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TARSILA MENDES DE CAMARGO
CARACTERIZAÇÃO DO SISTEMA DE DOIS COMPONENTES SptRS DE
STREPTOCOCCUS SANGUINIS COM POSSÍVEL PAPEL NA VIABILIDADE
EM SALIVA HUMANA
PIRACICABA 2014
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Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Odontologia de Piracicaba
TARSILA MENDES DE CAMARGO
CARACTERIZAÇÃO DO SISTEMA DE DOIS COMPONENTES SptRS DE
STREPTOCOCCUS SANGUINIS COM POSSÍVEL PAPEL NA VIABILIDADE
EM SALIVA HUMANA
PIRACICABA 2014
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Biologia Buco - Dental na área de Microbiologia e Imunologia.
Orientador (a): Prof(a). Dr(a). Renata de Oliveira Mattos- Graner
Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida por Tarsila Mendes de Camargo e orientada pela Prof(a). Dr(a). Renata de Oliveira Mattos- Graner.
_________________________________________________________ Assinatura da orientadora
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba Marilene Girello - CRB 8/6159
Camargo, Tarsila Mendes de,
C14a CamCaracterização do sistema de dois componentes SptRS de Streptococcus sanguinis com possível papel na viabilidade em saliva humana / Tarsila Mendes de Camargo. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2014.
CamOrientador: Renata de Oliveira Mattos Graner.
CamTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
Cam1. Saliva. I. Mattos-Graner, Renata de Oliveira,1971-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Characterization of the component system SptRS of Streptococcus
sanguinis with putative role in bacterial viability in human saliva
Palavras-chave em inglês:
Saliva
Área de concentração: Microbiologia e Imunologia Titulação: Doutora em Biologia Buco-Dental
Banca examinadora:
Renata de Oliveira Mattos Graner [Orientador] Maria Regina Lorenzetti Simionato
Ernani Porto
Marcelo Fabiano Gomes Boriollo Pedro Luiz Rosalen
Data de defesa: 23-05-2014
Programa de Pós-Graduação: Biologia Buco-Dental
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vii RESUMO
Streptococcus sanguinis é colonizador comensal da superfícies dos dentes e
patógeno comum de endocardite bacteriana em seres humanos. A colonização da cavidade oral por S. sanguinis depende, em parte, de interações de superfície bacteriana com componentes adsorvidos na superfície dos dentes (que são principalmente de origem salivar) chamado película adquirida (PA). Além disso, os produtos do metabolismo aeróbio de S. sanguinis, por exemplo, peróxido de hidrogênio, inibe o crescimento de espécies de estreptococos concorrentes e promove a liberação de DNA genômico, um componente da matriz extracelular do biofilme dental. S. sanguinis se adapta fisiologicamente a saliva durante suas fases de colonização na cavidade oral, que provavelmente envolve alterações dinâmicas em seu transcriptoma. Transcriptomas bacterianos são regulados pelos sistemas de dois componentes (SDC), que consistem de uma membrana sensora de histidina quinase (HK) e um regulador de resposta intracelular cognato (RR). A HK sofre autofosforilação sob estímulos específicos e fosforila RR cognato, que por sua vez se liga às regiões reguladoras de genes alvo, induzindo ou reprimindo a transcrição. S. sanguinis SK36 tem um ortólogo de SDC SptRS designado (de Saliva persistência) envolvidos na sobrevivência e persistência na saliva humana em S. pyogenes. O objetivo deste estudo foi investigar o papel do SDC SptRS na biologia de S. sanguinis. Para isso, mutantes knockout de sptR (SKsptR-) e sptS (SKsptS-) foram obtidos a partir da cepa SK36. Mutantes sptRS foram analisados quanto ao crescimento planctônico e biofilme em meio suplementado ou não com saliva humana. Liberação de DNA, produção de peróxido de hidrogênio, autólise e sensibilidade ao stresse oxidativo também foram analisados nestas cepas. Alterações da transcrição dos genes associados a fenótipos observados foram avaliadas por meio de RT - qPCR. Sob aerobiose, mutantes sptRS formaram cadeias muito longas e agregados de cocos. O crescimento mais lento em comparação com SK36 também foi observado. Por outro lado, um aumento significativo (cerca de 2 vezes ) em biomassa do biofilme foram encontrados em mutantes em comparação com SK36 na presença de saliva. Consistentemente, mutantes liberaram 2 a 5 vezes mais DNA ao meio e produziram 2 a 3 vezes mais de H2O2
viii
em comparação com a cepa selvagem. Não foram observadas alterações em autólise induzida por alta temperatura. Os mutantes mostraram um aumento da tolerância ao stresse oxidativo, mas reduções de 1 a 2 logs na contagem de células (ufc / ml ) durante a incubação em saliva. A análise de RT- qPCR revelou que SptRS regula negativamente os genes que codificam as hidrolases mureína (SSA_0094 e cwdP); aumentos de 2,14 e 14,7 vezes nestes genes foram respectivamente observados em mutantes SKsptR-. Além disso, nos mutantes sptRS foram observados aumentos de 15,5 a 27,9 vezes em transcritos do gene
spxB, que codifica a oxidase piruvato necessária para a produção de H2O2. Outros genes associados com a produção H2O2 também foram afetados nos mutantes [ackA (aumento de 5,3-9,7 vezes); tpK (aumento de 12,19 vezes)]. Este estudo fornece evidências de que SptRS regula as funções de S. sanguinis de estabelecimento em biofilmes associados à produção de H2O2 e liberação de DNA, e participa da sobrevivência das bactérias na saliva humana.
Palavras-chave: Saliva, Streptococcus sanguinis, sistema de dois componentes, genética de microrganismos, Regulação da Expressão Gênica bacteriana.
