IDENTIFICAÇÃO DE GDEs

Com base nos valores de fold change (com um limiar acima de quatro vezes de diferença) 64 GDEs foram identificados a partir da comparação entre as duas placentas da mesma paciente falciforme. Entre esses genes, 59 foram superexpressos e cinco foram subexpressos (Tabela 12). Uma visão geral gráfica do perfil de expressão gênica dos casos analisados foi representada por um heatmap na Figura 11.

Os genes identificados foram analisados de acordo com as categorias do Gene Ontology. O enriquecimento de processo biológico foi realizado por meio do programa WebGestalt (GEneSeTAnaLysis Toolkit) [75]. Os dois processos biológicos mais significativos identificados foram a resposta ao cobre (FDR < 0,006 para os genes CYP1A1, AOC1, AQP1 e ATP5D) e depuração de partículas lipoproteicas ricas em triglicérides (FDR < 0,007 para os genes GPIHBP1, APOC1 e APOE).

Tabela 10. Resultados maternos e perinatais da mesma paciente com anemia falciforme em duas gestações diferentes.

Características AF 1a _{gravidez AF 2}a _gravidez

Idade materna 19 21

Primeira consulta médica 10 semanas 11 semanas

Nível de Hb no primeiro trimestre 8,4 mg/dL 7,2 mg/dL

IG na admissão hospitalar (semanas)/ condição médica

13/ crise de dor 17/ crise de dor 20/ infecção respiratória 28/ síndrome torácica aguda / agravamento da anemia 33/ RCF 24/ pneumonia 33/ crise de dor 35/ crise de dor 36/ agravamento da anemia

Transfusão de sangue profilática* Não Sim (28 semanas)

Via de parto Cesárea eletiva Cesárea eletiva

IG do parto 34 semanas 36 semanas

Peso do recém-nascido 1.910 g 2.585 g

Valor do apgar com 5 minutos 10 10

Resultado neonatal Morte neonatal Vivo

Método contraceptivo pós-parto Contraceptivo oral Contraceptivo oral

AF: anemia falciforme; Hb: hemoglobina; IG: idade gestacional; RCF: restrição de crescimento fetal g: gramas

* A transfusão sanguínea profilática tornou-se uma rotina no pré-natal desde setembro de 2011 e visa manter o nível de Hb acima de 9,0 mg / dL para reduzir as complicações maternas e fetais e reduzir a HbS global.

Tabela 11. Características sociodemográficas, resultados maternos e perinatais dos casos incluídos neste estudo.

Número do caso Características sociodemográficas Histórico obstétrico Resultados

maternos Resultados fetais

1-AF 1a gravidez

Cor de pele: não branca Idade materna (anos): 19

Paridade: 0 IG no parto (semanas): 34 Peso da placenta (g): 410 Eclâmpsia

Valor do apgar com 5 minutos: 10 Peso do RN (g):

1.910 UTI Neonatal: sim

2-AF 2a gravidez

Cor de pele: não branca Idade materna (anos): 21

Paridade: 1 IG no parto (semanas): 36 Peso da placenta (g): 540 Sem incidentes

Valor do apgar com 5 minutos: 10 Peso do RN (g):

2.585 UTI Neonatal: não

3-Controle

Cor de pele: branca Idade materna (anos): 21

Paridade: 1 IG no parto (semanas): 38 Peso da placenta (g): 570 Sem incidentes

Valor do apgar com 5 minutos: 10 Peso do RN (g):

3.160 UTI Neonatal: não

4-PE

Cor de pele: branca Idade materna (anos): 20

Paridade: 0 IG no parto (semanas): 33 Peso da placenta (g): 430 PE

Valor do apgar com 5 minutos: 8 Peso do RN (g):

2.115 UTI Neonatal: não

5-RCF

Cor de pele: branca Idade materna (anos): 37

Paridade: 0 IG no parto (semanas): 35 Peso da placenta (g): 515 Sem incidentes

Valor do apgar com 5 minutos: 9 Peso do RN (g):

1.640 UTI Neonatal: sim AF: anemia falciforme; PE: pré-eclâmpsia; RCF: restrição do crescimento fetal; IG: idade gestacional; RN: recém-nascido; UTI: unidade de terapia intensiva; g: gramas

Figura 11. Visão macroscópica das placentas de uma mesma paciente com AF em duas gestações diferentes. Os lados materno (painel A) e fetal (painel B) da placenta de uma gravidez complicada por pré-eclâmpsia grave. Os lados materno (painel C) e fetal (painel D) da placenta de uma gravidez sem pré-eclâmpsia. A- extensa deposição de fibrina e calcificações em cerca de 40% da superfície materna (metade baixa da figura), B- cordão umbilical com inserção de cordão anormal (velamentosa, seta preta), C- cotilédones bem definidos, sem anormalidades macroscópicas, D- cordão umbilical espiralado (seta preta) com inserção paracentral (seta vermelha).

