LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
2.4 Identificação do sistema SptRS de S sanguinis
A cepa S. sanguinis SK36 (NC_009009.1) utilizada neste trabalho possui seu genoma sequenciado e concluído (Xu et al., 2007; Ge et al., 2008). S.
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(capacidade de captação de DNA exógeno) e apresenta características como adesão a componentes salivares adsorvidos à hidroxiapatita e virulência em modelos de endocardite bacteriana (Xu et al., 2007). O genoma de S. sanguinis é composto por um cromossomo circular de 2.388.435pb (7 a 25% maior do que o de diversas espécies de estreptococos, como S. mutans, S. pneumoniae e S.
pyogenes) e apresenta a maior proporção de C+G em comparação com as
mesmas espécies, sendo de 43,4%. Seu genoma parece codificar um total de 2.274 proteínas, sendo que 1.353 genes são compartilhados entre S. sanguinis, S.
mutans e S. pneumoniae. Outros 170 genes são compartilhados apenas com S. pneumoniae, enquanto que 19 são compartilhados apenas com S. mutans. S. pyogenes M1 (NC_0027371) que foi utilizado como referência no proposto
trabalho compartilha 613 genes com S. sanguinis. S. sanguinis SK36 contém pelo menos 14 SDC (sistema de dois componentes) completos, sendo que análises preliminares de mutantes dos genes sptR, sptS e sptRS destes sistemas foram realizados por Camargo, 2014.
Utilizando- se o programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) do site
National Center for Biotechnology Information (NCBI – http://www.ncbi.nlm.nhi.goc) foi possível obter as sequências das proteínas que compõem o sistema SptRS em S. sanguinis SK36 e S. pygenes M1 , e por análise comparativa dos genomas identificou - se proteínas que possuem alta similaridade no genoma de S. sanguinis SK36 em relação ao sistema SptRS de S. pyogenes M1 que já se encontra caracterizado, e descrito como um sistema importante para adaptação a saliva (Shelburne et al., 2005). O contexto genômico e índices de similaridade das sequências de aminoácidos dos genes sptRS em S. sanguinis e
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Figura 2: Contexto e localização genômica dos genes SSA_1793 (sptS) e SSA_ 1794 (sptR) de S.
sanguinis SK36 e os genes Spy_ 0874 (sptR) e Spy_ 0875 (sptS) de S. pyogenes M1.
Tabela 1: Similaridade entre o sistema SptRS de S. pyogenes M1 e respectivo ortólogo
identificado em S. sanguinis SK36 através de análise de BLAST.
Cepa bacteriana Gene Tamanho ID do gene Proteína Similaridade
S. pyogenes M1 Spy 0875 (S) 1230pb 901033 NP_269074 52% Spy 0874 (R) 669pb 901032 NP_269073 66% S. sanguinis SK 36 SSA_1793(S) 1240 pb 4807906 YP_001035725 52% SSA_1794(R) 705 pb 4807623 YP_001035726 66%
A identidade dos genes e números de acesso foram identificados no
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nhi.gov/GenBank). A jusante do locus
SSA_1793/1794 estão genes transcritos em sentido contrário. O gene SSA_1791
(acyp) codifica acilfosfatase que catalisa a hidrólise de acilfosfato e participa de três vias metabólicas importantes: glicólise/gliconeogênese, metabolismo do piruvato e degradação do benzoato; SSA_ 1792 (yidC) codifica a proteína precursora OxaA-like envolvidos na biogênese das proteínas da membrana. O
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gene SSA_1795 localizado a montante de sptR, codifica a enzima guanosina 3 ', 5'-bis pirofosfato-sintetase (ppGpp) que causa inibição da síntese de RNA quando ocorre falta de aminoácidos, influenciando o padrão de expressão gênica global da célula de muitos genes necessários para a sobrevivência em condições estressantes. Alvos de ppGpp incluem operons de rRNA podendo afetar a fisiologia bacteriana em diferentes aspectos: inibir o crescimento por inibir a síntese de proteínas, regulamentar número ribossômico, inibir a replicação do DNA e atuar a nível de transcrição gênica; e SSA_1796 (greA) que codifica o fator de alongamento para a transcrição gênica, sendo importante para eficiente alongamento da transcrição pela RNA polimerase (Xu et al., 2007). O alinhamento proteico das proteínas reguladora e sensora, estão demonstrados nas Figuras 3 e 4.
Figura 3: Sequência de SptR (Spy_0874) identificada no genoma de Streptococcus pyogenes comparada
com a sequência proteica de SptR (SSA_1794) em S. sanguinis. Asteriscos indicam resíduos de aminoácidos idênticos, dois pontos indicam as substituições de aminoácidos conservadas e um ponto substituições semi- conservadas. O alinhamento múltiplo foi realizado utilizando o programa CLUSTAL W (2.1).
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Figura 4: Sequência de SptS (Spy_0875) identificada no genoma de Streptococcus pyogenes comparada
com a sequência proteica de SptS (SSA_1793) em S. sanguinis. Asteriscos indicam resíduos de aminoácidos idênticos, dois pontos indicam as substituições de aminoácidos conservadas e um ponto substituições semi-conservadas. O alinhamento múltiplo foi realizado utilizando o programa CLUSTAL W (2.1).