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ABSTRACT
Streptococcus sanguinis is commensal colonizer of tooth surfaces and common
pathogen of bacterial endocarditis in humans. The colonization of the oral cavity by S.
sanguinis depends in part, on bacterial surface interactions with components
adsorbed to tooth surfaces (which are primarily of salivary origin) called acquired pellicle (AP). In addition, products of S. sanguinis aerobic metabolism, e.g. hydrogen peroxide, inhibits the growth of competitor streptococcal species and promotes the release of genomic DNA, a component of the extracellular matrix of dental biofilms. S.
sanguinis physiological adaptation to saliva during the stages of colonization of the
oral cavity, likely involves dynamic changes in its transcriptome. Bacterial transcriptomes are regulated by two-component systems (TCS), which consist of a membrane sensor histidine kinase (HK) and a cognate intracellular response regulator (RR). The HK undergoes autophosphorylation under specific stimuli and phosphorylates the cognate RR, which in turn binds to regulatory regions of target genes, inducing or repressing transcription. S. sanguinis SK36 strain has an
orthologue of the TCS designated SptRS (of Saliva persistence) involved in survival and persistence in human saliva in S. pyogenes. The aim of this study was to investigate the role of SptRS TCS in S. sanguinis biology. To that purpose, knockout mutants of sptR (SKsptR-), and sptS (SKsptS-) genes were obtained in strain SK36.
SptRS mutants were analyzed regarding to planktonic and biofilm growth in medium
supplemented or not with human saliva. DNA release, production of hydrogen peroxide, autolysis and sensitivity to oxidative stress were also analyzed in these strains. Transcriptional changes in genes associated with observed phenotypes were then assessed by RT-qPCR. Under aerobiosis, sptS/R mutants formed extremely long chains and aggregates of cocci. Slower growth compared to SK36 was also observed. On the other hand, significant increases (about 2-fold) in biofilm biomass were found in mutants compared to SK36 in the presence of saliva. Consistently, mutants released 2 to 5-fold more DNA to medium and produced 2 to 3-fold more H2O2 compared to parent strain. No changes were observed in autolysis induced by high temperature. Mutants showed increased tolerance to oxidative stress, but reductions of 1 to 2 logs in cell counts (cfu/ml) during incubation in saliva. RT- qPCR analysis revealed that SptRS negatively regulates genes encoding murein hydrolases
x
(SSA_0094 and cwdP); increases of 2.14 and 14.7-folds in these genes were respectively observed in SKsptR mutants. In addition, 15.5 to 27.9-fold increases in
sptR/S mutants were observed in spxB transcripts, which encode pyruvate oxidase
required for H2O2 production. Other genes associated with H2O2 production were also affected in mutants [ackA (5.3 to 9.7-fold increases; tpK (12.19-fold increase)]. This study provides evidence that SptRS regulates functions for S. sanguinis establishment in biofilms associated with H2O2 production and DNA release, and participates in bacterial survival in human saliva.
Keywords: Saliva, Streptococcus sanguinis, two component system, genetics of
xi SUMÁRIO 1 2 DEDICATÓRIA...xiii 3 4 AGRADECIMENTOS...xv 5 6 EPÍGRAFE...xix 7 8 LISTA DE FIGURAS...xxi 9 10 LISTA DE TABELAS...xxiii 11 12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...xxv
13 14 1 INTRODUÇÃO...1 15 16 2 REVISÃO DE LITERATURA...5 17 18 3 PROPOSIÇÃO...21 19 20 4 MATERIAL E MÉTODOS...23 21 22 5 RESULTADOS...51 23 24 6 DISCUSSÃO...67 25 26 7 CONCLUSÃO...77 27 28 REFERÊNCIAS...79 29 30 ANEXOS...97 31
xiii DEDICATÓRIA
Com carinho dedico,
“ Aos meus Pais Cida e Caim, pelo amor sem medidas e a minha orientadora Renata de Oliveira Mattos-Graner, pelo auxílio em todos os níveis como ser humano, pessoal, acadêmico e profissional, pelo incentivo, por ter me transformado em uma pessoa melhor ”
xv
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida e fé, por me colocar sempre nos lugares certos, pois entre os desiguais e na adversidade nos tornamos seres humanos melhores.
Aos meus pais pelo exemplo de vida, auxílio e carinho, por me acalantarem nos momentos difíceis, por me ensinarem valores como a humildade, respeito e amor ao próximo. À minha família pela ausência constante em diversos momentos, agradeço pela compreensão, e sem saber serem estímulo para mais uma conquista.
À minha vó Helena querida apenas presente de alma em minha vida, meu exemplo de superação, garra e dedicação.
Ao meu orientador de mestrado Prof. Dr. Ernani Porto, que além de professor e pesquisador, é acima de tudo educador. Agradeço pelos ensinamentos e humildade no transcender dos conhecimentos e por fazer parte de minhas conquistas, pois foi a partir do mestrado que consegui meus melhores progressos.
À minha orientadora Prof.a Dr.a Renata de Oliveira Mattos - Graner pela oportunidade, incentivo, dedicação como pesquisadora e por ter me transformado em todos os níveis acadêmico, pessoal e profissional.
Ao primeiro chefe de trabalho Dr. Vagner Castro (Hemocentro - Campinas), pela oportunidade, ensinamentos, companheirismo e credibilidade.
À amiga Giovana Virgínia Barancelli pelo companheirismo, amizade despreendida em tantos momentos difíceis e prazerosos que passamos pelo Mestrado e Doutorado.
xvi
Aos professores da área de Microbiologia, Prof. Dr. José Francisco Hofling pelo exemplo de educador, nosso “Pai” na Microbiologia, obrigada por me confortar sempre, receber seu abraço foi e é um conforto, Prof. Dr. Rafael Nóbrega Stipp pelas colaborações no trabalho e Prof. Marcelo Fabiano Gomes Boriollo pela atenção e colaboração em diversos momentos.
Aos pesquisadores: Adriano Luís Martins, Maria Paula Rando Meirelles, Eliene Aparecida Orsini Narvaes, Prof.a Lívia Maria Andaló Tenuta, Flávia Sammartino Mariano Rodrigues, Erika Hart Chú, pela atenção e colaboração para que esse trabalho alcansasse os objetivos trilhados.
As amigas e parceiras na Microbiologia, Lívia Araújo Alves, nos apoiamos em uma ajuda mútua em tantos momentos e Natália Leal Vizoto pela amizade, prestatividade e carinho, por me ensinar muitas vezes noções tão básicas.
Ao amigo Irlan Almeida pela ajuda em diversas situações acadêmicas e pessoais, por muitas vezes me ouvir, pela fé, por ser amigo, pois uma palavra amiga é capaz de transformar nosso mundo, pensamentos e nos faz ver a vida de outra forma.
As ingressantes neste momento, Thaís Harder, Thaís de Carli e Giovana Boni, muita força e luz no caminho de vocês.
Aos amigos Ítalo Sarto Carvalho Rodrigues, Manoel Francisco Rodrigues Neto e Felipe Jóia pela ajuda em diversas situações acadêmicas e pessoais.
