UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
MICHELLE ALEXANDRINO DE ASSIS
IDENTIFICAÇÃO DE ENZIMAS COM POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO EM TRICHODERMA ERINACEUM
CAMPINAS 2018
MICHELLE ALEXANDRINO DE ASSIS
IDENTIFICAÇÃO DE ENZIMAS COM POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO EM TRICHODERMA ERINACEUM
Orientador: PROF. DR. GONÇALO AMARANTE GUIMARÃES PEREIRA
CAMPINAS 2018
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Genética e Biologia Molecular, na área de genética de microrganismos
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA MICHELLE ALEXANDRINO DE ASSIS E ORIENTADA PELO PROF. DR. GONÇALO AMARANTE GUIMARÃES PEREIRA
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2016/02792-0; CNPq,
133660/2016-8
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0815-135
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Assis, Michelle Alexandrino de, 1992-
As76i Ass Identificação de enzimas com potencial biotecnológico em Trichoderma
erinaceum / Michelle Alexandrino de Assis. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
Ass
Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira.
Ass Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Biologia.
Ass 1. Hidrólise. 2. Biocombustíveis. 3. Hidrolases. 4. Trichoderma. 5.
Secretoma. I. Pereira, Gonçalo Amarante Guimarães, 1964-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Identification of enzymes with potential for biotechnological
applications in Trichoderma erinaceum
Palavras-chave em inglês: Hydrolysis Biofuels Hydrolases Trichoderma Secretome
Área de concentração: Genética de Microorganismos Titulação: Mestra em Genética e Biologia Molecular Banca examinadora:
Gonçalo Amarante Guimarães Pereira [Orientador] André Ricardo de Lima Damásio
Roberto Ruller
Data de defesa: 27-02-2018
Campinas, 27 de fevereiro de 2018.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Prof. Dr. André Ricardo de Lima Damásio Dr. Roberto Ruller
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico essa dissertação aos meus pais. Por todos os abraços e por dizerem tantas
Agradecimentos
O desenvolvimento desse trabalho exigiu muita ajuda e isso me fez perceber como eu sou agraciada por estar repleta de pessoas tão incríveis ao meu redor.
Gostaria de agradecer meu orientador Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira por permitir que eu fizesse parte de um laboratório tão especial como é o Laboratório de Genômica e Expressão. E por me desafiar e sempre confiar em mim e na minha capacidade.
Ao meu “co-orientador” Msc. Lucas Salera Parreiras. Pela amizade, generosidade, paciência e por sofrer comigo sempre que algo parecia ruim na frente do transiluminador. Sempre fico honrada em trabalhar com você.
À Dra. Miriam Dantzger, por me ajudar tanto no início da minha vida de pós-graduação e tornar a rotina intensa de experimentos tão leve.
Aos meus amigos do laboratório: Fábio Trigo Raya, Nicholas Vinícius Silva, Juliana Pimentel Galhardo, Mariana Rebouças, Lucas Miguel Carvalho, Gabriel Lorencini Fiorin, Beatriz Temer, Guilherme Boreli e todos os outros do LGE, por fazer parecerem pequenos os problemas que iam surgindo e por me ajudarem tanto a achar a tal luz no fim do túnel.
À Eliane Laranja Dias por ser tão solícita e amável ao enfrentar as burocracias do projeto.
À Dra. Adriana Paes Leme e Msc. Romênia Ramos Rodrigues por toda ajuda com os experimentos envolvendo espectrometria de massas e ao LNBio. À Dra. Inês Lunardi pela ajuda com os experimentos de HPLC.
À Dra. Astrid Mach-Aigner por ceder uma das cepas de T. reesei que utilizamos no trabalho.
Às amigas queridas: Cibele Oliveira, Marcele Pandeló, Tábata Renee, Jéssica Lóis, Nathalia Indolfo, Natália Videira, Juliana Fattori e Aline Bridi por simplesmente me ouvirem nos momentos de maior angústia. Serei eternamente grata.
Ao pessoal do Instituto SENAI Inovação – Biomassa e GranBio Celere (Dra. Desireé Soares, Dr. Bruno Vaz de Oliveira [in memorian], Dra. Marcela Salazar e Dra. Jéssica Medina) por permitirem que eu participasse de uma história tão linda como está sendo a desse fungo. A todos do Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE).
Ao programa de pós-graduação da Genética e Biologia Molecular da UNICAMP e às agências que me financiaram: CNPq (133660/2016-8) e FAPESP (n°2016/02792-0).
À minha família: Regina e Paulo (meus pais) que são meu exemplo de perseverança e força. Eu sinceramente acredito que a minha vontade em fazer com que as coisas deem certo é fruto da educação e fibra moral que herdei. Às minhas irmãs, Paula e Vitória, por me ensinarem a dividir comida, multiplicar risadas e amar incondicionalmente. Ao meu namorado, Giovanni, por todos os abraços, broncas, por confiar em mim quando nem eu mesma confiava e por todo o amor.
Agradeço à Deus pela vida plena e à Nossa Senhora por me segurar no colo quando eu preciso.
"Todo caminho da gente é resvaloso. Mas também, cair não prejudica demais A gente levanta, a gente sobe, a gente volta!... O correr da vida embrulha tudo, a vida é assim: Esquenta e esfria, aperta e daí afrouxa, Sossega e depois desinquieta. O que ela quer da gente é coragem. Ser capaz de ficar alegre e mais alegre no meio da alegria, E ainda mais alegre no meio da tristeza..."
RESUMO
A geração de energia através do uso de combustíveis fósseis dominou o cenário mundial no século 20. Entretanto, tal atividade antrópica acarretou alguns problemas ambientais, dentre os quais a emissão de gases responsáveis pelo aquecimento global tem sido motivo de grande preocupação nos dias atuais. Essa consequência obriga o desenvolvimento de novas tecnologias que buscam encontrar fontes de energia renováveis, sendo que uma das alternativas mais promissoras é o desenvolvimento de biocombustíveis lignocelulósicos. Um dos principais obstáculos para a viabilidade deste processo em escala industrial está relacionado à etapa de hidrólise enzimática, levando em conta o elevado custo dos coquetéis enzimáticos e o monopólio de empresas estrangeiras. A maior parte das enzimas utilizadas na produção destes coquetéis enzimáticos são produzidas por fungos filamentosos, sendo o Trichoderma reesei o mais utilizado nas formulações usadas pelas biorefinarias. Além do aprimoramento de fungos bem descritos, estudos de bioprospecção procurando identificar novas linhagens fúngicas produtoras de enzimas se fazem importantes para se obter ganhos de eficiência e tecnologias nacionais. O presente trabalho utilizou uma linhagem de Trichoderma erinaceum, a qual foi isolada pela empresa GranBio Celere, e teve como objetivos principais: 1) ensaios comparativos de atividade enzimática, hidrólise e exoproteômica em relação a linhagens referências (T. reesei WT e T. reesei RUT C30), 2) estudo da relação entre a secreção enzimática do fungo com complexidade do substrato e tempo de cultivo, 3) seleção de enzimas que fossem promissoras e distintas das descritas atualmente, intencionando um possível auxílio no aprimoramento dos coquetéis enzimáticos disponibilizados. Os ensaios de comparação demonstraram maior atividade enzimática específica do sobrenadante do cultivo de T. erinaceum para os grupos de xilanases, β-xilosidases, L-arabinofuranosidases, α-galactosidases e β-glicosidases e ao compararmos as identificações das enzimas, 133 proteínas identificadas em T. erinaceum foram exclusivas. Demonstrou-se também uma adaptação da secreção enzimática de T. erinaceum em função da complexidade da fonte de carbono (glicose, Avicel ®, Palha ou Cana Energia Integral pré-tratadas) e tempo do cultivo (96h, 120h e 144h), além da identificação de duas enzimas relacionadas ao fenótipo evidenciado com similaridade menor do que 65% em relação as encontradas em T. reesei, sendo estas inseridas em dois sistemas de expressão distintos.
