2.3.1 COLETA
As placentas (armazenadas a 4 °C) foram coletadas dentro de 3 horas após o parto. Amostras de tecido das vilosidades placentárias foram selecionadas aleatoriamente a partir das áreas centrais próximas ao cordão umbilical, como descrito anteriormente [69]. Antes da coleta, as placentas foram pesadas e fotografadas. As amostras foram coletadas (~200 mg) em três regiões diferentes, evitando áreas de infartos visíveis ou calcificações. Em seguida, foram então separadas em três amostras iguais e lavadas com tampão fosfato salino para remover o sangue materno residual. Imediatamente após a coleta, os tecidos foram congelados em nitrogênio líquido e armazenados a –80 °C até a extração do RNA. O protocolo de coleta encontra-se no anexo 3.
2.3.2 EXTRAÇÃO DE RNA
O RNA total foi extraído com o TRIzol Reagent (Ambion), seguido pelo RNeasy Mini Kit (Qiagen). O nível de pureza e a concentração do RNA total foram medidos utilizando-se o espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) e a integridade do RNA foi verificada por leitura no equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).
2.3.3 SEQUENCIAMENTO DE RNA
Amostras de RNA com RIN ≥ 5 foram enviadas ao Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho (LacTad) – Unicamp para a preparação das bibliotecas e realização dos sequenciamentos de RNA (RNA-seq). No total foram sequenciadas seis amostras placentárias do grupo HbSC, cinco amostras placentárias do grupo HbSS e quatro amostras placentárias do grupo controle (HbAA). O número de amostras de cada grupo para sequenciamento foi limitado pelo número de amostras de tecido placentário obtidas por cesárea eletiva. Optou-se por sequenciar amostras provenientes somente de cesárea eletiva para eliminar possíveis interferências de expressão gênica das vias de estresse oxidativo e inflamatória presentes no parto vaginal. Bibliotecas de DNA complementares (DNAc) foram preparadas por meio do kit de preparação de amostras Illumina TruSeq RNA de acordo com o protocolo do fabricante (Illumina). As bibliotecas de DNAc foram sequenciadas em ambas as extremidades pela plataforma Illumina HiSeq2500, e foram produzidas leituras paired-end de ~100pb.
2.3.4 PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS
Os resultados de RNA-Seq foram enviados com a extensão fastq e utilizou-se o programa FastQC versão 0.11.5 [70] para a verificação da qualidade das bibliotecas. A montagem do transcriptoma foi feita usando como referência o genoma humano GRCh38.88 por meio do programa STAR [71]. A expressão gênica diferencial e normalização foram realizadas utilizando-se o pacote DESeq2 [72].
Após as análises, classificaram-se como genes diferencialmente expressos (GDEs) aqueles com diferença de pelo menos duas vezes de fold change e para controlar a taxa de erro global utilizou-se o ajuste de FDR com o nível de significância (α) igual a 5%. A categorização funcional dos genes foi determinada de acordo com o Gene Ontology (GO) [73] e para a identificação das vias foi realizada a anotação com o Kegg Orthology [74]. O programa WebGestalt [75] foi utilizado para ambas as análises. Os heatmaps foram construídos por meio de uma ferramenta web denominada ClustVis [76] a partir dos GDEs e as clusterizações foram feitas pelo método de Correlação de Pearson.
2.3.5 VALIDAÇÃO DAS ANÁLISES TRANSCRICIONAIS POR qPCR
Para a validação dos resultados obtidos através do RNA-Seq foram selecionados cinco genes que apresentaram diferença de expressão nas amostras placentárias de pacientes HbSS (n=10) e cinco genes que apresentaram diferença de expressão nas amostras placentárias de pacientes HbSC (n=15) em relação às placentas do grupo controle (n=21).
2.3.5.1 SÍNTESE DE DNAc
Para retirar qualquer contaminação do RNA com moléculas dupla fita, 1 μg de cada RNA extraído foi tratado com 1 μL da enzima DNAseI (Fermentas, Thermo Scientific) e 1 μL de DNAseI reaction buffer 1X (Tris-HCl 20 mM, MgCl2 2 mM, KCl 50 mM), em um volume final de 10 μL. A reação foi incubada por 30 min com temperatura de 37 °C e interrompida para a adição de EDTA 2,27 mM e novamente incubada por 10 min a 65 °C. A síntese de DNAc procedeu-se a partir do RNA previamente tratado com DNAseI, mediante o kit RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis (Fermentas), seguindo as recomendações do fabricante. A concentração de DNAc foi estimada utilizando-se o espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).
2.3.5.2 DESENHO DE PRIMERS PARA qPCR, PADRONIZAÇÃO DAS REAÇÕES E EFICIÊNCIA DE REAÇÃO
As sequências do RNA mensageiro (RNAm) foram obtidas do banco de dados National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). Os primers foram desenhados, sempre que possível, em éxons diferentes e com temperatura de anelamento de 60 ºC. Posteriormente, as sequências selecionadas foram submetidas aos programas: Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) para confirmação de homologia com o gene de interesse, e GeneRunner, para avaliação das estruturas formadas (hairpins, dimers, etc).