À Vanessa Trevizan Carriel, José Monteiro Carriel e família pelo amor, por me acolherem como família em diversas situações difíceis e prazerosas durante o Doutorado.
xvii
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelos recursos concedidos para a realização desse trabalho, sob número 12/51832-3 (Auxílio Regular à Pesquisa).
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelos recursos concedidos no Programa de Doutorado (Bolsa de estudos).
xix “...Somos quem podemos ser
Sonhos que podemos ter....”
“Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende”
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: TCS típico bacteriano...9
Figura 2: Contexto e localização genômica dos genes SSA_1793 (sptS) e SSA_ 1794 (sptR) de S. sanguinis SK36 e os genes Spy_ 0874 (sptR) e Spy_ 0875 (sptS) de S. pyogenes M1...14
Figura 3: Sequência de SptR (Spy_0874) identificada no genoma de Streptococcus pyogenes comparada
com a sequência proteica de SptR (SSA_1794) em S. sanguinis...15
Figura 4: Sequência de SptS (Spy_0875) identificada no genoma de Streptococcus pyogenes comparada
com a sequência proteica de SptS (SSA_1793) em S. sanguinis...16
Figura 5: Estratégia de inativação gênica utilizando-se a técnica de mutagênese por PCR e
ligação...29
Figura 6: Gel de agarose (1,5%) contendo 10µl de produtos de PCR utilizados para a construção dos
mutantes SKsptS- e SKsptR-...30
Figura 7: Gel de agarose (1,5%) contendo 10µl de produtos de PCR utilizados na construção do mutante
duplo SKsptRS-...32
Figura 8: Análise de RT-PCR dos transcritos contendo as sequências SptRS...33
Figura 9: Análise por Microscopia Confocal com Varredura a Laser TCS SP5 das cepas S. sanguinis
(A550nm= 0,7) com objetiva HC x PL APO Lambda blue 63,0 x 1.40 OIL UV (Leica
Systems)...51
Figura 10: Análise por Microscopia de campo claro das cepas S. sanguinis (A550nm= 0,7) com objetiva de
100x (óleo de imersão)...52
Figura 11: Curvas de crescimento das cepas S. sanguinis em diferentes meios e condições atmosféricas
testadas...53
Figura 12: Curvas de crescimento das cepas S. sanguinis complementadas em diferentes meios e
condições atmosféricas testadas...54
Figura 13: Biofilmes de 18 h das cepas de S. sanguinis em diferentes meios e condições atmosféricas
testadas...56
xxii
Figura 15: Produção de peróxido de hidrogênio e liberação de DNA extracelular sob aerobiose...59
Figura 16: Análise da sensibilidade ao estresse oxidativo...60
Figura 17: Autólise das cepas estudadas cultivadas sob aerobiose por agitação (A) ou em atmosfera com
10% CO2 (B)...61
Figura 18: Ensaio ex vivo da viabilidade de cepas de S. sanguinis em amostras de saliva coletadas de
diferentes voluntários...63
Figura 19: RNAs extraídos e tratados com DNAse Turbo (Ambion, EUA)...64
Figura 20: Análises das razões dos níveis de transcritos de diversos genes nas cepas mutantes em relação
xxiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Similaridade entre o sistema SptRS de S. pyogenes M1 e respectivo ortólogo identificado em S. sanguinis SK36 através de análise de BLAST...14
Tabela 2: Similaridade encontrada através da análise de BLAST entre os prováveis genes de virulência de S. pyogenes MGAS5005 M1 e ortólogos encontrados em S. sanguinis SK 36...18
Tabela 3: Similaridade encontrada através de análise de BLAST entre os prováveis genes de metabolização
de carboidratos complexos de S. pyogenes MGAS5005 M1 e ortólogos encontrados em S. sanguinis SK 36...19
Tabela 4: Oligonucleotídeos utilizados na estratégia de inativação dos genes sptR, sptR, sptRS e para a
complementação dos mutantes...27
Tabela 5: Primers utilizados nas reações de qPCR possivelmente envolvidos na virulência, metabolismo
de carboidratos complexos, produção de peróxido de hidrogênio e síntese de parede celular de Streptococccus sanguinis...47
xxv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ºC: grau Celsius. µg: micrograma. µl: microlitro.
10% CO2: pressão parcial de dióxido de carbono a 10%.
16RNAr: gene codificador do RNA ribossômico 16S.
A260nm: absorbância no comprimento de onda de 260 nanômetros.
A280nm: absorbância no comprimento de onda de 280 nanômetros.
A550nm: absorbância no comprimento de onda de 550 nanômetros.
A600nm: absorbância no comprimento de onda de 600 nanômetros.
ATCC: Coleção Americana de tipos de cultura (de American Type Culture Collection).
BHA: BHI comercial acrescido de ágar a 1,6% (peso/ volume).
BHI: infusão de cérebro e coração comercial (de Brain Heart Infusion).
BHIerm: BHI comercial acrescido de ágar a 1,6% (peso/ volume) e/ou caldo BHI
adicionado de 10 µg/ml de eritromicina.
BHIerm/espect: BHI comercial acrescido de ágar a 1,6% (peso/ volume) e ou
caldo BHI adicionado de 10 µg/ml de eritromicina e 200 µg/ml de espectinomicina.
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool.
cDNA: fragmentos de DNA de fita simples obtidos a partir da transcrição reversa
de moldes de DNA.
CMD: Meio quimicamente definido.
CWA: proteínas ancoradas à parede celular (cell- wall anchored proteins). DEPC: reagente Diethylpyrocarbonate.
DNA: ácido desoxirribonucleico genômico (de Deoxyribonucleic Acid). dNTP: Trifosfatos de desoxirribonucleotídeos.
DTT: reagente ditiotreitol.
eDNA: DNA genômico do meio extracelular. EDTA: reagente Ethylenediaminetetraacetic acid.
xxvi
ermR: fenótipo resistente a eritromicina. espect: fenótipo resistente a espectinomicina et al.: e outros (de et ali).
Fase log: fase logarítmica de crescimento.
ftf: gene frutosiltransferase.
g: gramas.
GAS: Streptococcus do grupo A de Lancefield.
gbpB: gene codificador da proteína ligante de glucano B.
GbpB: proteína ligadora de glucano. gDNA:DNA cromossomial, genômico.
gtfs:genes glicosiltransferases.