ABSTRACT
Energy generation through the combustion of fossil fuels dominated the world scene in the 20th century. However, such anthropic activity had detrimental effects on the environment, in particular through the emission of gases responsible for global warming which is a cause of great concern these days. As a consequence, it is left to the new technologies to try to find renewable energy sources and one of the most promising alternatives is the development of lignocellulosic biofuels. One of the major obstacles to the industrial-scale viability of this process is related to the enzymatic hydrolysis of the lignocellulosic material, taking into account the high cost of enzymatic cocktails and the monopoly of foreign companies. Most of the enzymes used in the production of enzymatic cocktails are secreted by filamentous fungi and Trichoderma reesei is the most utilized in enzymatic formulations used by biorefineries. In addition to improving well-described fungi, bioprospecting studies seeking to identify new fungal strains producers of enzymes are important for an increase in efficiency and national technologies. The present work used a strain of Trichoderma erinaceum, which was isolated by the company GranBio Celere, and had as main objectives: 1) comparative tests of enzymatic activities, hydrolysis and exoproteomic in relation to reference strains (T. reesei WT and T. reesei RUT C30), 2) study of relation between enzymatic secretion of fungus with substrate complexity and time of cultivation, 3) selection of enzymes that were promising and distinct from those currently described, intending a possible aid in improvement of the available enzymatic cocktails. The comparison assays demonstrated a greater specific enzymatic activity of T. erinaceum culture supernatant for xylanases, xylosidases, α-L-arabinofuranosidases, α-galactosidases and β-glycosidases groups, and when comparing the enzyme identifications, 133 proteins identified in T. erinaceum were exclusive. An adaptation of the enzymatic secretion of T. erinaceum was also performed according to the complexity of the carbon source (glucose, Avicel ®, Straw or Integral Cane Integral pretreated) and culture time (96h, 120h and 144h), in addition to identification of two enzymes related to phenotype evidenced with a similarity of less than 65% in comparison to those found in T. reesei being these inserted into two different expression systems.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Média mensal da concentração de dióxido de carbono (1958 a 2017). Figura 2 Esquema demonstrando a produção de etanol de segunda geração.
Figura 3 Estruturação da parede celular vegetal desde a planta até os monômeros composicionais.
Figura 4 Polímero de celulose com a representação do arsenal enzimático necessário para degradação à molécula de glicose
Figura 5 Representação do polímero de xilana, composto principal da fibra de hemicelulose, e as enzimas necessárias para a degradação à xilose.
Figura 6 Isolamento e identificação de microrganismos encontrados em biomassa degradada em projeto da GranBio Celere.
Figura 7 Gráfico com atividade celulolítica total comparando os fungos isolados da biomassa degradada e o controle T. reesei a partir do cultivo em meio Mandels-Andreotti enriquecido com diversas fontes de carbono após 72 horas.
Figura 8 Microscopia óptica de cultivo líquido do fungo Trichoderma erinaceum (F3) realizado em meio Mandels-Andreotti enriquecido com biomassa pré-tratada após 6 dias de crescimento (aumento de 400x).
Figura 9 Gráfico representando a dosagem por Bradford da concentração de proteínas totais secretadas pelos fungos T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30 em meio contendo palha pré-tratada.
Figura 10 Gráfico referente ao ensaio de FPase comparativo entre os extratos de T. erinaceum, T. reesei e RUT C30 para dosagem de celulases totais secretadas por cada um destes em função da capacidade de hidrólise de papel filtro.
Figura 11 Gráfico referente ao ensaio de CMCase comparativo entre os extratos de T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30 para dosagem de endoglucanases totais secretadas por cada um destes em função da capacidade de hidrólise de carboximetilcelulose.
Figura 12 Gráfico referente ao ensaio comparativo entre os extratos de T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30 para dosagem de β-glicosidases totais secretadas por cada um destes em função da capacidade de hidrólise de celobiose.
Figura 13 Gráfico referente ao ensaio comparativo entre os extratos de T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30 para dosagem de xilanases totais.
Figura 14 Gráfico representativo do ensaio comparativo entre os extratos de T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30 referente à dosagem de beta-xilosidases totais.
Figura 15 Gráficos referentes as atividades enzimáticas encontradas nos três fungos (T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30) para os grupos responsáveis pela clivagem das cadeias arabinofuranosídicas e galactosídicas da hemicelulose.
Figura 16 Total de açúcares liberados (glicose, xilose, celobiose e xilobiose) a partir de uma hidrólise de 72h, 5% de sólidos totais e 2mg/g biomassa seca.
Figura 17 Gráfico representando a quantidade de identificações por espectrometria de massas das proteínas contidas no exoproteoma de T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30 e diagrama de Venn com os números de proteínas secretadas que são encontradas em comum entre os fungos.
Figura 18 Gel de poliacrilamida 15% contendo 10µg de cada uma das triplicatas biológicas dos sobrenadantes dos fungos T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30.
Figura 19 Divisão das enzimas secretadas pelos fungos T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30 de acordo com a classificação do banco de dados CAZy (Carbohydrate Active Enzymes).
Figura 20 Número de identificações total referente às famílias de Glicosil Hidrolases validadas em T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30.
Figura 21 Dosagem de proteínas totais dos extratos concentrados no tempo final de cultivo (72h Avicel e Glicose; 144h Palha e Cana Energia pré-tratadas).
Figura 22 Gel de poliacrilamida 15% contendo 10µg dos sobrenadantes do cultivo de T. erinaceum e gráfico representando o número total de proteínas identificadas e validadas nas diferentes condições de cultivo (Glicose, Avicel ®, Palha e Cana Energia integral pré-tratadas).
Figura 23 Número de proteínas identificadas em cada um dos grupos enzimáticos, relacionado à fonte de carbono do meio de cultivo e diagrama de Venn representando o número de enzimas em comum que foram encontradas nas diferentes condições (Glicose, Avicel ®, Palha e Cana Energia integral pré-tratadas).
Figura 24 Contagem de peptídeos únicos das xilanases e β-glicosidases encontradas na exoproteômica de T. erinaceum (F3) em função de todas as condições de cultivo.
Figura 25 Géis SDS PAGE 15% com as réplicas biológicas dos sobrenadantes do cultivo em Palha pré-tratada e Cana Energia integral pré-tratada coletados em 96h,120h e 144h (10µg em cada poço) e gráficos demonstrando o número de proteínas identificadas e validadas no experimento de espectrometria de massas em função do tempo de cultivo do fungo T. erinaceum nas duas condições analisadas.
Figura 26 Curvas referentes as atividades enzimáticas (FPásicas) de T. erinaceum a partir dos sobrenadantes de cultivos suplementados com diferentes complexidades de fontes de carbono (Avicel ®, Palha pré-tratada e Cana Energia pré-tratada) em diferentes tempos de coleta (24h, 48h, 72h ou 96h, 120h, 144h).
Figura 27 Curvas referentes as atividades enzimáticas (CMCásicas) de T. erinaceum a partir dos sobrenadantes de cultivos suplementados com diferentes complexidades de fontes de carbono (Avicel ®, Palha pré-tratada e Cana Energia pré-tratada) em diferentes tempos de coleta (24h, 48h, 72h ou 96h, 120h, 144h).
Figura 28 Curvas referentes as atividades enzimáticas (β-glicosídicas) de T. erinaceum a partir dos sobrenadantes de cultivos suplementados com diferentes complexidades de fontes de carbono (Avicel ®, Palha pré-tratada e Cana Energia pré-tratada) em diferentes tempos de coleta (24h, 48h, 72h ou 96h, 120h, 144h).
Figura 29 Curvas referentes as atividades enzimáticas (endoxilanásicas) de T. erinaceum a partir dos sobrenadantes de cultivos suplementados com diferentes complexidades de fontes de carbono (Avicel ®, Palha pré-tratada e Cana Energia pré-tratada) em diferentes tempos de coleta (24h, 48h, 72h ou 96h, 120h, 144h).
Figura 30 Esquema demonstrando como foi realizada a montagem dos cassetes para expressão das enzimas de T. erinaceum em T. reesei.
Figura 31 Placa contendo a levedura PE14Ura3Δ com um dos vetores montados (A- xilanase de T. erinaceum) em comparação ao controle negativo (B).
Figura 32 A- Placa contendo um dos fungos transformantes (à direita) em comparação com o controle negativo (à esquerda) em meio com restrição de uracila para seleção dos transformantes. B- Fungo transformante crescido em meio BDA. C- Gel de eletroforese contendo exemplos dos vetores digeridos com as enzimas de restrição correspondentes usados na transformação do fungo em comparação aos vetores fechados.
