Foram realizados inquéritos em 11 explorações de 10 freguesias (Fajã de Cima, Arrifes, Covoada, Achada das Furnas, Pilar da Bretanha, Pico do Alho, Vila do Nordeste, Feteiras, Fenais da Ajuda e São Vicente) da ilha de São Miguel.
Em relação à caracterização das explorações existiam em média 215 animais por exploração, tendo a exploração mais pequena 58 animais e a maior 690. Eram constituídas em média por 18 vitelos lactentes (entre 4 a 60), 26 vitelos após desmame (entre 7 a 60), 50 novilhas (entre 2 a 300) e 122 vacas (entre 31 a 290). Todas as explorações faziam a separação dos animais por faixas etárias. Todas as explorações tinham vacas de raça Holstein, duas explorações tinham também vacas de raça Jersey e uma outra tinha também vacas cruzadas. Uma exploração tinha ordenha móvel, tendo as restantes 10 ordenha fixa. Nove explorações tinham acesso a água da rede pública e 2 tinham captação privada. Os bebedouros e comedouros eram limpos com regularidade em 8 das 11 explorações e havia separação entre os instrumentos de maneio da alimentação e do estrume em 7 das 11 explorações. Em 5 explorações nunca foram adquiridos animais para substituição e 6 explorações faziam-no ocasionalmente. Uma das 6 explorações não conhecia o estado sanitário das explorações de onde provinham os animais comprados. A taxa de refugo era superior a 5% em todas as explorações. As causas de refugo indicadas, por ordem decrescente de frequência, foram a baixa fertilidade e mamites (6 em 11), sinais de fadiga (4 em 11) e diarreias e problemas podais (3 em 11). A idade ao refugo era em média 6 anos e variava entre 2 e 8 anos. Nove explorações tinham um maneio semi-extensivo (estabulação e pastoreio) e 2 explorações tinham maneio extensivo (pastoreio quase permanente). Em 9 das 11 explorações utilizava-se o estrume da exploração para adubar os pastos.
Em relação ao maneio profilático, todas as explorações faziam desparasitação. Uma exploração desparasitava esporadicamente, 5 desparasitavam uma vez por ano, 4 desparasitavam duas vezes por ano e uma desparasitava 4 vezes por ano. O desparasitante mais utilizado era o Ivomec® (10 em 11), seguido do Panacur® (4 em 11), Eprinex® (2 em
diarreia viral bovina, vírus parainfluenza 3 e vírus respiratório sincicial bovino, 2 explorações faziam vacinação para brucelose e uma fazia vacinação para mamites e
Mannheimia haemolytica.
Em relação à paratuberculose na exploração, 10 explorações tinham casos de animais com diarreias crónicas na exploração. Em 8 explorações havia problemas de mortalidade neonatal. Oito explorações tinham tido casos de doenças infeciosas na exploração. Em 6 explorações o tempo de cura clínica destas doenças era de dias, numa exploração era de dias a semanas e noutra exploração era de dias ou então não havia melhora dos animais. Apenas um inquirido disse não ter ouvido falar da paratuberculose. Quando inquiridos sobre o que sabiam sobre a doença, 7 responderam que causava diarreia crónica, 2 responderam que era uma doença infeciosa, 2 que causava perda de condição corporal, 2 que não sabiam nada sobre a doença, 1 que era aconselhado o refugo do animal e apenas 1 referiu ter assistido a uma palestra sobre a doença. Todas as explorações indicavam já ter havido suspeitas da presença da doença, havendo uma exploração com 8 casos confirmados, duas explorações com mais de 3 casos confirmados, uma exploração com 2 casos confirmados e duas explorações com 1 caso confirmado.
Em relação ao maneio da maternidade, em 8 explorações as vacas eram separadas da manada antes do parto. Em 3 das 11 explorações havia uma zona reservada para os partos, mas em nenhuma havia separação entre animais dentro da maternidade. Em 3 explorações limpavam a zona de maternidade e 3 explorações utilizavam esta zona para separar animais doentes. Apenas 2 explorações mantinham os úberes e membros posteriores das mães limpos e, em 7 explorações os vitelos mamavam diretamente das mães. Em 10 explorações o colostro fornecido era da própria mãe, e numa exploração era fornecido colostro da mãe e de um banco de colostro. Numa exploração o vitelo era imediatamente separado da mãe, em 3 explorações era retirado até 6 horas depois do parto, numa exploração era retirado até 12 horas depois do parto, em duas explorações era retirado até 24 horas depois do parto, numa exploração era retirado até dois dias depois do parto, numa exploração era retirado até três dias depois do parto, numa exploração era retirado até seis dias depois do parto e noutra exploração era retirado até oito depois do parto.