Gtfs: protéinas glicosiltransferases h: horas.
H2O2: peróxido de hidrogênio.
HF: high fidelity.
HK: histidina quinase senora. IgA: Imunoglobulina A.
l: litro.
LB: meio de cultura Luria – Bertani. M: molar.
min: minuto. mg: miligrama. ml: mililitro. mM: milimolar.
MSA: agar Mitis Salivarius.
MSE: agar Mitis Salivarius acrescido de 10µg/ml de eritromicina. MOPS: reagente Morpholinopropane sulphonic acid.
n: número.
NaCl: cloreto de sódio.
ORF: fases abertas de leitura (de Open Reading Frame). PA: película adquirida.
xxvii
PCR: reação em cadeia de polimerase (de Polymerase Chain Reaction). pDNA: DNA plasmidial.
pH: potencial hidrogênico.
qPCR: PCR em tempo real quantitativa. RT: reação da transcrição reversa.
qRT- PCR: transcrição reversa seguida de PCR quantitativa.
rcf: unidade de força centrífuga relativa (de Relative Centrifugal Force). RNA: ácido ribonucleico (de Ribonucleic Acid).
RNAm: ácido ribonucleico mensageiro. rpm: rotações por minuto.
RPMI: meio RPMI Medium 1640 (GIBCO – Invitrogen Corporation). RR: regulador de resposta.
RT: transcrição reversa que dará origem a cDNA (de Reverse Transcription). SP1/SP2: primers de amplificação do gene de resistência a espectinomicina. SDC: sistema regulador de transcrição de dois componentes.
s: segundo.
TA: temperatura ambiente.
TCS: sistemas reguladores de transcrição de dois componentes (de Two Component System).
TE: tampão 10mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0. U: unidade (s).
ufc: unidades formadoras de colônias. UV: radiação ultravioleta.
1 1 INTRODUÇÃO
Streptococcus sanguinis é o colonizador primário da cavidade oral em seres
humanos e é a principal espécie envolvida na formação do biofilme dental (Zhu et
al., 2011). S. sanguinis é um patógeno comum de endocardites bacterianas,
decorrentes de bacteremias de origem bucal (Ge et al., 2008). A colonização da cavidade oral por S. sanguinis é dependente da interação com proteínas adsorvidas às superfícies dentárias, as quais são principalmente de origem salivar e forma um filme denominado película adquirida do esmalte (PA). A alta afinidade de S. sanguinis a componentes da PA os tornam colonizadores primários dos dentes, sendo importantes para os processos de colonização e formação de biofilmes. As razões pela alta capacidade de colonização inicial dos dentes por S.
sanguinis ainda não é totalmente compreendida, mas parece ser decorrente de
um conjunto de fatores microbianos que tornam estes microrganismos altamente competitivos frente ao grande número de espécies de estreptococos e de outros gêneros bacterianos presentes na cavidade bucal. Estes incluem adesinas com alta afinidade a componentes salivares e produção de proteases que clivam anticorpos IgA (IgA1-proteases), principal componente da imunidade adaptativa específica da saliva e adaptação ao estresse oxidativo. A espécie S. sanguinis, apresenta um conjunto de fatores de virulência que a torna capaz de se aderir às superfícies dentárias e se acumular no biofilme dentário. Dentre estes fatores além das adesinas incluem-se proteínas de parede celular; proteínas envolvidas na síntese de matriz extracelular; proteínas ligadora de glucano (componente importante da matriz extracelular de biofilmes) e fatores de resposta ao estresse presente nos biofilmes dentários (estresse ácido, osmótico e oxidativo) (Nobbs et
al., 2009). Diversos destes fatores podem ainda participar da patogenia da
endocardite bacteriana (Zhu et al., 2011). S. sanguinis é a espécie de estreptococos que contém o número mais extenso de genes que codificam adesinas ou proteínas de superfície (Xu et al., 2007). Estas adesinas são proteínas que reconhecem receptores específicos, de preferência açúcares ou
2
oligossacarídeos. Portanto é provável que S. sanguinis apresentem mecanismos regulatórios importantes para adaptação fisiológica e crescimento em saliva. A transmissão de S. sanguinis entre pessoas também é depende de sua sobrevivência e proliferação na saliva durante suas fases de colonização. Para isto, é importante que S. sanguinis se adapte fisiologicamente à saliva, o que implica em diversas alterações do seu transcriptoma. Em bactérias, as adaptações do transcriptoma em resposta a estímulos ambientais são controlados por sistemas reguladores de transcrição gênica presentes nas bactérias denominados sistemas de dois componentes (SDC). A cepa S. sanguinis SK36, isolada de biofilme dental humano possui 14 SDC, semelhante ao que se encontra em outras espécies de Streptococcus sp (Xu et al., 2007). Os componentes de um SDC típico incluem um receptor de membrana histidina-quinase (HK) e uma proteína reguladora intracelular denominada regulador de resposta (RR). Quando a porção da superfície externa do receptor HK recebe o estímulo, esta é ativada e se autofosforila. O grupo fosfato é em seguida transferido para o RR cognato, o qual muda de conformação para se ligar às sequências reguladoras do gene alvo, podendo reprimir (regulação negativa) ou induzir (regulação positiva) a transcrição dos seus genes alvo (Nobbs et al., 2009).
Muitos genes identificados no genoma de S. sanguinis codificam homólogos de adesinas identificadas em espécies de estreptococos patogênicos; a maioria ainda não caracterizada. Um total de 33 proteínas ancoradas à parede celular (CWA, de cell-wall anchored proteins), hipotéticas ou conhecidas, foram identificadas no genoma de S. sanguinis, número muito superior ao detectado em outras espécies relacionadas, como S. mutans (3 CWAs) e S. pneumoniae R6 (13 CWAs). Algumas das CWA de S. sanguinis parecem compartilhar funções, como por exemplo, a ligação ao colágeno (Xu et al., 2007). Sugere-se que o grande número de proteínas de superfície explique a alta capacidade de adesão de S.
sanguinis à PA e a outras espécies e gêneros bacterianos do biofilme dentário,
assim como a sua capacidade de aderir-se aos componentes do hospedeiro em lesões de válvulas cardíacas.