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Além da identificação do sistema de dois componentes SptRS em S.
sanguinis, foram pesquisados genes de interesse envolvidos em virulência e
viabilidade em saliva. Os genes descritos por Shelburne et al., (2005), em S.
pyogenes foram cruzados contra o genoma de S. sanguinis através da análise de
BLAST das sequências proteicas, e as similaridades encontradas estão descritas nas Tabelas 2 e 3. Alguns desses genes foram utilizados nas análises de qPCR, bem como outros genes relacionados à formação de biofilmes, crescimento planctônico e biogênese de parede celular (ssapcsB, SSA_0094, gtfP e cwdP), à resposta ao estresse oxidativo e produção de peróxido de hidrogênio (ccpA, spxB,
ackA e tpK). Os genes mecA, prtS, ssaB, e gldA também foram utilizados nas
análises. O gene mecA é uma proteína adaptatória implicada na sinalização celular, que possivelmente codifica um fator de virulência em espécies de estreptococos (Shelburne et al., 2005). Em S. sanguinis ainda não há dados sobre
mecA, porém codifica também uma proteína adaptatória com função na
sinalização celular; prtS é um gene que codifica uma serina protease que catalisa a quebra de ligações peptídicas em proteínas, participando do metabolismo proteico e possivelmente envolvida na integridade do envelope celular (Xu et al., 2007); ssaB codifica proteínas transmembranares utilizadas no transporte de Manganês e Zinco (Sistema de transporte ABC Mn/Zn), importantes para a viabilidade celular, virulência de S. sanguinis em modelos de endocardite infecciosa e patogenicidade (Makhlynets et al., 2013), além disso está envolvido na aderência a matriz extracelular de biofilmes, contribuindo para a formação e acúmulo da placa dental (Xu et al., 2007); e o gene gldA codifica uma glicerol deidrogenase, implicada no metabolismo glicerol lipídico (Xu et al., 2007).
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Tabela 2: Similaridade encontrada através da análise de BLAST entre os prováveis genes de virulência
de S. pyogenes MGAS5005 M1 e ortólogos encontrados em S. sanguinis SK 36.
Fatores de Virulência
S. pyogenes Função Ref. Ortólogo S. sanguinis (%) Função da proteína ortóloga Ref.
Spy_0267: cbf Participa da atividade catalítica e ligação de ácido nucléico.
1 SSA_2116: cbf (80%) Participa da atividade catalítica e ligação de ácido nucléico.
7
Spy_0731: eno
Codifica a enzima fosfopiruvato hidratase, da família das liases. Fundamental para a glicólise e
gliconeogênese.
2, 3 SSA_0886: eno (94%)
Codifica a enzima fosfopiruvato hidratase, da família das liases. Fundamental para a glicólise e
gliconeogênese. 7 SPy_0453: mtsA Codifica proteínas transmembranares (Sistema de
transporte ABC) que utilizam ATP para translocação de substratos através da membrana.
Papel importante na resposta ao estresse ambiental, e são essenciais para a viabilidade
celular, virulência e patogenicidade.
1, 4 SSA_ 0260: ssaB (78%)
Codifica proteínas transmembranares utilizadas no transporte de Manganês e Zinco. (Sistema de transporte ABC Mn/Zn).
Importantes para a viabilidade celular, virulência e patogenicidade.
7
SPy_0416: prtS
Codifica uma proteinase possivelmente envolvida na integridade do envelope celular.
1, 5 SSA_1882: prtS (43%)
Codifica uma proteína serina protease que cliva ligações peptídicas em proteínas. Importante
no mecanismo catalítico.
7
SPy_2216: htrA
Codifica possivelmente uma serina protease que cliva ligações peptídicas em proteínas.
Importante no mecanismo catalítico.
1 SSA_2381: htrA (54%)
Codifica a proteína DegP que atua como protease, degradando proteínas. Importante na catálise
enzimática.
7
SPy_0281: mecA
Codifica proteína adaptadora (acessória) de principais proteínas em uma via de transdução de sinal. Importante
na sinalização celular.
1 SSA_1958: mecA (50%)
Codifica proteína adaptadora (acessória) de principais proteínas em uma via de transdução de sinal.
Importante na sinalização celular. 7
SPy_2007: Imb
Codifica proteína da lâmina basal de adesão dos tecidos. Importantes para a adesão
celular.
1, 6 SSA_1340 (64%)
Codifica proteínas transmembranares (Sistema de Transporte ABC) utilizadas para o
transporte de Zn/Mn.
7
*A função provável dos genes foi identificada através de análises de BLAST das sequências proteicas e pesquisa de domínios funcionais.
1Ferretti JJ, et al. 2001; 2Ehinger S, et al. 2004; 3Ferretti JJ, et al. 2001; 4Janulczy R, et al. 1999; 5Edwards RJ, et al. 2005; 6Terao Y, et al. 2002; 7Xu P, et al. 2007.