Figura 33 A- Primers utilizados para a confirmação da inserção e localização dos cassetes em T. reesei. B- Géis de eletroforese corados com brometo de etídeo evidenciando os fragmentos específicos amplificados para a confirmação dos transformantes.
Figura 34 Mapa do vetor utilizado nas construções referentes a expressão das proteínas em E. coli, demonstrando a região de inserção dos genes.
LISTA DE TABELAS
Tabela I Vendas nacionais de derivados de petróleo pelas distribuidoras comparando os anos de 2007 e 2016.
Tabela II Atividades enzimáticas dos fungos isolados selecionados em UI/mL a partir de um cultivo em palha, evidenciando o fungo de número 3 em relação às atividades de xilanases e β-glicosidases superiores ao controle T. reesei.
Tabela III Fragmentos necessários utilizados para a montagem dos cassetes em levedura utilizados posteriormente na transformação em T. reesei.
Tabela IV Composição da biomassa com pré-tratamento hidrotérmico utilizada na hidrólise dos fungos T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUT C30.
Tabela V Composição a partir dos resultados de caracterização das biomassas pré-tratadas hidrotermicamente utilizadas no cultivo de T.erinaceum (palha de cana-de-açúcar e Cana Energia Integral).
Tabela VI Tabela representando as sequências de xilanases e β-glicosidases encontradas nos experimentos da exoproteômica de T. erinaceum (independente da fonte de carbono), suas famílias glicosídicas correspondentes e sua similaridade em relação a cepa T. reesei.
Tabela VII Confirmação das montagens dos cassetes para expressão das proteínas provenientes de T. erinaceum usando como sistema de expressão o T. reesei e locais de inserção dos cassetes construídos.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA Auxiliary Activity
ANP Agência Nacional do Petróleo BDA Batata Dextrose Ágar
BGL Beta Glicosidase BSA Bovine Serum Albumin
CAZY Carbohydrate Active Enzymes CAZYmes Carbohydrate Active Enzymes CBH Cellobiohydrolase
CBIO Crédito de Descarbonização CBM Carbohydrate Binding Module CDH Cellobiose dehydrogenase
CE Cana Energia
CMC Carboximetilcelulose CMCase Carboximetilcelulase
CONAB Companhia Nacional de Abastecimento DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico DNS Ácido 3,5-dinitrosalicílico
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EG Endoglucanase
EPE Empresa de Pesquisa Energética FPU Filter Paper Unit
GH Glycoside Hydrolase
GLOX Glyoxal oxidase
GLP Gás Liquefeito de Petróleo QAV Querosene para Aviação
HPAEC-PAD High performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection
HPLC High Performance Liquid Chromatrography IEA Instituto de Economia Agrícola
IPCC Intergovernmental Panel on Climate Change
ISHAM The International Society for Human & Animal Mycology
ITS Internal Transcribed Spacer
LC Liquid Chromatography
LPMO Lytic polysaccharide monooxygenases MWCO Molecular weight cut-off
NASA National Aeronautics and Space Administration NHEJ Non-homologous end joining
NREL National Renewable Energy Laboratory NSIDC National Snow and Ice Data Center
OPEP Organização dos Países Exportadores de Petróleo ORF Open reading frame
PCR Polymerase Chain Reaction PDB Protein Data Bank
PL Polysaccharide Lyase
p-NP p-nitrofenol PPM Partes por milhão
RDP Ribosomal Database Project
SDS PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
TEF Translation elongation factor
UI Unidade Internacional
UNICA União da Indústria de Cana-de-açúcar
UV Ultravioleta
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL ... 18
1.1. Uso de combustíveis fósseis e aquecimento global ... 18
1.2. Potencial brasileiro na produção de biocombustíveis ... 20
1.3. A produção de etanol de segunda geração ... 21
1.4. Bioprospecção de microrganismos do ambiente ... 27
2. JUSTIFICATIVA ... 31 3. OBJETIVOS ... 32 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 33 4.1. Cultivo ... 33 4.2. Ensaios enzimáticos ... 33 4.2.1. Ensaio FPase ... 33 4.2.2. Ensaio de Carboximetilcelulase ... 34 4.2.3. Ensaio de Xilanase ... 34
4.2.4. Ensaios de β- Glicosidase, β-Xilosidase, α-Galactosidase e α-L-arabinofuranosidase ... 35
4.3. Dosagem de Proteínas e gel de SDS Page ... 35
4.4. Ensaio de hidrólise enzimática ... 36
4.5. Determinação da concentração de glicose e xilose em HPLC ... 36
4.6. Análise estatística ... 36
4.7.Espectrometria de massas ... 37
4.8. Clonagem dos genes de interesse em Trichoderma reesei...38
4.8.1. Amplificação dos fragmentos de interesse ... 38
4.8.2.Montagem dos cassetes em levedura e isolamento do plasmídeo ... 39
4.8.3. Preparação dos protoplastos e transformação em T. reesei ... 39
4.9. Montagem dos cassetes em E. coli... .40
CAPÍTULO 1: Comparação entre T. erinaceum (F3) e T. reesei (WT e RUT C30) ... 41
1.INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ... 42
2.RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 44
2.1.Dosagem de proteínas totais e dosagens enzimáticas ... 44
2.2.Hidrólise Enzimática ... 49
2.3. Identificação de enzimas por espectrometria de massas ... 52
3. CONCLUSÕES PARCIAIS...57
CAPÍTULO 2:Secreção de enzimas de T.erinaceum em função da nutrição ... 61
1.INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ... 62
2.RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 63
2.1. Análise de T. erinaceum em diferentes fontes de carbono ... 63
2.3.Exoproteômica do cultivo de T.erinaceum por espectrometria de massas ... 65
2.4. Secreção de T. erinaceum em Palha e Cana Energia pré-tratadas ... 69
2.5 Secreção de T. erinaceum em função do tempo de cultivo ... 70
2.6 Atividade enzimática em função da fonte de carbono ... 71
3. CONCLUSÕES PARCIAIS ... 77
CAPÍTULO 3:Seleção de enzimas e sistemas de expressão ... 78
1.INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ... 79
2.RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 81
2.1. Escolha de genes de interesse ... 81
2.2.Montagem dos cassetes para expressão em Trichoderma reesei ... 83
2.3. Montagem dos cassetes para expressão em E. coli...87
3. CONCLUSÕES PARCIAIS ... 88 5. CONCLUSÕES FINAIS ... 89 6. REFERÊNCIAS ... 90 APÊNDICE A ... 100 APÊNDICE B ... 112 ANEXO A...126 ANEXO B...127
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1 . Uso de combustíveis fósseis e aquecimento global
A produção de combustíveis fósseis para fornecimento de energia dominou o cenário mundial no século 20, principalmente depois do surgimento dos motores de combustão interna (GOLDEMBERG, 2009). Decorrente a isso, o aumento da frota de carros mundial foi crescente a partir de então e consequentemente, o uso desses combustíveis também. Baseando-se apenas no caso do Brasil em 9 anos, a venda de combustíveis derivados de petróleo aumentou de 88 mil m³ em 2007 para mais de 120 mil m³ em 2016 (ANP, 2017) (Tabela I).
Tabela I: Vendas nacionais de derivados de petróleo pelas distribuidoras comparando os anos de 2007 e 2016
Derivados de petróleo
Vendas nacionais pelas
distribuidoras (mil m3) 2007 2016 Total 88,419 120,856 Gasolina C 24,325 43,019 Gasolina de aviação 55 57 GLP 12,034 13,398 Óleo combustível 5,525 3,333 Óleo diesel 41,558 54,279 QAV 4,891 6,765 Querosene Iluminante 31 6 Fonte: ANP/SAB.