3
Entre as diversas proteínas de virulência envolvidas na formação de biofilmes, as glicosiltransferases (Gtf) são as mais estudadas em espécies orais patogênicas como Streptococcus mutans (Banas & Vickerman, 2003). A produção de polissacarídeos extracelulares por estreptococos desempenha papel crucial no desenvolvimento de biofilmes, sendo que a interação das superfícies bacterianas a estes polímeros são mediadas por proteínas de superfície denominadas Proteínas Ligadoras de Glucano (GBPs, de Glucan-binding protein) (Banas & Vickerman, 2003). S. sanguinis, assim como S. mutans é capaz de sintetizar glucanos a partir da expressão de GTFs (glicosiltransferases), cujo substrato é a sacarose. No caso na formação do biofilme em endocardite, são os exopolissacarídeos associados à superfície de S. sanguinis e S. mutans que parecem atuar como adesinas ligando-se a válvulas cardíacas lesionadas. No genoma de S. sanguinis SK36 foi identificado pelo menos um gene que codifica Gtf, sendo a gtfP, que é capaz de sintetizar glucanos (Xu et al., 2007).
O desenvolvimento de biofilmes dentais envolve grande competição por espécies bacterianas do gênero Streptococcus, e diferentes mecanismos são utilizados por cada microrganismo para competir com colonizadores iniciais, como
S. sanguinis (Kreth et al., 2009a). Um dos principais mecanismos de competição
entre S. sanguinis e outras espécies patogênicas competidoras dos biofilmes dentários, é a produção de peróxido de hidrogênio (Zheng et al., 2011). O peróxido de hidrogênio produzido pelos comensais S. sanguinis e S. gordonii durante o crescimento aeróbio inibe S. mutans (Kreth et al., 2008). A enzima responsável pela produção de H2O2 foi identificada como piruvato oxidase (Spx). Mutantes spx isogênicos de S. sanguinis e S. gordonii não foram capazes de inibir o crescimento de S. mutans em um ensaio de competição in vitro (Kreth et al., 2008) evidenciando que esta enzima é fator crucial para a produção de H2O2 e competição com outras espécies. Além disso, a associação entre S. sanguinis e outras espécies cariogênicas demonstrou em estudos clínicos, que a colonização por S. sanguinis oferece efeito protetor, resultando na menor incidência de cárie (Caufield et al., 2000; Stingu et al., 2008).
4
A caracterização de sistemas de dois componentes no gênero
Streptococcus bem como em outros gêneros bacterianos é de grande interesse,
pois o estudo permite a compreensão de mecanismos adaptativos das bactérias, bem como das alterações que sofrem em seu transcriptoma e de que maneira isso interfere em sua expressão gênica e fenotípica. Esses sistemas podem alterar e controlar a transcrição de genes que codificam diversas proteínas importantes como adesinas, proteínas de parede celular; proteínas envolvidas na síntese de matriz extracelular; proteínas ligadoras de glucano (componente importante da matriz extracelular de biofilmes) e fatores de resposta ao estresse presente nos biofilmes dentários (estresse ácido, osmótico e oxidativo). As bactérias usam como mecanismo regulatório sistemas de dois componentes para controlar a expressão de genes em resposta a condições ambientais durante a infecção no hospedeiro. Dessa forma, os microrganismos se adaptam ao microambiente e se estabelecem com maior eficiência no hospedeiro, proliferando e causando doença. Na espécie Streptococcus pyogenes M1 GAS5005, o sistema SptRS (Spy_
0874/Spy_0875) foi descrito e caracterizado por Shelburne et al., (2005), onde a
inativação do sistema SptRS promoveu clara redução na capacidade de GAS em sobreviver na saliva humana e alterou a expressão de diversos genes de virulência implicados na evasão a fatores de defesa do hospedeiro e também genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo e ácido e no metabolismo de carboidratos.
Dessa forma, o estudo desse sistema SptRS é de extrema relevância em outras espécies de Streptococcus, ressaltando a espécie S. sanguinis que pode apresentar mecanismos regulatórios de adaptação e sobrevivência em saliva humana.
5 2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Streptococccus sanguinis como microrganismo pioneiro do biofilme dental e sua associação com a endocardite bacteriana.
Os estreptococos abrangem um grupo importante de patógenos humanos. Muitas espécies de Streptococcus são responsáveis por doenças infecciosas, tais como pneumonia, bacteremia, infecções na garganta, febre reumática, escarlatina, meningite, endocardite infecciosa, e cárie dentária. S. sanguinis tem sido reconhecido como o principal agente causador da formação de biofilmes dentais e endocardite infecciosa, e sua virulência têm sido objetivo de diversos estudos (Di Filippo et al., 2006; Paik et al., 2005; Ge et al., 2008). A espécie Streptococcus
sanguinis é o colonizador primário dos dentes, se estabelecendo na cavidade
bucal logo após o início da erupção dos dentes, sendo um habitante normal (comensal) na cavidade oral humana (Caufield et al., 2000). Esta espécie, é classicamente reconhecida como benéfica, pois inibe o estabelecimento de patógenos oportunistas como Streptococcus mutans, patógeno da cárie dentária (Kuramitsu et al., 2007; Lee et al., 2011). S. sanguinis, previamente conhecido como S. sanguis pertence a um dos cincos grupos de estreptococos viridans alfa- hemolíticos (grupo mutans, anginosus, mitis, salivarius e sanguinis). Esse grupo de estreptococos é caracterizado por uma hemólise parcial, associada com a perda parcial de hemoglobina pelas hemácias, ocorrendo uma zona cinza-esverdeada no meio de cultura ao redor da colônia quando cultivados em meio ágar- sangue (Ge et al., 2008).
Os estreptococcos são conhecidos por serem importantes para o biofilme dental e por se ligarem especificamente as proteínas adsorvidas ao dente, formando um filme chamado película adquirida (PA). A PA é composta de componentes salivares e bacterianos, alfa - amilases e proteínas ricas em prolina e glicoproteínas, fornecendo condições de alta capacidade de adesão para os estreptococos. S. sanguinis possui uma alta afinidade a PA, fornecendo moléculas
6
de adesão e permitindo a colonização subsequente por outros estreptococos ou bactérias orais com menor afinidade a PA, dessa forma seguindo - se uma sucessão ordenada dos inúmeros gêneros bacterianos que estão presentes no biofilme dental (Zheng et al., 2011; Nobbs et al., 2009; Hojo et al., 2009).