Tabela 12. Genes diferencialmente expressos segundo comparação da placenta da mesma paciente com anemia falciforme em sua primeira gestação complicada, com pré-eclâmpsia e restrição de crescimento fetal (AF + PE + RCF) com a placenta de sua segunda gestação não complicada (AF). 1a gestação vs. 2a gestação.

Gene AF + PE + RCF vs. AF fold change PSG9 -5,48 NAA11 -4,85 CPXM2 -4,30 USP6 -4,15 PSG4 -4,12 LAMA3 4,00 HSPB1 4,00 FBXL15 4,00 ACTG2 4,00 AQP1 4,00 ATP5D 4,00 DKK1 4,00 GPIHBP1 4,00 IRF7 4,00 NDUFS7 4,00 PRG2 4,00 ROMO1 4,00 WDR18 4,00 KRT17 4,02 B3GNT7 4,02 PRKY 4,05 CAPG 4,05 ODF3B 4,05 IL1R2 4,07 CDKN1C 4,08 KRT14 4,09 SCAND1 4,14 CST6 4,14 COMP 4,16 MRPL12 4,18 HN1 4,18 PPP1R14A 4,21 COX5B 4,26 FSTL3 4,28 NOS2 4,29 CLDN5 4,29 SOX18 4,33 GKN1 4,34

ALKBH7 4,34 CKB 4,35 TSPO 4,38 HLA-DRB5 4,39 NME3 4,44 SYT8 4,45 ADAMDEC1 4,51 AOC1 4,52 APOC1 4,53 APOE 4,55 VASN 4,55 HBM 4,59 CEBPD 4,60 PPDPF 4,67 B3GNT3 4,81 CRLF1 4,87 HLA-G 4,89 RAMP3 4,89 NOG 4,99 CCDC85B 5,04 SELENOM 5,11 CYP1A1 5,18 ASCL2 5,24 CFD 5,28 NOTUM 5,64 TAC3 5,84

Figura 12. Heatmap gerado a partir dos 64 genes com a maior diferença de expressão entre as amostras de placenta da primeira gestação (AF + PE + RCF, n = 1) e segunda gestação (AF, n = 1). Para comparação, também foram incluídas amostras placentárias de pacientes com restrição de crescimento fetal (RCF, n = 1), pré-eclâmpsia (PE, n = 1) e um controle saudável. A figura representa a agrupação hierárquica dos valores de expressão gênica dos 64 genes. Níveis de expressão aumentados estão marcadas em vermelho e níveis de expressão diminuídos estão representados em azul; branco não reflete diferença nos níveis de expressão.

3.5 DISCUSSÃO

Alterações induzidas pelo ambiente nos fenótipos morfológicos e moleculares da placenta podem fornecer informações relevantes para a fisiopatologia das doenças [107]. A rara oportunidade de avaliar a mesma paciente com AF em duas gestações diferentes, com desfechos opostos, pode comprovar tal conceito. A comparação com outras condições de envolvimento placentário conhecidos fortalece esses achados.

A gravidez em pacientes com AF é conhecida por representar um risco maior para desenvolvimento de PE e RCF, complicações associadas com anormalidades placentárias significativas. A primeira gravidez representa uma situação típica de alto risco envolvendo uma paciente com AF durante a gravidez, com várias internações hospitalares, PE prematura grave, eclâmpsia e RCF. Em comparação, sua segunda gravidez foi quase sem intercorrências. Acreditamos que a vigilância cuidadosa, a profilaxia para PE e as transfusões de sangue programadas contribuíram significativamente para um desfecho mais favorável, sem maiores complicações. A diminuição da HbS durante a gestação em mulheres com AF parece diminuir a hemólise e a VOC e prevenir seus efeitos na placenta, portanto a transfusão sanguínea pode ser mais benéfica se iniciada durante o segundo trimestre ou até mais cedo durante o primeiro trimestre de gestação [59].

