectrometria de massas, associado a quantidades muito altas secretadas de determinadas enzimas, o que pode levar a uma superestimação nas contabilizações referentes a número de proteínas identificadas, como por exemplo, GH6, GH7 e GH10 em T. reesei, dado que um número inferior de genes relacionados foi descrito na literatura para tais famílias (HAKKINEN et al., 2012). Isso também explicaria o número aumentado de proteínas para a

família de GH18 em T. erinaceum (36 identificações), o que representa uma maior quantidade de quitinases, mas não necessariamente 36 proteínas distintas.

O presente trabalho demonstra dessa forma, a importância de um banco de dados acurado e com o maior número de sequências possíveis. Porém é válido lembrar que a robustez dos dados é ainda dependente da proximidade desse banco com os arquivos gerados pela espectrometria de massas.

Com isso, como prova de conceito seria ainda necessário analisar de forma quantitativa a expressão dessas enzimas, além de estudos com cada uma delas isoladamente para entender se estas têm alguma vantagem em atividade enzimática considerando às secretadas por T. reesei WT e RUT C30, principalmente as xilanases e β-glicosidases.

3. CONCLUSÕES PARCIAIS

Como conclusões parciais do presente capítulo, o fungo T. erinaceum obteve diferenças significativas nas atividades enzimáticas de xilanases, β-xilosidases, β-glicosidases e referentes as cadeias laterais arabinofuranosídicas e galactosídicas quando testado comparativamente aos outros dois fungos (T. reesei e RUT C30) em substratos solúveis. Porém, no ensaio de hidrólise, a atuação dos coquetéis provenientes dos cultivos fúngicos sobre substratos insolúveis demonstrou algum efeito inibitório principalmente sobre o extrato de T. erinaceum, devido ao acúmulo de xilobiose mesmo este contendo alta atividade de β- xilosidase, enquanto que a concentração final de glicose ficou próxima a encontrada em um coquetel comercial (Celluclast). Em espectrometria de massas, identificou-se 133 proteínas exclusivas de T. erinaceum, sendo 67% pertencentes as hidrolases glicosídicas e distribuídas em 23 famílias diferentes, o que representou uma menor redundância enzimática quando comparada a linhagem de RUT C30, por exemplo, que apresentou uma quantidade maior de identificações dentro de algumas poucas famílias de GHs, como as GH7. Além disso, consequente ao uso de um banco de dados geral no processamento dos dados de espectrometria de massas, somado a quantidade aumentada de algumas enzimas específicas (GH6, GH7, GH18, por exemplo), superestimou-se alguns números referentes a identificações, o que demonstrou alguns fatores essenciais como a relação entre um grande número de sequencias inseridas no banco, sendo essas o mais próximas possíveis aos dados gerados, e a robustez dos scores obtidos com diminuição do False Discovery Rate. De qualquer forma, há uma diferença significativa em relação a quantidade de proteínas

encontradas em T. erinaceum, podendo essas serem relacionadas a quantidade maior secretada ou maior número de identificações, o que seria posteriormente melhor investigado.

A partir destes resultados, um artigo científico está em processo de submissão e tem como título: “Lignocellulolytic activity and secretome analysis of a novel Trichoderma erinaceum strain isolated from decaying sugarcane straw.”

Artigo 1 – Em preparação para submissão

Lignocellulolytic activity and secretome analysis of a novel Trichoderma erinaceum

strain isolated from decaying sugarcane straw

Desireé S. Silva, Míriam Dantzger, Michelle A. de Assis, Jéssica C. M. Gallardo, Sílvia K. Missawa, Gleidson S. Teixeira, Marcelo F. Carazzolle, Romenia R. Domingues, Adriana F. P. Leme, Inês Lunardi, Lucas S. Parreiras, Gonçalo A. G. Pereira.

Background

Plant-derived biomass is the most abundant source of carbohydrates on Earth, and its conversion into biofuels has the potential to significantly reduce our dependence on fossil fuels 2. The commercial scale production of these environment-friendly fuels depends, however, on the availability of cost-efficient technologies for the release of sugar monomers from the polysaccharide chains present in the plant cell walls. Plant cell walls are largely composed of lignocellulose, a recalcitrant matrix of biopolymers containing mainly cellulose (20-50%), hemicellulose (15-35%) and lignin (10-25%) 3,4. Deconstruction of the lignocellulosic (LC) biomass for biofuel production is generally accomplished in two stages. First, a pretreatment step works to increase the porosity of the plant material, making the cellulose and hemicellulose polysaccharides more accessible to enzymes. Next, the pretreated material is subjected to an enzymatic hydrolysis that decomposes the exposed sugar polymers into monomers. The obtained sugar molecules can then be converted into biofuels, such as bioethanol, and into value-added chemicals that may serve as an economic driver for the biorefineries 5–7.