As razões pela alta capacidade de adesão e colonização inicial de S.
sanguinis nos dentes ainda não é totalmente compreendida, porém pode ser
decorrente de diversos fatores microbianos como a capacidade de sobrevivência na saliva humana, pela competição frente a outras espécieis de estreptococos pela produção de substâncias que antagonizam outras espécies como o peróxido de hidrogênio (Zheng et al., 2011) e a produção de IgA- proteases que clivam as IgA salivares permitindo o escape da ação de anticorpos. S. sanguinis expressa diversas adesinas de superfície com especificidade a componentes salivares (alfa amilases e proteínas ricas em prolina) e microbianos da PA. O estabelecimento de
S. sanguinis no biofilme dental bem como outros estreptococos envolve a síntese
de uma matriz extracelular de glucanos, através da expressão de proteínas chamadas glicosiltransferases (Gtfs). Além disso, são capazes de interagir com glucanos insolúveis produzidos por outras espécieis como S. mutans (Hamada et
al., 1981) e liberar DNA genômico para o meio extracelular.
Os biofilmes dentais são constituídos de comunidades microbianas organizadas em uma matriz extracelular constituída de polímeros de origem bacteriana ou salivar que se formam sobre superfíceis vivas ou inanimadas (Ge et
al., 2008). O biofilme dental pode causar doenças bucais como a cárie e também
bacteremias de origem bucal (Filoche et al., 2010). A formação do biofilme dental bacteriano envolve 5 etapas: 1) primeiramente o microrganismo precisa se aderir a superfície inerte ou viva; 2) após a adesão, ocorre a colonização e proliferação microbiana, mediado pela produção de uma matriz extracelular; 3) ocorre uma fase de maturação inicial; 4) maturação onde as células passam a apresentar uma fisiologia de alta resistência (possivelmente devido a expressão de diversos genes para tal fim) a diferentes tipos de estresses ambientais; 5) fase na qual algumas comunidades de destacam e são liberadas para os fluídos que banham o biofilme
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formado. Os mecanismos regulatórios moleculares envolvidos em cada uma dessas fases são complexos e parecem ser controlados em resposta a estímulos ambientais e bacterianos pelos SDC.
Diversos fatores de virulência como adesinas, enzimas que sintetizam matriz extracelular de glucanos, proteínas de ligação de glucanos, e genes envolvidos na liberação de DNA genômico para o meio extracelular estão envolvidos na formação de biofilmes e têm sido identificados em S. sanguinis. Genes envolvidos na competência e capacidade de crescimento em biofilmes:
comC, comD, comE (Hung et al., 2011); na manutenção e estrutura do envelope
celular e/ou no crescimento em fase planctônica e em biofilmes: comE, sspC,
sspD, gtfR, ssapcsB, SSA_0094, SSA_1543, cwdP, gtfP (Hung et al., 2011; Xu et al., 2007; Ng et al., 2005; Duque et al., 2011; Stipp, 2010; Ng et al., 2004; Moraes
2011); genes de resistência ao estresse oxidativo e produção de peróxido de hidrogênio: spxB, ackA tpK, sodA e spxR (Chen et al., 2011; Ahn & Burne, 2007); e gene de controle catabólico: ccpA (Zheng et al., 2011). Esses genes são regulados de forma coordenada por sistemas reguladores de transcrição de dois componentes (SDC), em resposta a diferentes estímulos ambientais. Entre esses sistemas destaca-se o VicRK (vic de Virulence control), o qual é conservado em diversas espécieis patogênicas de estreptococos como S. pneumoniae, S.
pyogenes e S. mutans (Senadheera et al., 2005; Liu et al., 2009; Winkler & Hoch,
2008), e foi descrito recente por Moraes (2011) na espécie S. sanguinis onde a inativação do gene vicK inibiu claramente a formação inicial de biofilmes, demonstrou maior sensibilidade ao estresse oxidativo, maior hidrofobicidade celular e alterou de forma inibitória a transcrição de genes como pscB, SSA_0094
spxB e comE, indicando que o sistema VicRK regula diversas funções biológicas
em S. sanguinis.
Apesar da benéfica associação a microbiota dentária e antagonista de outras espécies como S. mutans, S. sanguinis consiste em uma das espécies de estreptococos viridans mais associada a bacteremias e endocardite bacteriana (Douglas et al., 1993; Ge et al., 2008; Tart & Rijin, 1991).
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A endocardite bacteriana é uma infecção nas válvulas cardíacas ou do endocárdio e pode ser proveniente de procedimentos dentários invasivos, sendo portanto necessária a profilaxia antibiótica antes de tais procedimentos para pacientes de risco (Moreillon & Que, 2004). A infecção primária de uma lesão de válvula cardíaca envolve mecanismos complexos na formação de um biofilme denominado de “vegetação”, no qual as bactérias de ligam a uma rede de fibrina, plaquetas e outros componentes do hospedeiro afetado, multiplicam-se e se acumulam através da produção de matriz extracelular. Esse acúmulo de biofilme promove alteração na função valvular e funciona como uma constante liberação de microrganismos na corrente sanguínea, mesmo com o tratamento com antibióticos, podendo provocar embolia e afetar outros orgãos como rins, cérebro e extremidades. A endocardite bacteriana está associada com bacteremias de origem bucal, (Ge et al., 2008) e os mecanismos de formação de biofilmes e patogenia das endocardites bacterianas precisa ser melhor estudado e compreendido.
2.2 Função de Sistemas de Dois Componentes (SDC) na Biologia de espécies patogênicas do gênero Streptococcus sp e outros gêneros e organização estrutural em operon.
Os sistemas de dois componentes (TCS, de Two Component System) ou SDC parecem ser essenciais, a sobrevivência, virulência e adaptação bacteriana, ativando ou suprimindo a expressão de genes ou grupos de genes em resposta às modificações das condições ambientais. Um SDC típico possui dois componentes (Figura 1), uma proteína de membrana (a histidina quinase – K), que tem a função de sentir o estímulo ambiental, se ativando e autofosforilando, transferindo então o grupo fosfato para o segundo componente, a proteína reguladora de resposta (RR). O regulador de resposta fosforilado muda sua conformação e interage com sequências regulatórias de diversos genes, ativando e /ou inibindo a transcrição gênica (Stock et al., 2000). Organismos procariontes, tais como as bactérias,
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possuem a característica de sofrer com pequenas variações do meio ambiente. Sendo assim, esses organismos necessitam de um maior poder de regulação de seu metabolismo, em prol de uma melhor adaptação às variações do meio. Muito dessa regulação é feita através do controle da transcrição de genes por proteínas (fatores de transcrição) e pode ser controlada pelos sistemas reguladores da transcrição (SDC). Nas bactérias o controle pode ser feito pela indução ou ativação na transcrição desses genes e está geralmente relacionado com a forma de organização estrutural na forma de operon.