A morfologia das placentas ajuda a exemplificar o efeito da PE na arquitetura placentária. Além disso, a análise molecular permitiu descobrir diferenças significativas na expressão gênica com uma análise pareada entre placentas da mesma paciente, e explorar ainda mais a comparação com controle saudável e placentas de pacientes com gestações complicadas sem AF. Observamos semelhanças na expressão gênica entre as placentas com PE, RCF e AF com PE e RCF. Estes dados concordam com um estudo anterior mostrando um perfil de expressão gênica comum entre PE e RCF [108]. Uma possível interpretação é de que PE e um subconjunto de RCF são de fato manifestações do mesmo distúrbio causado por falha na invasão trofoblástica levando a uma vasculatura anormalmente rasa e remodelação prejudicada das artérias espiraladas, e que as diferenças restantes dependem do grau de gravidade [109].

Ao contrário de PE e RCF, as placentas de mulheres com AF raramente foram estudadas. Em nosso estudo anterior [59] demonstrou-se que há mudança na expressão de alguns genes associados à resposta inflamatória, sugerindo que o estado inflamatório crônico na DF pode afetar a fisiologia placentária. Uma vez que tanto a DF como a PE podem prejudicar o desenvolvimento adequado da placenta e levar a complicações materno-fetais, a associação clínica entre DF e PE pode ser explicada por ambas as doenças compartilhando uma base genética comum, afetada pela desregulação dos genes envolvidos na resposta inflamatória e

disfunção do endotélio vascular. Além disso, o aumento do heme livre é um fator comum entre PE, RCF e DF e pode ser um dos responsáveis pela mudança na fisiologia placentária.

A hemólise intravascular, comum em pacientes com DF, é um processo recorrente que causa inflamação crônica. A liberação de mediadores inflamatórios e o recrutamento de leucócitos e hemácias para o endotélio, consequentemente, resultam em disfunção endotelial e VOC, principalmente na microcirculação [110]. Esse processo ocorre com maior frequência durante a gestação, levando à liberação do heme. Por outro lado, em PE e RCF, os níveis de HbF e heme livres foram encontrados aumentados na circulação fetoplacentária e materna [111, 112]. O heme é considerado um DAMP na circulação. DAMPs podem ativar múltiplas vias inflamatórias, incluindo ativação endotelial [96]. De acordo com Prophet e colaboradores, como as mães com DF já têm processos em andamento que danificam o endotélio vascular materno, isso poderia explicar a incidência de PE em pacientes com AF [113]. Além de ser identificado como um DAMP pelo sistema imunológico, um estudo de Liu e colaboradores identificou o heme como um agente inibidor da fusão dos trofoblastos, ou seja, citotrofoblastos não conseguem realizar adequada fusão para dar origem aos sinciciotrofoblastos (camada multicelular externa da vilosidade) [98]. Devido a essa falha na diferenciação dos citotrofoblastos, a placenta pode ficar comprometida na troca de nutrientes e oxigênio, e, assim, prejudicar o crescimento fetal. Portanto, o aumento do heme pode ser um dos fatores envolvidos no maior risco de PE em pacientes com DF. No entanto, nem todos os pacientes com DF desenvolvem PE, e o caso estudado permitiu investigar se existe um perfil de expressão gênica mais associado à PE no contexto da DF.

Entre os GDEs observados como sendo mais superexpressos na placenta de AF com PE em comparação com todas as outras placentas, os genes HLA-G, TAC3, AOC1, B3GNT7, IL1R2 e PRG2 merecem destaque, porque são genes específicos para trofoblastos extravilosos, ou altamente expressos nestas células [83]. Isso sugere que o desenvolvimento de PE na AF pode estar associado a um aumento na síntese de proteínas derivadas de trofoblastos extravilosos.

A expressão aumentada de HLA-DRB5 em AF associada a PE é notável, pois a ausência da expressão de HLA do complexo principal de histocompatibilidade de classe II nos trofoblastos impede a alorreatividade das células T maternas contra os antígenos paternos, permitindo, assim, uma tolerância placentária. A expressão aberrante de HLA-DR na PE foi relatada recentemente [114] e os resultados do presente estudo confirmam que a superexpressão placentária do gene HLA-DRB5 parece estar associada ao desenvolvimento de PE na AF. Além disso, existem evidências que associam certos haplótipos HLA-DRB com o aparecimento de aloanticorpos ou autoanticorpos contra antígenos de glóbulos vermelhos em pacientes com DF,

implicando que a expressão anormal de HLA-DR pode sustentar a existência de um sistema imunológico desregulado em DF que poderia favorecer PE [115].

