Montagem dos cassetes para expressão em Trichoderma reesei

Para construção do cassete, o vetor que foi utilizado é o pRS315, sendo a seleção em levedura a partir da auxotrofia (meio sem uracila). O cassete é composto de uma região de homologia ao genoma do T. reesei (HomTR1/Hom TR3), um promotor fortemente expresso quando induzido (CBH1p), a sequência codificadora da enzima proveniente do T. erinaceum (xilanase ou β-glicosidase) com cauda de histidina e sítio de clivagem TEV, terminador CBH1t, sequência do gene pyr4 completa (incluindo promotor e terminador) para auxiliar na seleção dos fungos transformados (GUHPTA et al., 2014) e uma segunda homologia ao genoma do T. reesei (Hom TR2/Hom TR4) (Figura 30).

Figura 30: Esquema demonstrando como foi realizada a montagem dos cassetes para expressão das enzimas de T. erinaceum. Estes possuem 8 fragmentos incluindo as homologias ao genoma de T. reesei, promotor /terminador CBH1, pyr4 e as ORFs de interesse.

A estratégia de integração do cassete em T. reesei envolveu recombinação homóloga (LIU et al., 2015). As regiões com homologia ao T. reesei são importantes, pois auxiliam o sistema no direcionamento de qual locus gênico será alterado.

Essa região de inserção correspondeu ao loci das enzimas de T. reesei com maior identidade encontrada em relação ao T.erinaceum. Isso permitiu uma transformação controle de reinserção das enzimas endógenas, excluindo qualquer risco da atribuição na mudança de atividade enzimática relacionada ao promotor utilizado.

ClaI ClaI

Os genes e outros fragmentos necessários para a montagem do cassete foram amplificados por PCR e tiveram os tamanhos confirmados em gel de agarose (1%), corados com brometo de etídeo.

A partir da transformação dos fragmentos em levedura (PE14Ura3Δ), como o pRS315 continha uma seleção para meio com restrição de uracila, foi possível selecionar colônias (Figura 31) que possuíam o vetor montado de forma correta.

Figura 31: Placa contendo um dos vetores montados em levedura PE14Ura3Δ (A- xilanase de T.

erinaceum) em comparação ao controle negativo (B).

Com os vetores extraídos, transformou-se as montagens em E.coli (DH10β), para manutenção do vetor e confirmação da montagem correta dos fragmentos pela levedura. No início e ao final do cassete foram inseridas uma sequência de restrição para a enzima ClaI (no caso das xilanases do T. erinaceum e xilanase controle de T. reesei) e NotI (para a β- glicosidase de T. erinaceum e β-glicosidase controle de T. reesei). Os tamanhos dos cassetes digeridos variaram entre 9 kB (xilanases) e 11 Kb (β-glicosidases), sendo a banda do plasmídeo próxima a 4500 pb (Figura 32-C).

Com os 5 vetores clivados pelas enzimas correspondentes, foi possível realizar as transformações da cepa T. reesei pyr4Δ com os cassetes de expressão (Figura 32 – A).

Figura 32: A- Placa contendo um dos fungos transformantes (à direita) em comparação com o controle negativo (à esquerda) em meio com restrição de uracila para seleção dos transformantes. B- Fungo transformante crescido em meio PDA. C- Exemplos dos vetores digeridos com as enzimas de restrição correspondentes (2 bandas) usados na transformação do fungo em comparação aos vetores fechados (1banda). Marcador 1Kb Plus DNA ladder (Invitrogen).

As inserções foram confirmadas por PCR (Figura 33), sendo a inserção confirmada no local correto para as 3 xilanases (duas de T. erinaceum com e sem CBM e uma endógena de T. reesei). Para as β-glicosidases, a proveniente de T. erinaceum foi possivelmente inserida em outro locus, enquanto a endógena de T. reesei ainda não foi confirmada (Tabela VII). Os esporos estão em processo de isolamento obtenção de uma linhagem permanente.

A B C bp Aprox. 9000 4000 2000 1650 400 300

Figura 33: A- Primers utilizados para a confirmação da inserção e localização dos cassetes em T. reesei. B- Géis de eletroforese corados com brometo de etídeo evidenciando os fragmentos específicos amplificados para a confirmação dos transformantes, sendo que para cada uma das transformações foram testados 4 isolados.

Tabela VII: Confirmação das montagens dos cassetes para expressão das proteínas de T. erinaceum usando como sistema de expressão o T. reesei e locais de inserção dos cassetes construídos.