Figura 1: Um SDC típico bacteriano. Consiste de um receptor de membrana histidina quinase
sensora (geralmente designado pela letra K ou S, ex. vicK) e um regulador de resposta intracelular (geralmente designado pela letra R, ex. vicR). Em resposta a um ou mais estímulos ambientais específicos, o sensor K sofre auto-fosforilação e transfere o grupo fosfato para um resíduo aspartato do R cognato. O R fosforilado adquire uma nova conformação para se ligar às sequências regulatórias (operadoras) de genes alvos (regulon), ativando ou inibindo sua transcrição. Esse esquema básico é adaptável e variável de acordo com sistemas específicos. Adaptado de Madigan et al., 2010.
K
10
Os chamados sistemas de dois componentes (SDC) normalmente estão organizados na forma de operon (vide item 4.4.3) mas existem genes órfãos, que não estão próximos ao seu respectivo receptor ou regulador de resposta cognato. Dentre os diversos SDCs, o sistema SptRS (spt de saliva persistence) foi carcterizado na espécie Streptococcus pyogenes GAS5005 M1(Shelburne et al., 2005), como um sistema de adaptação e persistência em saliva humana, pois a inativação deste sistema prejudicou a viabilidade de S. pyogenes em saliva humana. Esse sistema SptRS têm recebido a atenção em estudos recentes sobre mecanismos de adaptação e virulência de diversos patógenenos gram - positivos, incluindo espécies do gênero Streptococcus, Bacillus, Staphylococcus,
Enterococos e Listeria, e têm sido relacionado com regulação, adaptação e
virulência. Em S. mutans UA159 o sistema SptRS composto pelos genes (Smu.928/Smu.927) que possuem 57 % e 62% de similaridade com o sistema SptRS de S. pyogenes, vêm sendo estudado pelo nosso grupo de pesquisa através de projeto de Doutorado (Vizoto N.L., em andamento) e parece regular funções associadas à biogênese da parede celular e virulência. Em Streptococcus
gallolyticus subsp. gallolyticus ATCC 43143 que pode provocar infecções em
humanos e são frequentemente associados com bacteremias, endocardite infecciosa e de cólon, o sistema SptRS é composto pelos genes
SGGB_1273/SGGB_1274 e apresenta 54% e 70% de similaridade proteica,
respectivamente, com o sistema SptRS de S. sanguinis, sendo associado a adaptação e virulência com papel na adesão aos tecidos do hospedeiro, conduzindo a infecções persistentes que causam doenças sub - aguda e crônica nos seres humanos (Lin et al., 2011). Em Streptococcus pneumoniae R6 o sistema SptRS é conhecido como CiaRH (spr_0707/spr_0708) com 37% e 28% de similaridade proteica, respectivamente, e está envolvido em vários processos, tais como o desenvolvimento de competência, autólise, produção de bacteriocinas, colonização do hospedeiro e virulência (Halfmann et al., 2011). Em Listeria
monocytogenes N53-1 o sistema SptRS (BN419_0039/ BN419_0040) com 37% e
11
patógeno em diferentes indústrias processadoras de peixe, demonstrando que o sistema pode estar relacionado com a virulência, adaptação e regulação da expressão gênica do patógeno (Holch et al., 2013).
Em Enterococcus faecium DO o sistema SptRS está descrito como CiaRH (HMPREF0351_11399/HMPREF0351_11400) com 58% e 31% de similaridade proteica, repectivamente, com o sistema SptRS de S. sanguinis, e está associado à virulência, adaptação e persistência de cepas hospitalares (Qin et al., 2012).
2.3 Função do Sistema de Dois Componentes SptRS de Streptococccus
pyogenes MGAS5005 M1.
Streptococcus pyogenes consiste na espécie do gênero Streptococcus
pertencente ao grupo A de Lancefield (GAS, de Group A Streptococci). GAS são habitantes comuns da orofaringe humana e podem causar uma série de doenças como faringite bacteriana, impetigo, celulite, septicemia, e síndrome do choque tóxico. Em decorrência de infecções locais por GAS, podem ocorrer complicações como febre reumática e glomerulonefrite. Cepas de GAS podem persistir na orofaringe humana e saliva por longos períodos, mesmo após tratamento com antibióticos (Ferretti et al., 2001). A transmissão de GAS envolve ainda sobrevivência e proliferação destes microrganismos na saliva (Hamburguer, 1944). O genoma de S. pyogenes MGAS5005 M1 é composto por um cromossomo circular de 1.852.441 bp e apresenta menor proporção de CG (38,55%) em relação a outras espécies de Streptococcus e a de S. sanguinis, cuja proporção de CG do genoma é 43,4%. O genoma da cepa de GAS M1 possui aproximadamente 1.752 genes que codificam proteínas, 60 genes codificadores de tRNA, 18 genes para rRNA e 45 pseudogenes (NCBI, NC_002737).
Em um trabalho realizado por Shelburne et al., (2005) foi identificado em S.
pyogenes M1, um SDC designado SptRS (Spt de Saliva persistence), o qual
parece estar envolvido na viabilidade e crescimento de GAS em saliva humana. O genoma da cepa Streptoccocus pyogenes M1 MGAS5005 utilizado no estudo
12
possui 13 SDC (sistemas de dois componentes) altamente conservados entre outras cepas de GAS (Sumby et al., 2005). No estudo citado a inativação do sistema SptRS (Spy_ 0874/Spy_0875) respectivamente, promoveu clara redução na capacidade de GAS em sobreviver na saliva humana e alterou a expressão de diversos genes de virulência implicados na evasão a fatores de defesa do hospedeiro e também genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo e ácido e no metabolismo de carboidratos. Estes dados sugerem que SptRS possa modular a sobrevivência de adaptação fisiológica de S. pyogenes em saliva.