Tais atividades antrópicas acarretam na emissão de gases produtos da queima de derivados de petróleo, aumentando as concentrações de dióxido de carbono (CO2), metano
(CH4) e óxido nitroso (N2O) na atmosfera e sendo esses gases relacionados a um dos efeitos
que mais preocupam a comunidade científica atualmente: o aquecimento global (HANSEN et al., 2000; CROWLEY, 2010; COOK et al., 2013). Nos últimos 50 anos, a concentração desses gases, principalmente o CO2, aumentou cerca de 90 ppm na atmosfera, representando
Figura 1: Médias das concentrações mensais de dióxido de carbono na atmosfera no período entre 1958 a 2017 (Mauna Loa Observatory, Hawaii).
O aquecimento global é o aumento da temperatura média da camada de ar próxima a superfície da Terra. A maior parte do aquecimento ocorreu nos últimos 35 anos, com 16 dos 17 anos mais quentes registrados desde 2001. Não só 2016 foi o ano mais quente registrado, mas oito dos 12 meses que compõem o ano - de janeiro a setembro, com exceção de junho – foram também os mais quentes para os respectivos meses (NASA, 2016). Como consequência, o aumento da temperatura tem elevado o nível do mar devido ao derretimento das calotas polares podendo ocasionar o desaparecimento de ilhas e cidades litorâneas densamente povoadas quando em maiores proporções e podendo resultar em uma maior frequência e magnitude de eventos extremos climáticos (RISSER; WEHNER, 2017). Desde 1900, o nível do mar aumentou globalmente em média 19 centímetros, sendo que a taxa de aumento acelerou nas últimas décadas, colocando em risco uma série de ilhas e países de baixa altitude (NSIDC, 2015).
Estudos também sugerem fortemente que um impacto significativo do aquecimento global já é discernível nas populações de animais e plantas, podendo isso facilmente perturbar as conexões entre as espécies e levar a uma reformulação das comunidades, refletindo mudanças e possivelmente extinções (ROOT et al., 2003). Além disso, a quantidade de dióxido de carbono absorvida pela camada superior dos oceanos está aumentando em cerca de 2 bilhões de toneladas por ano, ocasionando o efeito de acidificação
do oceano e também favorecendo a mudança na dinâmica da vida marinha (SABINE et al., 2004).
Atualmente, aproximadamente 87% da demanda energética é satisfeita a partir da produção de combustíveis fósseis. Embora a Agência Internacional de Energia (IEA) preveja que esse percentual diminuirá para 75%, o consumo total de combustíveis fósseis somará ainda mais 6 gigatoneladas (Gt) de carbono lançados como produto para a atmosfera até 2035. (IPCC, 2014).
Considerando que o suprimento de energia tem importância fundamental para a manutenção das atividades da sociedade moderna e que o petróleo mesmo provendo grande parte da energia primária do planeta, ocasiona consequências ambientais e sociopolíticas drásticas, o uso de combustíveis de origem renovável, como o bioetanol, vem ganhando destaque como uma solução, sendo possivelmente a evolução do sistema energético.
1.2. Potencial brasileiro na produção de biocombustíveis
O Brasil diante desse cenário se destaca como um potencial produtor de combustíveis renováveis. Esse interesse na substituição de combustíveis de origem fóssil surgiu com o programa ProÁlcool que visava a troca em larga escala dos produtos oriundos do petróleo, devido principalmente a dois grandes aumentos no preço dos barris: em 1974 por causa da criação da Organização dos Países Exportadores de Petróleo (OPEP) e 1979, em decorrência da Guerra do Golfo Pérsico entre Irã e Iraque, sendo que o barril passou de 1,9 dólar/barril em 1972 para 30,5 dólares/barril em 1980. Tais fatos viabilizaram outras opções energéticas, provocando um novo impulso do álcool combustível (CORTEZ, 2016).
De 1975 a 2000, foram produzidos cerca de 5,6 milhões de veículos movidos a álcool hidratado. Além disso, foi adicionada uma fração de álcool anidro (entre 1,1% a 25% em volume) à gasolina consumida por uma frota superior a 10 milhões de veículos o que favoreceu a diminuição de 110 milhões de toneladas de carbono emitidos (EPE, 2007).
Com essa crescente demanda por etanol, se faz necessário o aumento da produção, inclusive para exportação, preservando o ambiente, biodiversidade e o uso de terras. Uma das possibilidades encontradas para esse incremento da produção é o uso de biomassa lignocelulósica como bagaço e palha da cana-de-açúcar para geração de etanol, sendo esse processo conhecido como segunda geração (BON et al.,2008).
Dessa forma, o Brasil se torna um candidato forte a pioneirismo por ser um grande produtor de cana-de-açúcar (estima-se que para a safra 2017/18 a produção será de 647,6 milhões de toneladas) (CONAB, 2017) e consequentemente um grande produtor de biomassa residual, por ter um clima favorável e possibilidade de safra o ano todo, além de alta produtividade, o que abriria vantagem em relação a outros países quanto à produção de etanol de segunda geração (UNICA, 2018).
Além disso, nosso país possui políticas públicas recém-instauradas como a política de Estado do Renovabio, que tem como objetivos fornecer uma contribuição aos compromissos determinados pelo Brasil no Acordo de Paris (COP21), promovendo a expansão dos biocombustíveis na matriz energética e assegurando a previsibilidade do mercado de combustíveis, induzindo ganhos na eficiência, produção e comercialização e redução na emissão de gases causadores do aquecimento global (Ministério de Minas e Energia, 2017; MARQUES, 2018). O programa possivelmente contribuirá com o aumento da produção de biocombustíveis no país em uma regulamentação que prevê a compra de Créditos de Descarbonização (CBIOs) pelas distribuidoras de combustíveis e emitidos por produtores e importadores (TOLEDO, 2017).
1.3. A produção de etanol de segunda geração
O processo de produção de etanol de primeira geração é realizado por um método de fermentação a partir de açúcares encontrados em materiais como milho, beterraba, batata e cana-de-açúcar. No caso da cana, o caldo extraído e purificado pode ser submetido ao processo de fermentação com o uso de leveduras, principalmente a Saccharomyces cerevisiae que metaboliza a glicose gerando etanol e gás carbônico (GOLDEMBERG; GUARDABASSI, 2010).
Para a produção de etanol de segunda geração, entretanto, se utiliza como matéria-prima inicial fibras vegetais, exigindo assim, etapas adicionais de pré-tratamento e hidrólise do material lignocelulósico para a liberação de monossacarídeos fermentescíveis (PEREIRA, 2012) (Figura 2).
A eficiência final do processo está correlacionada à essas duas etapas, o pré-tratamento é dependente da natureza da biomassa e consequentemente, o coquetel enzimático para a hidrólise acompanha essa adequação, sendo que a heterogeneidade e a complexidade dos materiais lignocelulósicos constituem um desafio para a produção de bioetanol de
maneira sustentável e economicamente atraente. Devido a essa complexidade na estrutura da biomassa, muitos processos têm sido desenvolvidos no intuito de converter os carboidratos em açúcares fermentescíveis, buscando por melhores rendimentos e menores custos operacionais (ALVIRA et al., 2010).
Figura 2: Esquema demonstrando a produção de etanol de segunda geração, evidenciando as etapas de pré-tratamento da biomassa e hidrólise enzimática, que são adicionais ao processo de primeira geração. (Adaptado de Revista FAPESP. Entre açúcares e genes- Outubro 2012).
Materiais lignocelulósicos são estruturalmente rígidos por serem formados a partir de uma matriz de polissacarídeos, sendo esta constituída de fibras de celulose envolvidas em uma região amorfa de hemicelulose e lignina (SANTOS et al, 2012; DIAS et al, 2012). A composição química da biomassa lignocelulósica geralmente contém 35-50% de celulose, seguido de 20-35% de hemicelulose, 10-25% de lignina e uma pequena quantidade de cinzas e extrativos (PU et al., 2013).
Biomassa Pré-tratamento Hidrólise Biomassa
Fermentação Destilação
A celulose, por sua vez, é composta por um polímero linear com até 15.000 unidades de hexoses unidas por ligações glicosídicas β-1,4 (BON et al., 2008). Cada par dessas hexoses é definido como celobiose, unidade conformacional mínima da celulose, sendo a glicose a unidade fundamental da cadeia homopolimérica (HARGREAVES, 2008). Essas cadeias podem ser unidas por ligações de hidrogênio, o que gera a formação de microfibrilas que determinam a partir do grau de cristalinidade e associação a outros polímeros, a suscetibilidade da molécula à hidrólise enzimática (VAN SOEST, 1994).