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Tabela 3: Similaridade encontrada através de análise de BLAST entre os prováveis genes de metabolização de
carboidratos complexos de S. pyogenes MGAS5005 M1 e ortólogos encontrados em S. sanguinis SK 36.
Metabolismo de Carboidratos complexos
S.pyogenes Função Ref. Ortólogo S. sanguinis % Função da proteína ortóloga Ref.
SPy_1291: glgP
Codifica provavelmente glicogênio fosforilase. Participa do processo
metabólico de carboidratos. Quebra de glucanos.
1 SSA_ 2265: maIP (70%)
Codifica maltodextrina fosforilase. Participa do processo metabólico de
carboidratos. Quebra de glucanos. 7 SPy_1296: malG
Codifica permease (Sistema de transporte ABC), proteína de membrana para o transporte de maltose e maltodextrina.
Importante para absorção celular.
1 SSA_1300 (73%)
Codifica permease (Sistema de transporte ABC), proteína de membrana para o transporte de maltose. Importante para
absorção celular.
7
SPy_2047: gldA
Codifica glicerol deidrogenase. Participa do metabolismo
glicerol lipídico.
1
SSA_0287: gldA (77%)
.
Codifica glicerol deidrogenase. Participa do metabolismo glicerol lipídico. 7 SPy_0174: uIaA
Codifica Sistema Fosfotransferase específico para ascorbato (vitamina C). Sistema de transporte subunidade IIC.
Importante para absorção celular
1
SSA_2093: sgaT (81%)
Codifica Sistema Fosfotransferase específico para ascorbato (vitamina C).
Sistema de transporte subunidade IIC. Importante para absorção celular
7
SPy_0179: araD
Codifica a L-ribulose-5 phosphate-4 epimerase. É uma isomerase que catalisa a
interconversão de ribulose 5-fosfato e Xilose 5-fosfato na fase oxidativa da via das
pentoses. Importante para mecanismo enzimático.
1
SSA_2088: araD (80%)
Codifica a L-ribulose-5 phosphate-4 epimerase. É uma isomerase que catalisa
a interconversão de ribulose 5-fosfato e Xilulose 5-fosfato na fase oxidativa da via das pentoses. Importante para mecanismo
enzimático.
7
SPy_1704:lacD Codifica tagatose 1,6 difosfato aldolase.
Participa do metabolismo da galactose.
1 SSA_1696: lacD (69%) Codifica tagatose 1,6 difosfato aldolase.
Participa do metabolismo da galactose. 7
SPy_0855
Codifica Sistema Fosfotransferase Frutose
específico (Componente ABC II) 1 SSA_1082: fruA (72%)
Codifica Sistema Fosfotransferase Frutose específico (Componente ABC II) 7
SPy_1986
Codifica Sistema Fosfotransferase Glicose específico (EIIC BA componente). Transporta especificamente glicose.
1 SSA_1089: ptsG (69%)
Codifica Sistema Fosfotransferase Glicose específico (EIIC BA componente). Transporta especificamente glicose.
7
SPy_1916: lacG
Codifica a enzima 6- fosfato-beta galactosidase. É uma hidrolase que catalisa a hidrólise da lactose em monossacarídeos.
1 SSA_1692: lacG (90%)
Codifica a enzima 6- fosfato-beta galactosidase. É uma hidrolase que
catalisa a hidrólise da lactose em monossacarídeos.
7
SPy_1922: lacB
codifica a enzima galactose-6-fosfato 1 SSA_1698: lacB (74%) Codifica a enzima galactose-6-fosfato 7
*A função provável dos genes foi identificada através de análises de BLAST das sequências proteicas e pesquisa de domínios funcionais. 1Ferretti JJ, et al. 2001;7 Xu et al., 2007;
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21 3 PROPOSIÇÃO
O objetivo do trabalho foi investigar a participação do sistema de dois componentes SptRS de S. sanguinis na biologia e adaptação desta espécie ao contato com a saliva humana. Para isto, os objetivos específicos deste trabaho incluíram:
1. Construir mutantes knockout dos genes sptR (SSA_1794) e sptS (SSA_1793) isoladamente ou em conjunto a partir da cepa S. sanguinis SK36.
2. Comparar os mutantes de sptR (SKsptR-), sptS (SKsptS-) e sptRS (SKsptRS-) com a cepa selvagem SK36 quanto à morfologia, ao crescimento planctônico, formação de biofilmes e liberação de DNA genômico para o meio extracelular, produção de peróxido de hidrogênio e à sensibilidade ao estresse oxidativo.
3. Analisar o efeito da inativação de sptS, sptR ou SptRS na viabilidade e persistência de S. sanguinis SK36 em saliva humana.
4. Analisar o efeito da inativação de sptS e sptR na expressão de genes possivelmente envolvidos nos fenótipos alterados nos mutantes SptRS.
5. Comparar a expressão dos ortólogos dos genes alvo de SptRS de S.
pyogenes envolvidos na virulência (cbf, eno, ssaB, prtS, htrA e mec) ou em
adaptações às condições nutricionais salivares (malP, gldA e lacD) entre as cepas cepas SK36 e mutantes SKsptR- e SKsptS-.
23 4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Cepas e plasmídeos selecionados para o estudo e condições de