Métodos moleculares

O método molecular mais frequentemente utilizado é a deteção de sequências de DNA específicas de Map. Foram já identificadas várias sequências específicas de Map, sendo que a mais utilizada atualmente é a IS900. No genoma de Map pode-se encontrar 14 a 20 cópias da IS900, o que confere a testes que a utilizem uma sensibilidade superior em relação a outras sequências. Outra sequência específica já descrita é a f57, que apenas tem uma cópia no genoma de Map e é utilizada normalmente em conjunto com a IS900 (Timms et al., 2011).

A deteção destas sequências é feita maioritariamente por variações da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). A nested PCR consiste em duas rondas de amplificação com um par de “primers” diferente em cada, aumentando a sensibilidade do método. Há também a multiplex PCR que utiliza vários pares de “primers” na mesma reação permitindo a identificação de infeções mistas. A real-time PCR utiliza uma sonda, marcada com um fluorocromo, complementar a um segmento intermédio que se liga à sequência que está a ser amplificada. A fluorescência emitida vai ser proporcional à quantidade de DNA a que a sonda se liga, permitindo a quantificação de Map na amostra. Para este fim não pode ser utilizada a IS900 pois existem várias cópias dela no genoma, utilizando-se então a f57 (Gilardoni et al., 2012). Outra variação da técnica de PCR menos utilizada é a loop-mediated isothermal amplification (LAMP). A LAMP tem mostrado uma boa sensibilidade e especificidade, sendo também uma técnica que não necessita de termociclador, o que a torna mais económica e prática de aplicar (Enosawa et al., 2003).

As amostras de DNA podem ser obtidas a partir de colostro, leite, fezes e múltiplos tecidos da parede intestinal e linfonodos. A extração de DNA destas amostras necessita de ser feita utilizando o método mais apropriado, pois este passo tem muita influência na qualidade dos resultados finais obtidos. Dependendo da origem da amostra podem ser utilizados vários métodos, mas pensa-se que um passo mecânico é essencial para maximizar a quantidade de DNA extraído. Este passo também resulta, no entanto, em maior libertação de inibidores da PCR, aumentando a possibilidade de falsos negativos (Timms et al., 2011).

bactérias viáveis na amostra e também permite a quantificação de Map. Existem, porém algumas desvantagens: a maioria das técnicas necessita de equipamentos e consumíveis dispendiosos; há a propensão para falsos negativos devido ao efeito dos inibidores da Taq polimerase; falsos positivos são um risco comum devido a contaminações durante a aplicação da técnica sendo necessário a utilização de controlos positivos e negativos em todas as rondas ( Timms et al., 2011; Gilardoni et al., 2012).

Outro método molecular é o da hibridização in situ. Esta técnica consiste na utilização de uma sonda marcada que se liga a uma sequência de DNA presente numa preparação histológica. São utilizadas várias sondas, umas mais pequenas, que penetram mais facilmente nos tecidos, mas produzem um sinal mais fraco que pode passar despercebida e outras maiores que tem maior dificuldade em penetrar os tecidos e ligar- se à sequência correspondente. Os marcadores utilizados podem ser compostos radioativos ou fluorescentes que permitem uma boa deteção das sequências, mas perde- se um pouco do detalhe da estrutura tecidular e compostos enzimáticos que permitem uma melhor observação. Esta técnica tem vantagem sobre a coloração de Ziehl-Neelsen pois cora apenas Map e permite identificar esferoplastos que são formas de Map que não possuem parece celular, sendo negativas ao Ziehl-Neelsen (Timms et al., 2011; Gilardoni et al., 2012).

1.7.4 Provas Imunológicas

Existem dois tipos de provas imunológicas para o estudo de Map. As provas que detetam a resposta humoral e as que detetam a resposta celular. Associa-se normalmente, uma resposta imunitária celular ao período inicial da infeção, sendo esta progressivamente substituída pela resposta humoral à medida que a infeção avança e começam a ser observados os primeiros sinais clínicos. Apesar disto o teste a que mais se recorre na rotina é o ELISA, que identifica unicamente a resposta humoral (Gilardoni et al., 2012).