As hemiceluloses, por outro lado, são heteropolissacarídeos compostos por D-glicose, D-galactose, D-manose, D-xilose, L-arabinose, ácido D-glicurônico e ácido 4-O-metil-glicurônico, sendo que a estrutura apresenta ramificações que possibilitam a interação com a celulose, dando estabilidade e flexibilidade à fibra (RAMOS, 2003).
A lignina é um heteropolímero amorfo que consiste em três diferentes unidades de fenilpropanos: álcool p-cumarílico, álcool coniferílico e álcool sinapílico. A estrutura da lignina não é homogênea, pois possui regiões amorfas e estruturas globulares. No processo de hidrólise enzimática, a lignina atua como uma barreira física para as enzimas que podem ser irreversivelmente capturadas, aumentando assim a quantidade de enzima requerida no processo (LU et al., 2002) (Figura 3).
Figura 3: Estruturação da parede celular vegetal desde a planta até os monômeros composicionais. Os polímeros de celulose, hemicelulose e lignina formam as macrofibrilas que conferem a resistência ao tecido (RUBIN, 2008).
Essa complexa estrutura restringe a ação enzimática e a acessibilidade microbiana (PU et al., 2013). Um pré-tratamento eficiente visa o aumento da superfície de contato e porosidade do material celulósico, liberando os carboidratos de sua associação com a lignina, o que possibilita a hidrólise e posteriormente a formação de monômeros para a fermentação (KARAGÖZ et al., 2012).
Durante o pré-tratamento do material lignicelulósico, a hemicelulose e parte da lignina são solubilizadas, enquanto parte da celulose é despolimerizada. Muitos tipos de pré-tratamento podem ser utilizados: químicos, físicos, físico-químicos e biológicos, possibilitando assim, uma adaptação dessa etapa em relação à natureza da biomassa e quantidade final de inibidores de fermentação (MUSSATTO et al., 2010).
A partir do pré-tratamento é necessária a etapa de hidrólise para conversão de açúcares complexos em monômeros (principalmente glicose e xilose). Isso exige a ação de enzimas, dentre elas as celulases e hemicelulases (TOQUERO; BOLADO, 2014), sendo que essas agem de forma sinérgica, diferindo entre si pela região que atuam e a maneira como hidrolisam o polissacarídeo.
As celulases formam um grupo de enzimas classificadas a partir das reações por ela catalisadas, incluindo as endoglucanases ou carboximetilcelulases, exoglucanases ou celobiohidrolases e β-glicosidases. O fato de agirem sinergicamente representa um importante papel durante o processo de hidrólise (LAN et al., 2013). As endoglucanases agem clivando as ligações β-1,4-glicosídicas entre moléculas de glicose, catalisando desta forma a hidrólise de regiões internas da molécula de celulose (ZHANG; LYND, 2004). Essa clivagem promove o aparecimento tanto de extremidades redutoras quanto de extremidades não redutoras, propiciando a ação das celobiohidrolases, sendo que as celobiohidrolases de classe I agem em extremidades redutoras e as de classe II em extremidades não redutoras, liberando oligossacarídeos de glicose, em geral celobioses (formadas por duas moléculas de glicose) (BUSSAMRA, 2014; ZHAO et al., 2015). A partir disso a β-glicosidase hidrolisa moléculas de celobiose em unidades de glicose, sendo a atividade desta de extrema importância, dado que ela reduz o efeito inibitório da celobiose sobre as endoglucanases e celobiohidrolases (DUFF; MURRAY, 1996).
Um grupo de enzimas recentemente caracterizado é o das enzimas monooxigenases (lytic polysaccharide monooxygenases / LPMOs). Essas funcionam em conjunto com as enzimas do sistema clássico de degradação de polissacarídeos através de uma via oxirredutiva. Com isso, a partir de um sistema de transferência de elétrons envolvendo fenóis ou celobiose desidrogenases, há uma quebra de polissacarídeos recalcitrantes o que auxilia o
processo de hidrólise e contribui para um maior rendimento final de açúcares (KRACHER et al., 2016) (Figura 4).
Figura 4: Polímero de celulose com a representação do arsenal enzimático necessário para degradação à molécula de glicose. (EG=Endoglucanase, CBH=celobiohidrolase, BGL= Beta-glicosidase, CDH=celobiose desidrogenase, LPMO= lytic polysaccharide monooxygenase) (COSTA, 2016) .
Em relação à hidrólise das hemiceluloses, também é requerida uma grande quantidade de enzimas específicas, sendo essa quantidade maior quando comparada as celulases, dado que a fibra de hemicelulose contém mais moléculas anexas que exigem enzimas específicas para a clivagem.
Da mesma forma que agem as celulases, as hemicelulases promovem uma catálise conjunta. As endo-1,4-β-D-xilanases hidrolisam as ligações xilosídicas β (1-4) promovendo a formação de xilanas e ocasionando a conversão das xilanas em monossacarídeos de xilose pela ação das 1,4-β-D-xilosidases a partir dos terminais não redutores. Além disso, as endo-1,4-β-D-mananases clivam ligações internas, convertendo manooligosacarídeos a manose, as acetil xilana esterases clivam ligações éster carboxílicas da cadeia o que leva a formação de álcool e acetato como produtos e as α-L-arabinofuranosidases catalisam a hidrólise de ligações arabinofuranosídicas. Enzimas como a acetil xilana esterase, α-L-arabinofuranosidase, α-galactosidase, α-glucuronidase e feruloil esterase são responsáveis pela remoção de grupos laterais presentes nas cadeias de hemicelulose (Figura 5). Com isso, após o processo de hidrólise, grande parte da hemicelulose é convertida principalmente em monômeros de xilose (GILEAD; SHOHAM, 1995; BEG et al., 2001).
Figura 5: Representação do polímero de xilana, composto principal da fibra de hemicelulose e as enzimas necessárias para a degradação à xilose. O número de enzimas é muito superior quando comparada à degradação de celulose, pois a fibra de hemicelulose contém uma quantidade maior de moléculas anexas que exigem enzimas específicas para a clivagem (SOUZA, 2013).
Visando uma melhora em estudos relacionados à degradação de carboidratos, desde 1998 é disponibilizada a plataforma conhecida como CAZy (Carbohydrate Active Enzymes) que é a base de dados especializada e dedicada a exibição e análise de informações genômicas, estruturais e bioquímicas sobre CAZymes. Nessa base de dados, as enzimas de degradação são agrupadas de acordo com a ação destas sobre o carboidrato em 5 grupos principais: Glicosil Hidrolases (GH), Glicosil Transferases (GT), Polissacarídeo-liases (PL), Esterases de carboidratos (CE) e as com Atividade Auxiliar (AA).
As enzimas classificadas como Glicosil Hidrolases são responsáveis pela hidrólise e/ou rearranjo de ligações glicosídicas. Na maioria dos casos, a hidrólise da ligação glicosídica é catalisada por dois resíduos de aminoácidos da enzima: um ácido geral (doador de próton) e um nucleófilo/base (DAVIES; HENRISSAT, 1995). As Glicosil Transferases, por outro lado, formam ligações glicosídicas, enquanto as liases clivam ligações não glicosídicas e as esterases hidrolisam apenas ésteres oriundos de polissacarídeos (SINNOT, 1990).
O grupo de enzimas de atividade auxiliar engloba todas as enzimas que agem em conjunto com as CAZymes por via oxirredutiva, inclusive as oxidases. Atualmente são assim classificadas 8 famílias de enzimas lignolíticas e 3 famílias de LPMOs (KRACHER et al., 2016). As enzimas de degradação da lignina podem não atuar de forma direta no carboidrato, porém, como a lignina se encontra invariavelmente associada a carboidratos na parede da planta, essas enzimas auxiliam o mecanismo clássico de degradação.
Um coquetel enzimático eficiente deve conter uma mistura de celulases, hemicelulases e ligninases capazes de agir de forma sinérgica, visando um rendimento maior de açúcares fermentescíveis ao final da hidrólise. Devido a esta complexidade, são poucas as empresas que obtiveram sucesso em desenvolver coquetéis enzimáticos eficientes e com um custo viável. Esse é praticamente um monopólio de empresas estrangeiras, o que caracteriza um dos gargalos da produção de biocombustíveis lignocelulósicos em escala industrial, por representar a etapa de maior custo operacional no processo (MACRELLI et al., 2012; AMORIM et al., 2011).