Em relação ao maneio dos vitelos lactentes, 4 explorações forneciam leite do tanque, 3 explorações forneciam leite de vacas em tratamento, 3 explorações forneciam leite de um banco de leite, 3 explorações forneciam leite em pó e 2 explorações forneciam
leite das próprias mães. Em duas explorações os vitelos estavam em contacto direto com vacas adultas ou o seu alimento e água. Em 3 explorações havia contacto entre os vitelos e o estrume de vacas adultas. Em 8 explorações os vitelos nunca se encontravam em pastagens anteriormente ocupadas por vacas adultas, em 2 explorações encontravam-se ocasionalmente nestas pastagens e numa exploração encontravam-se frequentemente nestas pastagens.
Em relação ao maneio dos vitelos após o desmame, em nenhuma exploração havia a partilha de espaço ou instalações com animais adultos, nem existia estrume proveniente de vacas adultas nos pastos onde estes animais se encontravam. Numa exploração existia a possibilidade de a água ou o alimento estar contaminado por estrume de animais adultos.
A identificação dos fatores de risco está descrita nas seguintes tabelas.
Tabela 4 – Determinação da presença do fator de risco “Contacto com fezes de adultos no pós-parto”.
Pergunta Exploração
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
As vacas são separadas da
manada antes do parto? Sim Sim Não Sim Não Sim Não Sim Sim Sim Sim Há uma zona reservada
para partos? Não Não Não Sim Sim Não Sim Não Não Não Não Há separação dos vários
animais na maternidade? Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não O estrume é retirado da
zona de maternidade? Não Não Não Não Sim Não Sim Não Não Não Sim A maternidade é utilizada
para separar animais doentes?
Não Não Não Não Não Não Sim Sim Não Não Sim Há preocupação em manter
os úberes e membros posteriores limpos?
Não Não Não Sim Não Não Não Não Não Sim Não Os vitelos mamam
diretamente das mães? Sim Sim Sim Sim Sim Não Não Sim Não Sim Não Quantas horas após o parto
são separados os vitelos das mães? 24h 6 dias 2 dias 3 dias 8 dias 0h 6h 12h 24h 6h 6h Classificação 6 6 7 4 5 4 4 4 4 4 4 Presença do FR (>=4) + + + + + + + + + + +
Tabela 5 – Determinação da presença do fator de risco “contacto com fezes de adultos antes do desmame”.
Pergunta Exploração
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Separação dos animais
por grupos etários? Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Há separação dos
instrumentos de maneio do alimento e estrume?
Não Sim Não Sim Sim Sim Não Não Sim Sim Sim Os vitelos lactentes estão
em contacto direto com vacas adultas, o seu alimento/água?
Não Sim Sim Não Não Não Não Não Não Não Não
Existe contacto dos vitelos com o estrume/chorume de vacas adultas?
Não Sim Sim Não Não Não Não Sim Não Não Não
Os vitelos encontram-se numa pastagem
anteriormente ocupada por vacas adultas?
Nunc Freq Ocas Nunc Nunc Nunc Nunc Ocas Nunc Nunc Nunc
Classificação 1 3 4 0 0 0 1 3 0 0 0
Presença do FR (>=3) - + + - - - - + - - -
Nunc – Nunca; Freq – Frequentemente; Ocas – Ocasionalmente
Tabela 6 – Determinação da presença do fator de risco “contacto com fezes de adultos após o desmame”.
Pergunta Exploração
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Separação dos animais por
grupos etários? Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Há separação dos
instrumentos de maneio do alimento e estrume?
Não Sim Não Sim Sim Sim Não Não Sim Sim Sim Os pastos são adubados
com estrume da exploração?
Sim Sim Não Sim Sim Sim Sim Sim Sim Não Sim As bezerras compartilham
do mesmo pasto que as vacas adultas/encontram- se nas mesmas instalações?
Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não
Existe estrume/chorume proveniente de vacas adultas na pastagem onde se encontram as bezerras?
Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não Não
Existe possibilidade de a água/alimento das novilhas ser contaminado por estrume/chorume?
Não Não Não Não Não Não Não Sim Não Não Não
Classificação 2 1 1 1 1 1 2 3 1 0 1
Tabela 8 – Resumo dos fatores de risco identificados em cada exploração.