Anticorpos específicos de Map começam a ser detetados na fase subclínica da doença, quando a infeção já está bem estabelecida e disseminada, mas ainda não há sinais clínicos. Para detetar estes anticorpos são utilizados três testes laboratoriais, fixação do complemento, imunodifusão em gel de agar (AGID) e ensaio de imunoabsorção

enzimática (ELISA) (Gilardoni et al., 2012; OIE - World Organisation for Animal Health, 2012).

O teste de fixação do complemento foi o teste “standard” durante muito anos. Pode funcionar bem em casos onde já há suspeita da doença, mas a sua especificidade não é suficiente para ser usado como teste de controlo. Apesar disso ainda é frequentemente utilizado para efeitos de importação de gado por certos países que impõe a sua realização antes do transporte. Existem variados protocolos para esta técnica (OIE - World Organisation for Animal Health, 2012).

O AGID baseia-se na precipitação de complexos imunes, formados entre o anticorpo e o antigénio, numa matriz de gel agar. É um teste simples, rápido e relativamente barato. É utilizado principalmente como confirmação rápida de casos suspeitos, tendo uma boa sensibilidade na fase clínica da doença (Gilardoni et al., 2012). O teste ELISA baseia-se na ligação entre anticorpos presentes no soro de bovinos com antigénios aderidos à parede de um poço. Após esta ligação é adicionado uma imunoglobulina anti-bovino, marcada com uma enzima, que se une com os anticorpos bovinos. Quando se adiciona o substrato da enzima, estes vão reagir em maior ou menor grau, consoante a quantidade de enzima presente nas paredes, produzindo um sinal mais ou menos intenso que neste caso é a cor. A cor é medida através de um espectofotómetro e vai ser proporcional à quantidade de anticorpos presentes na amostra. Sendo um método quantitativo, o resultado pode ser negativo, positivo ou suspeito caso o título de anticorpos se encontre entre o limiar positivo e negativo. Nestes casos aconselha-se uma nova recolha de amostras para repetição do teste (Collins, 1996; OIE - World Organisation for Animal Health, 2012)

Os métodos atuais utilizam um passo inicial extra onde o soro é diluído numa solução com antigénios de Mycobacterium phlei, para diminuir o número de anticorpos não específicos de Map e assim aumentar a especificidade da técnica (OIE - World Organisation for Animal Health, 2012).

O soro para o teste ELISA pode ser obtido a partir de amostras de sangue ou leite. Existe uma grande variedade de testes ELISA, sendo utilizados diferentes antigénios para a deteção de anticorpos específicos de Map. Assim sendo, a sensibilidade do ELISA

ou de 50 a 87% quando os animais já apresentam sinais clínicos. Dependendo do teste a especificidade encontra-se entre os 85 a 100% (Nielsen e Toft, 2008).

Novos métodos de obtenção e tratamento de antigénios estão a ser desenvolvidos para melhorar a sensibilidade do ELISA. O SELISA e o EVA-ELISA apresentam estimativas de sensibilidade e especificidade acima dos 96%, mesmo para animais com níveis baixos de excreção de Map (Speer et al., 2006; Scott et al., 2010).

O ELISA apresenta muitas vantagens. É facilmente automatizado, sendo possível processar muitas amostras ao mesmo tempo, tem uma boa repetibilidade, os resultados podem ser interpretados objetivamente, a sensibilidade e especificidade são boas nas fases clínicas da doença e é um método relativamente barato. Por outro lado, tem uma sensibilidade relativamente baixa em casos subclínicos, e a variedade de antigénios utilizados e de idades de animais testados pode levar a erros de sensibilidade e especificidade que alteram as estimativas de prevalência (Gilardoni et al., 2012).

Já do lado dos testes de imunidade celular, recorre-se a um teste in vivo e a outro teste in vitro. O teste in vivo consiste numa reação intradermal que testa a hipersensibilidade do tipo retardado. Faz-se uma injeção intradermal de um extrato de Map na região central da tábua do pescoço, medindo-se a espessura da pele no ponto de inoculação antes e 72 horas depois da injeção. Se houver um espessamento da zona superior a 2 mm considera-se o teste positivo. Este teste, muito utilizado na deteção de tuberculose, tem sensibilidade e especificidade baixas para a deteção de Map, talvez por este possuir muitos antigénios comuns a micobactérias ambientais. Por esta razão, apesar de ser facilmente aplicado no campo, não se recorre frequentemente a este teste (Collins, 1996; Gilardoni et al., 2012).