Dessa forma, o desenvolvimento de tecnologias próprias para hidrólise se torna crucial para o sucesso desta indústria no Brasil (SANTOS et al., 2015), ainda mais se considerarmos que para a etapa de fermentação há cepas nacionais modificadas de Saccharomyces cerevisiae que além de consumir a glicose proveniente da celulose, consomem também a xilose vinda da hemicelulose (SANTOS et al., 2016).
Esses coquetéis são feitos a partir de enzimas secretadas principalmente por fungos filamentosos, sendo alguns mais amplamente estudados como os gêneros Trichoderma, Aspergillus e Penicillium (BŁASZCZYK et al., 2014; PIROTA et al., 2014). Porém, trabalhos envolvendo bioprospecção de enzimas se fazem importantes ao abrir novas possibilidades no aprimoramento desses coquetéis.
1.4. Bioprospecção de microrganismos do ambiente
O conceito de bioprospecção está relacionado ao fato de se extrair valor econômico da biodiversidade, sendo essa uma busca sistemática por organismos, genes, enzimas, compostos, processos ou até recursos genéticos que podem levar ao desenvolvimento de um produto (SACCARO, 2011).
O etanol de segunda geração é uma alternativa viável para aumento da produção, com a adição de duas etapas ao processo de primeira geração. Porém, a produção de segunda
geração tem alguns limitantes principais como a queima natural da palha no armazenamento (Portal de Notícias Globo- G1, 2015) ou a degradação desta por microrganismos do ambiente também no procedimento de estocagem.
Considerando esses aspectos, um projeto da empresa GranBio Celere, buscou o isolamento e identificação de diferentes microrganismos selvagens capazes de hidrolisar materiais lignocelulósicos a partir de amostras de palha que estavam em decomposição na usina. Isso tinha por objetivo auxiliar o aprimoramento do processo de hidrólise, considerado um dos gargalos da produção em larga escala, sendo que os esforços da comunidade acadêmica e industrial estão voltados ao desenvolvimento de tecnologias nacionais.
Amostras foram coletadas na Estação Experimental da GranBio (BioVertis), localizada no município de Barra de São Miguel (Alagoas - 09º50'24" de latitude sul e 35º54'28" de longitudeoeste). Os materiais selecionados para coleta foram colmos de cana-de-açúcar, cana-energia e palha, todos eles em diferentes estágios de decomposição (Figura 6).
Figura 6: Isolamento e identificação de microrganismos encontrados em biomassa degradada em projeto da GranBio Celere (Adaptado de Silva et al – em submissão).
A partir do isolamento de 8 fungos provenientes da palha em meio BDA (Ágar Batata Dextrose), estes foram induzidos enzimaticamente em diversas fontes de carbono. Considerando que a produção enzimática de fungos filamentosos sofre influência do meio de cultivo, foram testadas 3 fontes: carboximetilcelulose (CMC), celulose microcristalina (Avicel ®) e palha pré- tratada por explosão a vapor com farelo de soja 3g/L, todos em uma concentração de 15g/L.
A partir dos secretados, o método de seleção de possíveis fungos candidatos foi o ensaio de FPase (Filter Paper Unit) recomendado por Ghose (1987). Nos ensaios realizados, dos 8 fungos isolados apenas os fungos 1, 2, 3, 6 e 7 mostraram-se eficientes com uma atividade próxima ao controle T. reesei selvagem, modelo de estudo e amplamente utilizado em pesquisas relacionadas (Figura 7).
F u n g o 1 F u n g o 2 F u n g o 3 F u n g o 4 F u n g o 5 F u n g o 6 F u n g o 7 F u n g o 8 T . re e se i U I/m L 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 CMC Avicel
Cana Pré-tratada e farelo de soja
Figura 7: Atividade celulolítica total comparando os fungos isolados da palha com o controle T. reesei em meio Mandels enriquecido com diversas fontes de carbono após 72 horas de cultivo (Adaptado de Silva et al – em submissão).
A partir dos 5 fungos selecionados pelo ensaio de FPase, os ensaios específicos de atividade enzimática foram realizados (Tabela II) – xilanase, endoglucanase e β-glicosidase com os sobrenadantes dos cultivos realizados em palha pré-tratada com farelo de soja.
Tabela II: Atividades enzimáticas dos fungos isolados selecionados em UI/mL a partir de cultivo em palha pré-tratada e farelo de soja evidenciando o fungo de número 3 em relação às atividades de xilanases e β-glicosidases superiores ao controle T. reesei
Fungo Selecionado
Xilanases Endoglucanases β-glicosidases
1 3.97 ± 0.3 0.39 ± 0.03 0.14 ± 0.01 2 19.32 ± 0.09 0.73 ± 0.03 0.27 ± 0.01 3 249.79 ± 0.31 2.36 ± 0.12 1.13 ± 0.07 6 259.47 ± 0.78 3.40 ± 0.18 0.15 ± 0.01 7 100.75 ± 0.57 2.35 ± 0.39 0.96 ± 0.04 T. reesei 102.06 ± 0.02 2.85 ± 0.39 0.12 ± 0.01
O ensaio de xilanase analisa a capacidade enzimática dos fungos em degradar principalmente hemicelulose, sendo esse um grupo de enzimas que atuam sobre as xilanas, polissacarídeos provenientes de tal heteropolímero
.
Os fungos que mostraram maior atividade foram os fungos 3 e 6 quando cultivados em palha. Outro ensaio específico foi a dosagem da atividade de endoglucanases (CMCase) que evidenciam o grupo de enzimas que atuam primariamente sobre a celulose. Os fungos 3, 6 e 7 foram os que tiveram uma atividade mais próxima ao controle, enquanto que no ensaio enzimático realizado de β- glicosidase, os que tiveram uma maior atividade foram os fungos 3 e 7. Esse grupo enzimático é responsável em hidrolisar celobiose (solúveis) em moléculas de glicose.Após uma seleção baseada em fenótipos relacionados a aumento de atividade enzimática em relação ao fungo controle, realizou-se uma identificação dos fungos isolados por taxonomia molecular através das regiões ITS- Internal Transcribed Spacers 1 e 2 utilizando os primers universais ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC). As sequências determinadas por Sanger foram alinhadas contra os seguintes bancos de dados de referência na web: The International Society for Humam and Animal Mycology (ISHAM), CBS Fungal Barcoding e Michigan State University Ribosomal Database Project (RDP). Para o fungo número 3, a identidade da espécie ainda foi confirmada pela amplificação e sequenciamento de uma região final do gene TEF (translation elongation factor).
Figura 8: Microscopia óptica de um cultivo líquido do fungo Trichoderma erinaceum (F3) em biomassa pré-tratada após 6 dias de crescimento (Aumento de 400x).
A partir dos resultados positivos apresentados, a identificação das possíveis diferenças enzimáticas da linhagem de fungo T. erinaceum (F3) em relação ao controle Trichoderma reesei se faz de extrema necessidade. A compreensão deste mecanismo eficiente de hidrólise poderia auxiliar com o enriquecimento de coquetéis enzimáticos já existentes ou na formulação de novos coquetéis contribuindo na viabilidade do processo de produção industrial de hidrolisados lignocelulósicos.
2. JUSTIFICATIVA
Considerando a importância do desenvolvimento de energias alternativas em substituição ao uso de recursos não renováveis e a dificuldade encontrada no processo de hidrólise - etapa essencial para a obtenção de biocombustíveis de segunda geração - o melhoramento dos coquetéis enzimáticos a partir do incremento com novas enzimas somado à manipulação genética de fungos filamentosos se fazem essenciais para a biotecnologia relacionada.
Para isso, a identificação de microrganismos, mas também enzimas capazes de hidrolisar eficientemente materiais lignocelulósicos torna-se substancial, visando um barateamento do processo como um todo e contribuindo para viabilidade da produção industrial de biocombustíveis. Dentro desse cenário, a linhagem de Trichoderma erinaceum (F3) selecionada torna-se promissora ao considerarmos sua eficiência comprovada a partir de ensaios preliminares específicos de atividade enzimática.