The enzymatic hydrolysis step represents one of the major bottlenecks for the industrial-scale production of LC biofuels. The required enzyme cocktails are expensive,

accounting for about a third of overall production costs 8. In addition, these cocktails must contain a diverse arsenal of lignocellulases (cellulases, hemicellulases and ligninases) in order to efficiently break down the complex structure of LC substrates 9–11, and unless their composition is customized for each type of biomass and pretreatment method employed in a given process, there are significant differences on the observed hydrolysis efficiency 12,13.

The filamentous fungus Trichoderma reesei is utilized in the production of most enzymatic formulations used by LC biorefineries around the world. In fact, the production of about 80% of all the LC ethanol manufactured worldwide relies on T. reesei derived enzymes

14

. Since it was first isolated from US Army´s rotting cotton tents in the Solomon Islands during World War II, the wild T. reesei strain QM6a has been developed into several enzyme- hypersecretory strains 15. Starting in the early 1970´s, various research groups applied random mutagenesis techniques to develop mutant strains capable of secreting large quantities of lignocellulases 16–18. Some of these strains were further developed and are still used by the industry today for the industrial production of lignocellulases and other enzymatic preparations 19,20. A prime example from these mutagenesis-derived lineages, the RUT-C30 strain has been a reference in both industry and academic research since it was developed at Rutgers University in 1979 21. Along with the parental QM6a strain, RUT-C30 has been the focus of numerous studies which aimed to identify limitations and to improve the overall efficiency of the enzymatic cocktail secreted by T. reesei. A prominent deficiency identified early on is the low β-glucosidase activity of the cocktail, which leads to cellobiose accumulation during biomass hydrolysis 22. The accumulated cellobiose inhibits the activity of endoglucanases, ultimately resulting in low glucose yields 23. Both the genetic engineering of T. reesei strains with heterologous β-glucosidase genes and the supplementation of its cocktail with the enzyme have been shown to improve the hydrolytic efficiency toward LC substrates 24–26. Several hemicellulases, such as xylanases, mannanases and arabinofuranosidases, have also been shown to individually complement T. reesei secretome

27–29

. The greatest improvement so far described for the supplementation of T. reesei enzymatic cocktail was achieved with the engineering of an industrial lignocellulase production strain with a lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO) encoding gene 30. Harris et al. showed that a 2-fold reduction of the protein loading required for the hydrolysis of LC biomass was achieved with the expression of the heterologous LPMO enzyme.

Despite all the identified deficiencies and the fact that other described fungi produce more efficient lignocellulolytic cocktails (reviewed in 31,32), Trichoderma reesei continues to

be the fungus of choice for the industrial production of these enzymes. The knowledge gained through over seventy years of study and the consolidated technologies available for its manipulation and industrial application favor the continued use of this fungal workhorse 14,33. Still, the advancement of the LC biofuel industry hinges on improving the efficiency and reducing the costs of the available enzymatic cocktails. Thus, it is crucial to discover novel enzymes that may complement T. reesei cocktail and to study other fungal species that could potentially replace it as an enzyme production platform.

A virtually unexplored source of biodiversity with untapped potential for the production of lignocellulases are all the other species of the genus Trichoderma. This group comprises over 80 species that inhabit a wide range of habitats and display very distinct phenotypes 34. Most remain uncharacterized for their lignocellulolytic capabilities, with only a few being studied so far 35–39. For instance, the Trichoderma erinaceum species was first described in 2003 40 and since then has had specimens identified in several Trichoderma sp. biodiversity studies 41–43, but has not been further characterized.

In the present study, 8 filamentous fungal strains were isolated from decaying sugarcane straw collected at the straw storage facility of a LC ethanol biorefinery in northeastern Brazil. The fungal isolate F3, identified as a Trichoderma erinaceum strain, presented the highest cellulolytic activities in preliminary screenings and was selected for further investigation. The here described results of a comprehensive characterization of lignocellulolytic activities, a hydrolysis assay of pretreated sugarcane straw and a comparative secretome analysis with a wild T. reesei strain demonstrate a significant potential for the T. erinaceum F3 isolate in the production of lignocellulolytic enzymes.