O teste in vitro para deteção da resposta imunitária a Map baseia-se na deteção de interferão γ. Linfócitos T do animal são incubados durante 18 a 36 horas com antigénio especifico de Map, fazendo-se posteriormente a quantificação de interferão γ produzido através de uma técnica de ELISA. Esta técnica permite detetar animais infetados antes de haver produção de anticorpos e excreção consistente de Map nas fezes. No entanto, existe a possibilidade de reações cruzadas, as amostras necessitam de ser processadas rapidamente para as células manterem a viabilidade, tem um custo elevado e sensibilidade baixa. Tudo isto leva a que não se recorra frequentemente a este tipo de testes (Collins, 1996; Gilardoni et al., 2012).

1.8 Controlo e Prevenção

A implementação de programas efetivos de controlo da paratuberculose depara- se com alguns constrangimentos. Só de há uns anos a esta data, se começou a compreender a verdadeira distribuição da doença, sendo esta muito mais comum do que se pensava antes. Portanto, não se fazia a sua monitorização e a maioria dos produtores não conhecia a doença, os seus sinais clínicos e os prejuízos por ela causados (Garry, 2011).

Hoje em dia o incentivo para o controlo da paratuberculose continua a ser baixo. Apesar de alguns estudos apontarem para tal, ainda não se reconhece o caracter zoonótico da doença. Como tal, não há apoios governamentais nem da industria para subsidiar os custos dos programas de controlo. A adesão a programas de controlo é um processo voluntário e apenas os produtores bem esclarecidos, que reconhecem o impacto económico que a doença tem nas explorações, têm interesse em desenvolver um programa no seu efetivo. Como ainda não existe nenhuma vacina, nem tratamento efetivos para a paratuberculose, um programa de controlo tem de se basear em protocolos de biossegurança e refugo de animais infetados (Garry, 2011).

Existem vacinas contra a paratuberculose disponíveis. Alguns estudos apontam para uma proteção parcial contra a doença. Segundo estes estudos, apesar de a vacina não impedir a infeção, reduz a excreção fecal de Map, o número de animais que apresentam doença clínica, o número de animais que testam positivo em testes histológicos e bacteriológicos e as lesões também são reduzidas em número e severidade. Por outro lado, estas vacinas interferem com os testes diagnósticos da tuberculose e da paratuberculose, podem causar granulomas no local de inoculação, tanto no animal, como no médico veterinário que se pode inocular acidentalmente. Estão atualmente a ser desenvolvidas vacinas de subunidades que permitem mitigar algumas destas desvantagens, ao não interferirem com os testes diagnósticos, combatendo assim um dos principais entraves à vacinação generalizada (Harris e Barletta, 2001; Patton, 2011).

O controlo da paratuberculose dá-se a três níveis, prevenção da exposição de animais suscetíveis ao agente infecioso; gestão de animais infetados; prevenir a entrada de animais infetados. Os programas são práticos, específicos de cada exploração e têm de

práticas de maneio. Os custos da aplicação de testes laboratoriais só se justificam se o produtor se comprometer a atuar conforme está definido no programa, aplicando medidas e ajustando procedimentos consoante os resultados laboratoriais que vai obtendo (Garry, 2011; Roussel, 2011; Sweeney et al., 2012).

Para prevenir novas infeções, o grupo ao qual se tem de prestar mais atenção é o dos animais com menos de um ano de idade, pois a suscetibilidade destes animais é superior à dos animais adultos. Também quanto mais cedo um animal foi infetado, mais cedo começa a disseminar o microrganismo. Tendo em conta que a transmissão uterina é uma possibilidade, e que quanto mais avançado for o estado da doença maior é a probabilidade deste tipo de transmissão, deve-se proceder ao refugo de bezerros nascidos de animais que já apresentam sinais clínicos (Sweeney et al., 2012).

A gestão das maternidades é um aspeto importante para prevenir novas infeções. Deve proceder-se à separação do bezerro e vaca logo à nascença, para diminuir a probabilidade de transmissão feco-oral quando há as tentativas para o animal se levantar e este explora o espaço em busca do úbere da vaca. Deve estar interdita a entrada de animais com qualquer tipo de doença na maternidade. A densidade animal deve ser baixa, ou, se possível, deve haver maternidades individuais. Os espaços têm de ser mantidos limpos, não esquecendo comedouros e bebedouros, mudando-se a cama diariamente. Os animais devem ser limpos regularmente, tendo especial atenção aos flancos, membros, úbere e tetos (Garry, 2011; Sweeney et al., 2012).