Fator de Risco Exploração Total
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Contacto com fezes de adultos no pós-parto + + + + + + + + + + + 11
Contacto com fezes de adultos antes do desmame - + + - - - - + - - - 3
Contacto com fezes de adultos após o desmame - - - + - - - 1
Movimento de animais entre explorações - + - - + - + - + + + 6
Total 1 3 2 1 2 1 2 3 2 2 2
O fator de risco “contacto com fezes de adultos no pós-parto” foi identificado em todas as 11 explorações. O fator de risco “contacto com fezes de adultos antes do desmame” foi identificado em 3 explorações. O fator de risco “contacto com fezes de adultos após o desmame” foi identificado em 1 exploração. O fator de risco “movimento de animais entre explorações” foi identificado em 6 explorações.
Nenhuma das explorações apresentou 0 fatores de risco. 3 explorações apresentaram 1 fator de risco. 6 explorações apresentaram 2 fatores de risco. Duas explorações apresentaram 3 fatores de risco. Nenhuma exploração apresentou 4 fatores de risco.
Tabela 7 – Determinação da presença do fator de risco “movimento de animais entre explorações”.
Pergunta Exploração 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 É frequente a aquisição de animais de substituição provenientes de outras explorações?
Nunc Ocas Nunc Nunc Ocas Nunc Ocas Nunc Ocas Ocas Ocas
É conhecido o estado sanitário da
exploração de origem dos bovinos
adquiridos?
- Sim - - Não - Sim - Sim Sim Sim
Classificação 0 1 0 0 2 0 1 0 1 1 1
Presença do FR (>=1) - + - - + - + - + + +
4.2 Identificação e deteção de Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis
Figura 1 – Animais rejeitados na abegoaria. Fotografia de João Flores.
Os resultados do rtPCR IS900 das 72 amostras de fezes recolhidas nos Açores foram positivos na sua totalidade. Algumas das culturas já mostravam sinais de crescimento e outras sinais de contaminação. No entanto, não foi possível acompanhar a totalidade do tempo de incubação. Um contacto posterior com o INIAV permitiu aferir que houve isolamento de Map em 27 amostras, confirmado através de PCR em tempo real f57.
4.3 Caso de estudo numa unidade epidemiológica
Aquando da visita à exploração para a realização do rastreio foram tiradas algumas fotografias, gentilmente cedidas pelo Dr. Carlos Pinto.
Figura 3 – Aspeto geral da manada. Algumas vacas apresentam sinais de diarreia. Fotografia de Carlos Pinto.
Figura 5 – Os vitelos são criados no pasto presos a uma estaca com uma corrente metálica. Fotografia de Carlos Pinto.
Todas as 7 amostras de fezes enviadas para o LRV para o teste de coloração de Ziehl-Neelsen obtiveram resultado negativo. Não foi possível aceder aos resultados das culturas e PCR das amostras de fezes enviadas para o INIAV.
Figura 7 – Vitelo amarrado a estaca, junto a um cabanão com feno. Fotografia de Carlos Pinto.
Figura 8 – Material e equipamento velho que impossibilitam uma higiene adequada no aleitamento. Este cabanão alojava cabras na altura da visita. Fotografia de Carlos Pinto.
A seropositividade em 2011 foi de 6%. Em 2012 nenhuma amostra foi positiva. Em 2013 a seropositividade foi de 17%. Em 2016 a seropositividade foi de 16%. A seropositividade mais elevada ocorreu em 2013.
Só foi possível calcular as prevalências reais para os anos de 2011 e 2016. Em 2011 a prevalência real foi de 9%. Em 2016 a prevalência real foi de 27%.
Tabela 9 – Resultados do teste de ELISA
Ano Nº de animais Nº de rastreados ELISA positivos
2011 149 87 5
2012 127 106 0
2013 113 6 1
5 Discussão
Os três casos de estudo realizados são totalmente independentes uns dos outros, tendo em comum apenas o facto de se debruçarem sobre a paratuberculose na ilha de São Miguel. Seria melhor ter uma perspetiva mais completa de todas as explorações visitadas, com realização de inquéritos e recolha de amostras para testes ELISA e PCR. Teríamos assim uma melhor plataforma com a qual seria possível realizar comparações. Constrangimentos temporais, principalmente, impossibilitaram tais procedimentos.