Para a padronização da reação de qPCR foram determinadas três concentrações (70 nM, 150 nM e 300 nM) dos primers (sense e anti-sense), sendo selecionada a concentração ideal em que o gene alvo foi amplificado mais precocemente (menor valor de Ct – cycle threshold). Os primers utilizados e suas concentrações estão listados na Tabela 1.
Tabela 1. Genes escolhidos para validação e suas respectivas sequências, concentrações utilizadas e tamanho dos primers.
Genes Sequência dos primers Concentração
(nM) Produto (pb) ACTB F: TGACCCAGATCATGTTTGAGACC R: CAGAGGCGTACAGGGATAGCA 150 81 GAPDH F: AAGATCATCAGCAATGCCTCCT R: GGTCATGAGTCCTTCCACGATAC 150 96 ASCL2 F: CACTGCTGGCAAACGGAGAC R: AAAACTCCAGATAGTGGGGGC 150 98 CXCL10 F: CCACGTGTTGAGATCATTGCTAC R: GAGATCTTTTAGACCTTTCCTTGCT 150 121 HLAG F: CAGATACCTGGAGAACGGGA R: CAGTATGATCTCCGCAGGGT 300 139 IL1R2 F: ATGTTGCGCTTGTACGTGTTG R: CCCGCTTGTAATGCCTCCC 150 112 CXCL11 F: TGTTCAAGGCTTCCCCATGT R: TGGGTACATTATGGAGGCTTTCT 150 106 S100A8 F: ATCAGGAAAAAGGGTGCAGAC R: ACGCCCATCTTTATCACCAG 150 104 CPXM2 F: AACATCCAGGCGGGCATTA R: CACCCAGTCACTCAGCCAGA 150 162
CAMP F: GACCCAGACACGCCAAAG
R: TCACCAGCCCGTCCTTCT 150 109
NOS2 F: TGAACACATCTGCAGACACG
R: GGTAGCCAGCATAGCGGAT 150 140
F = forward, R = reverse e pb = pares de bases.
A confiabilidade e reprodutibilidade da qPCR estão diretamente relacionadas com a eficiência da reação. Assim, uma reação é realizada utilizando-se a concentração de primers selecionada e diluições seriadas (6,32 ng; 20,0 ng; 63,26 ng; 120,0 ng; 200,0 ng e 632,6 ng) de uma amostra, obtendo-se uma curva cujo valor da inclinação (slope) é aplicado à fórmula [10 (-1/slope) -1] x 100 = 100%, resultando no valor percentual de eficiência de reação. Foram aceitas como ótimas as curvas que apresentaram valores entre 99 e 100% e correlação acima de 0,98. Um exemplo de padronização de primers pode ser visualizado na figura 5.
Figura 5. Padronização da concentração do par de primers que amplifica o gene ASCL2. A figura mostra a curva de amplificação da diluição em seis concentrações de cDNA (6,32 ng; 20,0 ng; 63,26 ng; 120,0 ng; 200,0 ng e 632,6 ng), a curva de melting dos primers (79,48°C),
indicando a especificidade da amplificação, e a curva padrão com 100% de eficiência e 0,996 de correlação.
2.3.5.3 PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL (qPCR)
As reações de PCR foram preparadas com o reagente SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems – Life Technologies Corp.) e a detecção de amplificação em tempo real foi realizada no equipamento Step One Plus (Applied Biosystems). Para todas as amostras foram realizadas reações com 12 μL de volume final; sendo 6,0 μL do reagente SYBR Green PCR Master Mix, 3,0 μL de mix de amostra de DNAc (10 ng/μL de concentração final) e 3,0 μL do mix de primer. As amostras foram amplificadas em duplicata, com o uso de controles negativos para cada primer com poços contendo água estéril em substituição à amostra. O programa foi iniciado a 95 °C/10 minutos, seguido de 40 ciclos: 95 °C/15 s e 60 °C/1 min. Posteriormente, adicionou-se uma etapa de 20 min, na qual a temperatura aumenta gradualmente de 60°C para 95°C para a realização da curva de Melting.
2.3.5.4 ANÁLISE DOS DADOS DE qPCR E ESTATÍSTICA
Todas as análises das reações de qPCR foram realizadas a partir da quantificação relativa baseada na fórmula de 2^(-ΔCt). Os valores da expressão foram normalizados em relação aos controles endógenos ACTB e GAPDH. Os resultados foram indicados em média e desvio padrão. Os gráficos e os cálculos foram obtidos por meio do programa GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). O teste de Mann-Whitney foi utilizado para avaliar a diferença de expressão entre os dois grupos e valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.