Não se deve fornecer colostro e leite de animais Map positivos a bezerros, nem se deve juntar o colostro de vários animais. A partir de animais Map negativos deve ser feito um banco de colostro onde são guardadas porções em contentores individuais. Como alternativa podem ser utilizados produtos de substituição de colostro e leite. O leite deve ser pasteurizado, para diminuir o risco de infeção. Todos os procedimentos de manuseamento e administração de leite e colostro devem ser feitos com o maior grau de higiene possível (Garry, 2011; Sweeney et al., 2012).

Os bezerros devem ser criados em espaços completamente separados dos animais adultos. Todo o equipamento que se utiliza quando se manuseia a alimentação de animais jovens e adultos deve ser exclusivo de cada grupo. Isto inclui tanto veículos e instrumentos, como também a roupa e calçado utilizado. As sobras da alimentação dos adultos não devem ser transferidas para a alimentação dos jovens (Garry, 2011; Sweeney et al., 2012).

Nas explorações onde os bezerros são mantidos com as mães durante um período de tempo alargado, como em algumas produções de carne, deve-se tentar minimizar ao máximo o contacto do bezerro com fezes de animais adultos. Isto faz-se aumentando a área utilizada pelo par vaca/bezerro através da disseminação dos pontos de água, alimentação e abrigo, diminuindo a tendência dos animais se agregarem num só ponto do espaço. A quantidade de feno disponibilizado não deve exceder a capacidade de consumo dos animais, para que diminua a possibilidade de este ser usado como cama, o que pode causar a sua contaminação e posterior ingestão pelos bezerros. As zonas de alimentação devem ser mudadas diariamente (Roussel, 2011).

Nestes casos também se pode justificar a criação de duas manadas. Uma com animais Map negativos e outra com animais Map positivos. No caso de se utilizar o teste ELISA para fazer esta distinção, a manada Map negativa dever ser formada exclusivamente por animais com resultado negativo. A manada positiva deve ser formada por animais suspeitos e com baixa ou moderada positividade. Os animais fortemente positivos devem ser refugados o mais rapidamente possível (Roussel, 2011).

A gestão dos animais infetados é um aspeto que varia consoante o tipo de exploração e objetivo a que se propõe no início do programa. A primeira decisão a tomar é se se vai proceder a testes laboratoriais para identificar os animais positivos, e depois adaptar os testes a realizar aos objetivos (Collins, 2011a; Sweeney et al., 2012).

O objetivo de erradicar a paratuberculose da exploração compreende custos muito elevados para a realização de testes laboratoriais. Ainda não é claro se este é um objetivo alcançável. As únicas explorações onde este objetivo pode ser viável é em explorações de criação de animais para reprodução. Estas têm de ser capazes de assegurar, com um grau elevado de certeza, que os animais que vendem não são portadores de Map. Para tal têm de se aplicar boas práticas de gestão da exploração, aliadas a testes de deteção direta de Map (cultura e PCR) a cada animal da exploração. Caso apareça um animal na exploração com resultado positivo, este deve ser imediatamente separado dos restantes e conduzido para refugo. Pode também ser tomada a decisão de proceder ao refugo das filhas nascidas deste animal positivo. Os testes têm de ser repetidos regularmente mesmo passados vários anos desde o último resultado positivo (Collins, 2011a; Sweeney et al.,

diagnóstico da doença, procedendo-se a necrópsia e envio de amostras para efetuar testes microbiológicos e histopatológicos. Uma vez confirmada a doença deve-se estimar a prevalência desta na exploração. Podem ser enviadas amostras para cultura e PCR de animais que são refugados por baixa produtividade, ou de pelo menos seis amostras de fezes recolhidas do ambiente em locais onde os animais costumam permanecer. Estes testes dão-nos uma ideia do impacto económico que a doença pode estar a ter e permitem uma estimativa grosseira da prevalência. Caso a prevalência estimada esteja acima dos 5% pode-se avançar para uma estratégia em que se utilizam testes ELISA, em amostras de sangue ou leite, para identificar e classificar os animais da exploração. Animais negativos não representam um risco significativo, podem, portanto, utilizar a maternidade normalmente e o seu colostro pode ser utilizado. Fracos positivos podem ser mantidos até ao fim da lactação pois representam um risco baixo de disseminação de Map. No entanto, se demonstrarem algum sinal clinico devem ser encaminhados para refugo. Animais moderadamente positivos podem permanecer na exploração até ao final da lactação, mas devem ser refugados imediatamente se apresentarem qualquer problema de saúde ou produtivo. Animais altamente positivos não podem ser usados para reprodução e tendo em conta que podem ser altamente contagiosos deve-se equacionar o seu refugo o mais rapidamente possível (Collins, 2011a; Sweeney et al., 2012).