Montagem Inserção Loci alvo

Xilanase T. erinaceum (completa)  

Xilanase T.erinaceum (sem CBM)  

Xilanase T. reesei  

β-glicosidase T. erinaceum  X

β-glicosidase T. reesei x X

2.3. Montagem dos cassetes para expressão em E.coli

Em paralelo ao sistema de expressão construído em T. reesei, montou-se também um sistema para expressão em E. coli, o que possibilitaria posteriormente ensaios estruturais com as enzimas selecionadas de T. erinaceum. O plasmídeo pET28a (+) escolhido (Figura 34) é disponibilizado comercialmente e contém as restrições necessárias para a clonagem: EcoRI e HindIII (para as xilanases) e Hind III e XhoI (para as β-glicosidases).

Figura 34: Mapa do vetor utilizado nas construções referentes a expressão das proteínas em E. coli, demonstrando o local de inserção dos genes (vermelho).

A partir dos genes necessários provenientes de T. erinaceum e T. reesei, amplificados a partir do cDNA para obter sequências sem introns (considerando que o sistema é procariótico e não há processamento), realizou-se as digestões dos fragmentos e plasmídeo com as enzimas escolhidas, a ligação com T4 DNA ligase de acordo com o protocolo do fabricante (Promega) e a eletroporação feita em linhagem DH10β. Os vetores foram todos confirmados por PCR e estão sendo submetidos a sequenciamento para posteriormente transformar tais montagens em E.coli BL21(DE3) plys

S, linhagem mais específica para uso como plataforma de expressão por ser deficiente em proteases.

3. CONCLUSÕES PARCIAIS

Ao fim do presente capítulo, construiu-se 5 vetores para a expressão das duas proteínas selecionadas de T. erinaceum (com identidade inferior a 65% em relação ao T. reesei) para 2 sistemas de expressão distintos, sendo um eucariótico e outro procariótico.

Quanto as construções, duas são xilanases (com e sem domínio CBM), uma β- glicosidase de T.erinaceum e duas referentes as enzimas equivalentes em T. reesei como controle.

Para a expressão em sistema eucariótico (contendo glicosilações nas proteínas secretadas) usamos como plataforma o T. reeseiΔpyr4, enquanto que para expressão em sistema procariótico a plataforma foi a bactéria E. coli.

Por fim, como próximos passos, os fungos transformados serão crescidos em meio contendo suplementação com biomassa pré-tratada, para obtenção do sobrenadante contendo as enzimas secretadas e consequentemente, a enzima heteróloga. A partir de tal extrato, as caudas de histidina em cada uma das enzimas auxiliarão no processo de purificação, permitindo assim ensaios mais específicos em relação a estrutura e atividade enzimática.

Para expressão em E. coli, a partir das confirmações finais por sequenciamento, os vetores montados serão transformados em BL21(DE3) plysS, podendo também ser testados em outras linhagens considerando a quantidade de proteína final. A partir de todos esses transformantes, será possível comparar as proteínas selecionadas em dois sistemas de expressão muito distintos (funcionalmente e estruturalmente), ensaios de atividade, hidrólise e caracterização das enzimas clonadas e purificadas, além da comparação de proteínas glicosiladas e não-glicosiladas em relação a enovelamento, estabilidade e atividade, comparação das xilanases com e sem CBM em relação a substratos solúveis e insolúveis e suplementação de coquetéis com as enzimas isoladas.

5. CONCLUSÕES FINAIS

A partir dos experimentos realizados, explorou-se a secreção de enzimas relacionadas a degradação de biomassa no fungo T. erinaceum (F3). Nos ensaios enzimáticos e hidrólise, os resultados demonstravam uma grande capacidade enzimática do fungo bioprospectado, fato confirmado pela grande diversidade de enzimas detectadas nos experimentos de espectrometria de massas. Além disso, foi possível estudar o sistema de indução e inibição da secreção enzimática do fungo a partir de variações das fontes de carbono utilizadas nos cultivos e como se dá o ajuste da secreção de enzimas em relação a complexidade da fonte de carbono nutricional.

Considerado isto, ainda foi explorado se o ganho em atividade enzimática de xilanases e β-glicosidases observado em T. erinaceum em relação a T. reesei, se dá através da maior secreção de uma ou mais enzimas, sendo que posteriormente as enzimas identificadas serão analizadas quanto a estrutura e/ou estabilidade. Para isso, pretendemos expressar no fungo T. reesei e na bactéria E. coli as enzimas de T. erinaceum identificadas como sendo mais distintas estruturalmente, para avaliar suas atividades enzimáticas, além da realização dos devidos testes biofísicos.

Concluindo, a identificação dos fatores responsáveis pelas altas atividades enzimáticas observadas para o fungo T. erinaceum (F3), como também a avaliação das melhores condições de cultivo para a produção de enzimas, tem o potencial de contribuir para uma melhora do processo de hidrólise, seja através do desenvolvimento do fungo em estudo ou pela expressão e suplementação de coquetéis enzimáticos atualmente utilizados na indústria com as enzimas de interesse identificadas.

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