3. OBJETIVOS
O presente trabalho visou a identificação das diferentes enzimas capazes de hidrolisar materiais lignocelulósicos produzidas por uma linhagem de Trichoderma erinaceum, que foi apontada quantitativamente em ensaios específicos preliminares como melhor produtor enzimático comparado com a espécie de referência Trichoderma reesei. Para tanto, os seguintes objetivos específicos foram:
- Ensaios comparativos entre T. erinaceum (F3), T. reesei WT e RUTC 30 em relação à dosagens enzimáticas e proteicas, além do ensaio de hidrólise e identificação das diferentes enzimas por espectrometria de massas.
- Padronização do cultivo da linhagem de T. erinaceum (F3) em diferentes fontes de carbono (palha de cana-de-açúcar pré-tratada, Cana Energia integral pré-tratada, Avicel ® e Glicose) para identificação das enzimas secretadas nas diversas condições a partir de espectrometria de massas.
- Montagem dos sistemas de expressão em T. reesei e E.coli com as potenciais enzimas relacionadas ao fenótipo diferenciado encontradas em T. erinaceum.
4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Cultivo
O fungo T. erinaceum (F3) foi isolado a partir de amostras de palha de cana em decomposição coletadas na Estação Experimental da GranBio (BioVertis), localizada no município de Barra de São Miguel (Al).
Para todos os experimentos realizou-se a mesma metodologia de cultivo. Os fungos foram inoculados em meio BDA (ágar batata dextrose) em estufa a 30°C por aproximadamente 7 dias ou até sua esporulação. A coleta dos esporos foi realizada com Triton 0,1% e estes inoculados em uma concentração de 500 µL a 107 em 200 mL (em triplicata) de meio Mandels-Andreotti (1978) [(NH4)2SO4 1,4 g/L; KH2PO4 2,0 g/L; MgSO4*7H2O 0,3 g/L;
CaCl2*2H2O 0,3 g/L; uréia 0,3 g/L; peptona 1g/L; FeSO4*7H2O 5 mg/L; MnSO4 * H2O
1,6mg/L; ZnSO4* 7H2O 1,4mg/L; CoCl2*2H2O 2mg/L] enriquecido com uma única fonte de
carbono [Palha de Cana-de-Açúcar pré-tratada, Cana-Energia integral pré-tratada, Avicel ® ou Glicose (10 g/L)].
A biomassa utilizada foi pré-tratada em dois estágios, sendo o processo acompanhado e as amostras cedidas pela empresa BioCelere (subsidiária da GranBio). No pré-tratamento o material passou por explosão a vapor a 200 °C por 5 minutos no primeiro estágio (em uma pressão de 16 a 17 bar) e 165°C por 5 minutos no segundo estágio (em uma pressão de 8 a 9 bar). A única distinção entre o pré-tratamento da palha de cana-de-açúcar e da Cana Energia integral foi a proporção biomassa e água, sendo que em palha é 1:6 e em cana 1:9. Para o uso destas biomassas nos cultivos, o material passou por lavagem para retirada de açúcares residuais solúveis e inibidores produzidos durante o pré-tratamento, além de seco em forno a 45°C por aproximadamente 1 dia. A umidade foi medida visando ajustar o peso seco de biomassa necessário nos experimentos.
A coleta do sobrenadante compreendeu as enzimas secretadas em até 144 horas após inoculação. O isolamento do sobrenadante foi realizado por filtração comum em papel filtro qualitativo (Whatman n°1).
4.2. Ensaios enzimáticos
4.2.1. Ensaio FPase
Grande parte dos ensaios enzimáticos no presente trabalho baseou-se na metodologia proposta por Ghose (1987), que permite que a partir da regressão de uma
curva-padrão contendo um açúcar redutor (produto da reação) e ácido dinitro-salicílico (DNS), tenha-se uma inferência da atividade enzimática do secretado em função do substrato expressa em unidade internacional (UI) por mL. Tal unidade corresponde à 1µmol de produto formado a cada minuto.
O método de medição para atividade total de celulases foi o FPase (Filter Paper Unit) adaptado para leitura em microplaca. Para tal, papel filtro qualitativo (5mg) foi adicionado a 100 µL do extrato enzimático contendo 50µL de citrato de sódio 50mM pH 5,0 e a reação foi incubada por 1 hora a 50°C.
A reação foi parada com a adição de 300µL de DNS (NaOH 16 g/L; tartarato de sódio e potássio tetrahidratado 300 g/L; DNS 10g/L) seguido de fervura (100°C) por 5 minutos. A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro a 540nm em volume final de 2 mL. Tal técnica permitiu a análise da quantidade de glicose gerada a partir da reação do sobrenadante dos cultivos e 5mg de papel filtro qualitativo no tempo de 60 minutos, convertido ao fim em atividade enzimática (UI/mL ou µM/min/mL) e normalizada pela quantidade final de proteína secretada (UI/mg proteína).
4.2.2. Ensaio de Carboximetilcelulase
A atividade das endoglucanases foi feita utilizando o substrato carboximetilcelulose (CMC). O experimento se dá pela adição de 20 μL de extrato enzimático com 180 μL de CMC (1%) e incubação por 30 minutos a 50°C. A reação foi interrompida com 300 μL de DNS e fervura (100°C) por 5 minutos. A leitura foi também realizada em leitor de microplaca em 540nm e a atividade endoglucanásica foi determinada a partir da curva padrão de glicose e normalizada pela quantidade de proteína total secretada.
4.2.3. Ensaio de Xilanase
A atividade de xilanase foi determinada a partir da incubação por 10 minutos a 50 °C de 20 μL do extrato enzimático com 180 μL do substrato beech wood xilana (1%), adequando as diluições do extrato em relação a posterior leitura em sua faixa de confiabilidade em leitor de microplaca. Posteriormente, a reação foi interrompida com 300 μL de DNS e fervura (100°C) por 5 minutos. A leitura foi realizada em 540 nm e a absorbância convertida em atividade enzimática (UI/mL ou µM/min/mL) e normalizada por quantidade de proteína a partir da quantidade de xilose encontrada através da regressão linear.
4.2.4. Ensaios de β- Glicosidase, β-Xilosidase, α-Galactosidase e α-L-arabinofuranosidase
O método para os ensaios de β- Glicosidase, β-Xilosidase, α-arabinofuranosidase e α-Galactosidase baseia-se na ação dos grupos de enzima sobre os substratos sintéticos à base de p-nitrofenol NP) (VERCHOT; BORELLI, 2005): p-nitrofenil β-D-glucopiranosídeo NPG), p-nitrofenil β- D-xilopiranosídeo NPX), p-nitrofenil-α-L-arabinofuranosídeo (p-NPAra) e p-nitrofenil-α-D-galactopiranosídeo (p-NPGal), respectivamente. Com isso, os ensaios foram realizados adicionando-se 80µL do substrato correspondente (pNP- Sigma Aldrich 1mM) a 20µL do extrato enzimático e incubando-se a reação a 50°C por 10 minutos. A reação foi paralisada com a adição de 100µL de carbonato de sódio 1M pH 8,0. A absorbância foi lida em leitor de placas a um comprimento de onda de 405 nm. A atividade enzimática também foi inferida a partir de uma regressão linear contendo concentrações variadas do produto liberado, no caso, p-NP, além de normalizada em relação a quantidade final de proteína.
4.3. Dosagem de Proteínas e gel de SDS PAGE
A quantificação de proteínas dos extratos secretados foi realizada pelo método de Bradford (1976) a partir da adição de 250 μL do reagente Bio-Rad® com 5μL da amostra e uma incubação em temperatura ambiente por 5 minutos. Esse reagente foi diluído na proporção de 1 parte do mesmo para 4 partes de água e o protocolo adaptado para um volume de ensaios em microplacas. A intensidade colorimétrica foi medida em comprimento de onda de 595nm. O branco reacional não possuía amostra, mas foi incubado nas mesmas especificações. A curva padrão foi construída a partir de uma solução de albumina bovina sérica (BSA) variando-se a concentração entre 1mg/mL e 0,03 mg/mL.