Curiosamente, cinco genes (CPXM2, USP6, NAA11, PSG4 e PSG9) foram reprimidos na AF combinada com PE, bem como em RCF. Destes genes, dois são glicoproteínas específicas da gravidez (PSGs) secretadas pelo sinciciotrofoblasto [116]. Baixos níveis de PSG estão associados a resultados adversos da gravidez, incluindo RCF, PE e aborto espontâneo, sugerindo a importância dos PSGs para uma gravidez bem-sucedida [117-119]. Para elucidar ainda mais o papel dos PSGs, Jones e colaboradores mostraram que PSG9 é importante para a indução da tolerância imunológica durante a gravidez [120]. Isso sugere novamente que, em gestantes com AF, a tolerância imunológica pode ser diminuída com um consequente ataque à placenta, favorecendo o desenvolvimento de PE.

Um dos processos biológicos mais significativos identificados em associação com PE incluiu genes envolvidos na resposta ao cobre (CYP1A1, AOC1, AQP1 e ATP5D). Tal fato pode estar relacionado a descrições prévias da associação entre níveis aumentados de cobre e a ocorrência e a gravidade da PE [121] e com algumas populações de pacientes com DF [122], embora o mecanismo exato pelo qual os níveis desse metal aumentam nessas doenças seja desconhecido.

O gene AQP1 codifica uma aquaporina específica de canal de água que aumenta a permeabilidade da bicamada lipídica da membrana celular à água. Estudos prévios também demonstraram a expressão de AQP1 em células de trofoblastos humanos e de camundongos [123] e esta proteína tem sido associada à gestação normal, ao crescimento fetal e à homeostase do volume de líquido amniótico [124]. A expressão desregulada de AQP1 também está relacionada a anormalidades placentárias [125] e PE [126]. A expressão aumentada de AQP1 no caso da gestante falciforme com PE pode estar envolvida na desregulação da produção de líquido amniótico e no desenvolvimento de oligoidrâmnio [127].

A regulação positiva de genes envolvidos na depuração de partículas de lipoproteínas ricas em triglicérides dos genes GPIHBP1, APOC1 e APOE e CYP1A1 sugere um mecanismo de defesa dos trofoblastos contra triglicerídeos em PE [128,129]. Uma associação entre os marcadores hemolíticos e os níveis de triglicerídeos foi demonstrada em pacientes com DF [130], de modo que o perfil de expressão gênica observado pode recapitular a gravidade da hemólise e seus efeitos sobre a placenta.

Como limitação, o pareamento das pacientes foi imperfeito, com algumas diferenças significativas em idade e paridade, embora a etnia, o status de tabagismo e o tipo de parto foram semelhantes entre as amostras. As amostras de placenta usadas incluíram várias populações

celulares, de forma que não foi possível determinar quais células em particular na placenta estão regulando positiva ou negativamente a expressão dos genes investigados. Este é um resultado preliminar e seria necessário estudar um grande número de pacientes, incluindo alguns estudos confirmatórios com proteínas. A importância deste estudo é a oportunidade única de explorar como o manejo clínico durante a gravidez pode afetar os resultados maternos / perinatais e o desenvolvimento placentário em uma gestante com AF.

Em conjunto, nossos resultados sugerem que a associação clínica entre DF e PE pode ser apoiada por mecanismos fisiopatológicos comuns, mas que as vias que envolvem a resposta ao metabolismo do cobre e triglicerídeos podem ser importantes impulsionadores da fisiopatologia da PE. Como e até que ponto as intervenções clínicas atualmente usadas para tratar gestantes falciformes afetam essas vias precisam ser investigadas. Futuros estudos utilizando RNA-Seq placentário em um número maior de amostras devem confirmar esses achados e explorar vias importantes envolvidas na fisiopatologia da PE e sua relação com a DF. Este capítulo foi publicado e encontra-se online intitulado: Different morphological and gene expression profile in placentas of the same sickle cell anemia patient in pregnancies of opposite outcomes [131].

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