O primeiro caso de estudo focou-se numa abordagem epidemiológica ao problema da paratuberculose. Foram realizados inquéritos em explorações onde, num estudo anterior (Cruz, 2015), se diagnosticou a doença. Apesar de haver diagnósticos definitivos em todas as explorações inquiridas, apenas 6 explorações afirmaram ter casos confirmados, dizendo as outras 5 que apenas tinham havido casos suspeitos. Isto pode indicar falta de interesse ou acesso à informação por parte do proprietário em relação à problemática.
Quando inquiridos sobre o seu conhecimento acerca da paratuberculose apenas um respondeu nunca ter ouvido falar da doença. No entanto, o conhecimento dos outros produtores era muito incompleto, havendo até dois produtores que apenas tinham ouvido falar no nome da doença. Apenas um produtor afirmou ter assistido a uma palestra sobre o assunto. Estes resultados apontam para a necessidade de informar os produtores acerca da doença, a diminuição de rendimentos que esta causa e os sinais a que devem estar atentos.
Em relação aos fatores de risco identificados, aquele que mais se destaca é o “contacto com fezes de adultos no pós-parto”. Este fator foi identificado em todas as 11 explorações inquiridas. Vários estudos indicam para que as condições ambientais e o contacto com animais adultos nas primeiras horas e dias de vida de um bezerro são um dos principais fatores de risco que levam à disseminação e perpetuação da paratuberculose nas explorações (Doré et al., 2012; Sorge et al., 2012; Künzler et al., 2014). As explorações demonstram despreocupação e descuido em relação a este ponto crucial na transmissão da doença, não havendo separação das vacas antes do parto para um local limpo, e por vezes, quando o fazem acabam estas vacas por partilhar o espaço com animais doentes. Não há também o cuidado de separar a mãe do bezerro logo que
possível, estando o animal recém-nascido em contacto com um animal adulto por vezes até uma semana. Isto aumenta muito a probabilidade de ingestão acidental de matéria fecal por parte do bezerro com consequente infeção.
O fator de risco “contacto com fezes de adultos antes do desmame” foi encontrado em 3 explorações, sendo uma destas a única onde foi encontrado o fator de risco “contacto com fezes de adultos após o desmame”. Estes fatores foram associados à transmissão de Map e explorações com maior incidência de paratuberculose (Obasanjo et al., 1997; Diéguez et al., 2008; Norton et al., 2009). Os animais mais jovens são aqueles que se apresentam mais suscetíveis à infeção, considerando-se que a resistência máxima só é atingida por volta dos 12 meses de idade (Windsor e Whittington, 2010), mas mesmo após essa idade os animais continuam vulneráveis, havendo um estudo que associa o contacto de novilhas com fezes de adultos a explorações com maior prevalência de paratuberculose (Künzler et al., 2014). Outro aspeto que deve ser tido em consideração é que quanto mais cedo um animal for infetado, mais cedo começa a libertar Map nas fezes, podendo haver transmissão horizontal entre bezerros, a partir dos que foram infetados no pós-parto, e no período antes e após o desmame (van Roermund et al., 2007). Os produtores, na sua maioria, já promovem uma boa separação física entre os animais jovens e adultos, impedindo em grande parte o contacto com as suas fezes. Fazem-no, no entanto, porque é uma prática habitual e generalizada na região e não com o intuito específico de prevenir a transmissão da doença.
O fator de risco “movimento de animais entre explorações” foi encontrado em 6 das 11 explorações inquiridas. Este é o principal fator de risco associado à transmissão da doença entre explorações, tendo já sido identificado em vários estudos (Sorge et al., 2012; Künzler et al., 2014; Rangel et al., 2015). Cinco explorações afirmaram nunca adquirir animais de substituição, sendo esta a única maneira efetiva de prevenir entrada de animais infetados. Foi considerado presente o fator de risco em todas as outras, uma vez que não existe atualmente nenhum teste que garanta que o animal adquirido está livre de infeção (Sweeney et al., 2012).
Foram identificados fatores de risco em todas as explorações. Sendo estas explorações com casos confirmados de paratuberculose, seria do interesse dos
inalcançável. Como tal, tem de haver motivação para a aplicação de tais programas. Esta motivação advém da informação disponibilizada pelo médico veterinário e serviços oficiais, e, tendo em conta que a paratuberculose não é tratada como uma zoonose, deve ser focado o interesse do produtor em obter o melhor rendimento possível da sua exploração. Deve ficar também claro que as medidas aplicadas ajudarão não só no controlo da paratuberculose, mas também no controlo de outras doenças infeciosas. Os programas de controlo não acarretam necessariamente custos para o produtor, podendo ser, no entanto, necessário adotar práticas de maneio que interferem com a rotina normal da exploração até esse ponto (Garry, 2011; Roussel, 2011).