A partir dessas dosagens, géis de eletroforese SDS PAGE foram realizados para visualização do padrão de bandeamento dos diferentes secretados analisados. Os géis de poliacrilamida (15%) foram carregados com 10 µg de amostra e tampão de corrida loading buffer 1x final. Essa mistura foi previamente fervida por 5 min a 95ºC para a desnaturação das proteínas. O marcador de massa molecular utilizado foi o Page Ruler Prestained Protein Ladder, Thermo Scientific (10 kDa a 180 kDa). A corrida ocorreu em cubas verticais de eletroforese a uma voltagem fixa de 120 v. Os géis foram corados com azul de Comassie Blue, descorados e fotografados.
4.4. Ensaio de hidrólise enzimática
Os ensaios de hidrólise realizados no presente trabalho foram reduzidos a uma escala de 20 mL em tubos do tipo Falcon. Para isso, inicialmente os fungos foram cultivados por 144 horas e tiveram os sobrenadantes concentrados em coluna VivaSpin 10000MWCO e dosados por Bradford.
A biomassa utilizada foi cedida pela usina Bioflex, da empresa GranBio, sendo que a umidade foi aferida utilizando-se termo balança para um ajuste de massa seca. A hidrólise foi realizada com 5% de sólidos totais na temperatura de 50 C em forno com rotação controlada. Os extratos enzimáticos foram ajustados para uma concentração final de 2mg/g de biomassa seca em sistema tamponado com 2 mL de citrato de sódio 1M pH 5,0.
Após 72 horas, o sobrenadante da hidrólise foi separado da biomassa residual por centrifugação (4000 rpm por 20 minutos) e as quantidades de glicose e xilose quantificadas por High Performance Liquid Cromatography (HPLC).
4.5. Determinação da concentração de glicose e xilose em HPLC
As concentrações de glicose e xilose foram analisadas por HPLC com um sistema Waters e2795 conectado ao detector de índice de refração (sistema Waters 2414), equipado com uma coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm - Biorad) a 35 ° C utilizando H2SO4 0,5
mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) como uma fase móvel e uma taxa de fluxo de 0,6 mL min-1 durante 65 min. Todas as amostras foram adequadamente diluídas e filtradas através de um filtro de seringa de 0,45 mm para remover as partículas antes da análise. As concentrações de celobiose e xilobioses foram analisadas por cromatografia de troca aniônica de alto desempenho com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) em uma coluna de proteção CarboPac PA-10 (4 x 50 mm) ligada a uma coluna analítica CarboPac PA-10 (4 x 250 mm) a 30°C (sistema Thermo Scientific Dionex ICS-5000 +) utilizando uma mistura de 50% de água e 50% (v / v) de NaOH 200 mM como eluente (1,0 mL min-1) durante 30 min.
4.6. Análise estatística
Os resultados obtidos foram submetidos a uma análise estatística com o uso do software Sigma Plot aplicando uma análise de variância (ANOVA) unidirecional e precedido por teste de Tukey com todas as comparações emparelhadas o que permitiu um agrupamento dos resultados e a classificação em grupos, sendo p value < 0,05.
4.7. Espectrometria de massas
Para análise do secretoma das espécies de fungos filamentosos em questão, as amostras em triplicatas biológicas provenientes do cultivo em meio Mandels-Andreotti enriquecido foram concentradas em coluna Vivaspin 15, selecionando proteínas com um mínimo de 10 kDa de tamanho. Após a concentração, as proteínas totais foram quantificadas pelo método de Bradford (Bradford,1976).
Posteriormente, uma quantidade de 10 µg de cada uma das amostras passou por um processo de alquilação, redução e uma reação com tripsina em solução, o que possibilitou a clivagem de um maior número possível de proteínas em peptídeos menores, favorecendo a identificação.
Após um tratamento em ácido fórmico, estas foram aplicadas no espectrômetro de massas. Uma alíquota de 5 μL foi analisada no espectrômetro de massas Orbitrap Velos ETD (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) ligado ao sistema EASY-nLC (Proxeon Biosystem, West Palm Beach, FL, EUA) através de uma fonte nanoelectrospray. Os peptídeos foram separados por um gradiente de 2-90% de acetonitrila em ácido fórmico a 0,1% utilizando uma coluna analítica PicoFrit (20 cm x 75 μm, tamanho de partícula 5 μm, New Objective) em fluxo de 200nL/min durante 85 minutos . A tensão do nanoelectrospray foi ajustada para 2,2 kV e a temperatura da fonte foi de 275°C. Todos os métodos do instrumento foram configurados no modo de aquisição dependente de dados. Os espectros de MS de varrimento completo (m / z 300-1600) foram adquiridos no analisador Orbitrap após aquisição para um valor alvo de 1 × 106. A resolução no Orbitrap foi ajustada para r = 60 000 e os 20 íons peptídicos mais intensos com carga ≥ 2 foram sequencialmente isolados para um valor alvo de 5.000 e fragmentados no íon trap linear usando CID de baixa energia (energia de colisão normalizada de 35%). O limite de sinal para acionar um evento MS/MS foi ajustado para 1.000 contagens. A exclusão dinâmica foi ativada com uma lista de tamanho de exclusão de 500, duração de exclusão de 60 segundos e uma contagem de repetição de 1.
O espectro foi adquirido usando o software Mass Lynx v. 4.1 e os arquivos com dados preliminares convertidos para uma lista de picos sem somar as análises, pelo software Mascot Distiller v.2.3.2.0, 2009 (Matrix Science Ldt.) e agrupados de acordo como banco de dados do CAZy (com 67000 sequências de proteínas) usando o mecanismo MASCOT v.2.3.01 (Matrix Science Ltd.), tendo como parâmetros uma clivagem perdida pela tripsina, modificação fixa de carbamidometilação, oxidação da metionina como a modificação variável
e tolerância da massa do fragmento do íon de 1 Da e tolerância para os fragmentos precursores dos íons de 10 ppm. A plataforma Scaffold foi utilizada no pós-processamento para validação MS/MS baseada na identificação dos peptídeos e proteínas com um False Discovery Rate (FDR) menor a 1%, mínimo de similaridade de 95% para peptídeos e 99% para proteínas e um mínimo de 1 peptídeo único para a identificação de uma proteína, além de uma exclusão de identificações encontradas em apenas 1 das 3 réplicas biológicas.
4.8. Clonagem dos genes de interesse em Trichoderma reesei
4.8.1. Amplificação dos fragmentos de interesse
A amplificação dos fragmentos de interesse para montagem de 5 vetores para expressão em T. reesei foi feita a partir de Polymerase Chain Reactions (PCR) (Tabela III). As ORFs heterólogas correspondiam a 2 xilanases (variação com e sem domínio de ligação ao carboidrato – CBM) e 1 β-glicosidase de T. erinaceum. Além disso, foi necessária a montagem de 2 plasmídeos controle com a xilanase e β-glicosidase de T. reesei.
Tabela III: Fragmentos necessários utilizados para a montagem dos cassetes em levedura.
Fragmento Tamanho Origem
pRS315 frag 3413pb Vetor vazio
URA3 1285pb Vetor vazio
CBH1p 1492pb DNAg T. reesei
CBH1t 1100pb DNAg T. reesei
Homologia TR1 1000pb DNAg T. reesei
Homologia TR2 1000pb DNAg T. reesei
Homologia TR3 1000pb DNAg T. reesei
Homologia TR4 1000pb DNAg T. reesei
PYR4 3662pb DNAg T. reesei
Xilanase T. erinaceum (completa) 852pb cDNA T. erinaceum Xilanase T.erinaceum (sem CBM) 678pb cDNA T. erinaceum
Xilanase T. reesei 687pb cDNA T. reesei
β-glicosidase T. erinaceum 2595pb cDNA T. erinaceum
β-glicosidase T. reesei 2622pb cDNA T. reesei
Os primers utilizados variaram entre 20pb a 60pb (alguns continham homologia de 40pb com os fragmentos adjacentes). Foram inseridas sequências de restrição antes e depois das regiões de homologias, o que possibilitaria posteriormente a retirada do cassete de interesse do plasmídeo.
As reações foram realizadas com Phusion® High Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific), com adição de DMSO e tampão HF, sendo todos os componentes