Não existe nenhum teste que garanta com 100% de certeza que um animal está livre de infeção por Map. Como tal é sempre um risco quando se adquirem animais para introduzir na exploração. A situação ideal seria ter uma exploração fechada que cria os seus animais de substituição a partir dos seus próprios bezerros. Quando isso não é uma possibilidade, os animais adquiridos devem ser provenientes de explorações que já implementaram um programa de controlo de paratuberculose, que mantêm bons registos e um historial de testes negativos na exploração. Esta prática não garante que o animal comprado está livre de infeção, mas diminui muito a probabilidade de tal acontecer (Garry, 2011; Roussel, 2011; Sweeney et al., 2012).

1.9 Tratamento e Profilaxia

Neste momento não existe uma cura definitiva para a paratuberculose. Existem, no entanto, tratamentos que se utilizam para aliviar os sinais clínicos e prolongar a vida dos animais. Estes tratamentos prolongam-se para o resto da vida do animal e não impedem a excreção de Map. Portanto, os custos e os ricos que se correm ao manter um animal neste estado só se justificam caso o animal tenha um valor económico, genético ou sentimental muito elevado (St Jean, 1996; Fecteau e Whitlock, 2011). Outro risco a ser seriamente ponderado antes da aplicação de uma terapia é o possível aparecimento de estirpes resistentes às substâncias utilizadas, uma vez que algumas delas são usadas frequentemente no tratamento da tuberculose em humanos, e sendo a tuberculose multirresistente um grave problema a nível mundial (Nachega e Chaisson, 2003).

Não existem medicamentos indicados especificamente para o tratamento da paratuberculose. São, portanto, utilizadas moléculas normalmente usadas para outros propósitos. Como tal o produtor deve-se comprometer a nunca utilizar o leite ou a carne proveniente do animal em tratamento para consumo humano. Outro aspeto muito importante a ser transmitido ao produtor é que o animal apesar de poder vir a apresentar melhorias clínicas, vai continuar a ser uma fonte de infeção. É necessário que o animal seja completamente isolado dos outros animais, principalmente dos mais suscetíveis (St Jean, 1996; Fecteau e Whitlock, 2011).

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis foi já isolado de tecidos dos órgãos

genitais e sémen. A utilização de sémen de animais infetados é considerada segura. No entanto, a grande parte dos centros de inseminação artificial requere que o sémen seja proveniente de animais Map negativos, tornando o tratamento de touros pelo seu potencial genético nem sempre justificável. Também se sabe que a transmissão uterina é uma realidade, mesmo em animais subclínicos, portanto os animais tratados não devem ficar gestantes. Pensa-se, porém, que a técnica de transferência embrionária acarreta riscos mínimos de desenvolvimento de infeção, tanto para o embrião como para o animal que o recebe (St Jean, 1996; Fecteau e Whitlock, 2011).

As substâncias utilizadas para o tratamento da paratuberculose têm de ter a capacidade de penetrar dentro das células de mamíferos. Muitas das substâncias que já

estreptomicina amicacina e canamicina, clofazimina e dapsona. Também se recomendam combinações de algumas destas substâncias (St Jean, 1996; Fecteau e Whitlock, 2011).

A isoniazida funciona ao inibir a biossíntese de ácido micólico, um componente importante da parede celular das micobactérias. No início do tratamento é bactericida, tornando-se bacteriostático à medida que a taxa de replicação vai diminuindo. É bem absorvido por via oral e penetra facilmente nas células. Quando usado sozinho, ou em combinação com outros antibióticos, na dose de 20 mg/kg por dia pode induzir remissão