Em relação ao caso de estudo de identificação e deteção de Map, este foi feito com o intuito de acompanhar e executar do início ao fim todos os procedimentos para a obtenção de um diagnóstico laboratorial definitivo de paratuberculose. Neste caso, os testes laboratoriais realizados foram a cultura e PCR.
O método de cultura implica a descontaminação da amostra uma vez que numa amostra de fezes Map é apenas uma pequena percentagem do total de microrganismos presentes. Este processo não é específico e como tal leva a que a quantidade de Map viável na amostra também diminua (OIE - World Organisation for Animal Health, 2012). E mesmo assim a descontaminação não impede totalmente o crescimento de contaminantes como aconteceu em algumas das amostras processadas. Outros procedimentos indicados são a realização de duplicados e a utilização de meios com e sem micobactina para confirmação da dependência característica de Map. Não foi possível a realização de duplicados nem de cultura em meio sem micobactina. A não realização de duplicados pode ter levado à ocorrência de falsos negativos. Porém, foi possível assegurar a especificidade do teste, mesmo sem a prova da micobactina, através da realização de rtPCR f57. Esta rtPCR confirmou que todos os isolados eram de facto Map. Através deste método, 27 das 72 amostras, ou 37,5% das amostras tiveram resultado positivo.
A técnica de nested PCR permite a deteção de quantidades inferiores de DNA na amostra o que pode melhorar a sensibilidade da técnica. No entanto, também aumenta a possibilidade de contaminações cruzadas durante o processamento (Möbius et al., 2008). Pode ter sido isto que aconteceu durante o processamento das amostras no INIAV. Durante uma primeira ronda de testes, os negativos de ambas as rondas de PCR estavam a apresentar resultados positivos após a rtPCR. Após a preparação de novos reagentes o
problema persistiu. Depois disto optou-se por fazer apenas rtPCR, diretamente sobre o DNA extraído da amostra. Esta alteração ao protocolo pode levar a uma diminuição da sensibilidade do método, pois quantidades menores de DNA podem não atingir o limiar de deteção sem um primeiro passo de amplificação. Apesar disto, os controlos negativos mantiveram-se negativos e todas as 72 amostras processadas tiveram resultado positivo. Nestas amostras haveria, portanto, carga microbiana suficiente. Caso as amostras contivessem uma carga microbiana inferior esta mesma metodologia poderia dar origem a falsos negativos.
O método de cultura é atualmente o “gold standard” das provas laboratoriais para a paratuberculose. No entanto tem limitações, sendo a principal o tempo de incubação necessário para que se observe crescimento bacteriano. Pode demorar desde 5 semanas até 6 meses até ao aparecimento das primeiras colónias (OIE - World Organisation for Animal Health, 2012), fazendo com que enquanto se esperam por resultados os animais infetados continuem a contaminar o ambiente. Outra desvantagem é que apenas deteta organismos viáveis que sobrevivem ao processo de descontaminação. O método de PCR colmata algumas destas limitações ao ser um teste rápido que não necessita de bactérias viáveis para ter resultados positivos, uma vez que apenas é necessário que não haja degradação do DNA bacteriano. Há assim o potencial para que o teste de PCR tenha uma sensibilidade superior ao teste de cultura, ao mesmo tempo que disponibiliza resultados muito mais rapidamente (Gilardoni et al., 2012). Esta sensibilidade superior foi aparente neste trabalho, com 100% das amostras positivas por PCR contra 37,5% de positividade por cultura. Há, no entanto, que ressalvar que a técnica de cultura foi realizada de maneira subótima, devido a constrangimentos operacionais. Como desvantagem do método de PCR temos a presença de inibidores da Taq polimerase, que é comum estarem presentes em amostras ambientais e de fezes. Estes inibidores potenciam o aparecimento de falsos negativos, sendo necessário utilizar métodos de extração de DNA que possibilitem a extração da maior quantidade possível de DNA com um elevado grau de pureza (Kreader, 1996). Ambos os métodos têm um custo elevado, e são métodos diretos apenas detetando infeção quando o microrganismo está a ser excretado nas fezes. Nas fazes iniciais da doença em que excreção é intermitente, estes métodos têm sensibilidade reduzida, podendo ser necessário repetir os testes várias vezes até que se detete um animal positivo
Esta parte do trabalho permitiu-me experienciar os constrangimentos existentes