O sistema SptRS na espécie S. pyogenes GAS5005 M1 é um sistema de dois componentes formado pelos genes Spy_0874 que é uma proteína reguladora denominada regulador de resposta (RR) e pelo gene Spy_0875 que tem função de proteína sensora chamada histidina-quinase (HK). Quando o gene Spy_0875 recebe o estímulo se torna ativado e sofre fosforilação. O grupo fosfato em seguida é transferido para o regulador de resposta (Spy_0874), que passa a ter uma mudança em sua conformação para se ligar as sequências reguladoras do gene alvo, constituindo então uma reposta negativa ou positiva que induz ou reprimi a transcrição dos genes (Nobbs et al., 2009). Dessa forma uma deleção desses genes promoveu uma mudança na expressão gênica e na expressão fenotípica de S. pyogenes conforme descrito por Shelburne et al., (2005). Através de análises de BLAST, pesquisamos a presença desses genes do sistema SptRS no genoma de S. sanguinis e identificamos duas proteínas em S. sanguinis (SSA-_1793 e SSA_1794) altamente homólogas (52 e 66% de similaridade) a proteínas diretamente reguladas por SptS/R em S. pyogenes M1 (respectivamente Spy_0874 e Spy_0875).
2.4 Identificação do sistema SptRS de S. sanguinis
A cepa S. sanguinis SK36 (NC_009009.1) utilizada neste trabalho possui seu genoma sequenciado e concluído (Xu et al., 2007; Ge et al., 2008). S.
13
(capacidade de captação de DNA exógeno) e apresenta características como adesão a componentes salivares adsorvidos à hidroxiapatita e virulência em modelos de endocardite bacteriana (Xu et al., 2007). O genoma de S. sanguinis é composto por um cromossomo circular de 2.388.435pb (7 a 25% maior do que o de diversas espécies de estreptococos, como S. mutans, S. pneumoniae e S.
pyogenes) e apresenta a maior proporção de C+G em comparação com as
mesmas espécies, sendo de 43,4%. Seu genoma parece codificar um total de 2.274 proteínas, sendo que 1.353 genes são compartilhados entre S. sanguinis, S.
mutans e S. pneumoniae. Outros 170 genes são compartilhados apenas com S. pneumoniae, enquanto que 19 são compartilhados apenas com S. mutans. S. pyogenes M1 (NC_0027371) que foi utilizado como referência no proposto
trabalho compartilha 613 genes com S. sanguinis. S. sanguinis SK36 contém pelo menos 14 SDC (sistema de dois componentes) completos, sendo que análises preliminares de mutantes dos genes sptR, sptS e sptRS destes sistemas foram realizados por Camargo, 2014.
Utilizando- se o programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) do site
National Center for Biotechnology Information (NCBI – http://www.ncbi.nlm.nhi.goc) foi possível obter as sequências das proteínas que compõem o sistema SptRS em S. sanguinis SK36 e S. pygenes M1 , e por análise comparativa dos genomas identificou - se proteínas que possuem alta similaridade no genoma de S. sanguinis SK36 em relação ao sistema SptRS de S. pyogenes M1 que já se encontra caracterizado, e descrito como um sistema importante para adaptação a saliva (Shelburne et al., 2005). O contexto genômico e índices de similaridade das sequências de aminoácidos dos genes sptRS em S. sanguinis e
14
Figura 2: Contexto e localização genômica dos genes SSA_1793 (sptS) e SSA_ 1794 (sptR) de S.
sanguinis SK36 e os genes Spy_ 0874 (sptR) e Spy_ 0875 (sptS) de S. pyogenes M1.
Tabela 1: Similaridade entre o sistema SptRS de S. pyogenes M1 e respectivo ortólogo
identificado em S. sanguinis SK36 através de análise de BLAST.
Cepa bacteriana Gene Tamanho ID do gene Proteína Similaridade
S. pyogenes M1 Spy 0875 (S) 1230pb 901033 NP_269074 52% Spy 0874 (R) 669pb 901032 NP_269073 66% S. sanguinis SK 36 SSA_1793(S) 1240 pb 4807906 YP_001035725 52% SSA_1794(R) 705 pb 4807623 YP_001035726 66%
A identidade dos genes e números de acesso foram identificados no
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nhi.gov/GenBank). A jusante do locus
SSA_1793/1794 estão genes transcritos em sentido contrário. O gene SSA_1791
(acyp) codifica acilfosfatase que catalisa a hidrólise de acilfosfato e participa de três vias metabólicas importantes: glicólise/gliconeogênese, metabolismo do piruvato e degradação do benzoato; SSA_ 1792 (yidC) codifica a proteína precursora OxaA-like envolvidos na biogênese das proteínas da membrana. O
15
gene SSA_1795 localizado a montante de sptR, codifica a enzima guanosina 3 ', 5'-bis pirofosfato-sintetase (ppGpp) que causa inibição da síntese de RNA quando ocorre falta de aminoácidos, influenciando o padrão de expressão gênica global da célula de muitos genes necessários para a sobrevivência em condições estressantes. Alvos de ppGpp incluem operons de rRNA podendo afetar a fisiologia bacteriana em diferentes aspectos: inibir o crescimento por inibir a síntese de proteínas, regulamentar número ribossômico, inibir a replicação do DNA e atuar a nível de transcrição gênica; e SSA_1796 (greA) que codifica o fator de alongamento para a transcrição gênica, sendo importante para eficiente alongamento da transcrição pela RNA polimerase (Xu et al., 2007). O alinhamento proteico das proteínas reguladora e sensora, estão demonstrados nas Figuras 3 e 4.
Figura 3: Sequência de SptR (Spy_0874) identificada no genoma de Streptococcus pyogenes comparada
com a sequência proteica de SptR (SSA_1794) em S. sanguinis. Asteriscos indicam resíduos de aminoácidos idênticos, dois pontos indicam as substituições de aminoácidos conservadas e um ponto substituições semi-conservadas. O alinhamento múltiplo foi realizado utilizando o programa CLUSTAL W (2.1).
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Figura 4: Sequência de SptS (Spy_0875) identificada no genoma de Streptococcus pyogenes comparada
com a sequência proteica de SptS (SSA_1793) em S. sanguinis. Asteriscos indicam resíduos de aminoácidos idênticos, dois pontos indicam as substituições de aminoácidos conservadas e um ponto substituições semi-conservadas. O alinhamento múltiplo foi realizado utilizando o programa CLUSTAL W (2.1).
17
Além da identificação do sistema de dois componentes SptRS em S.
sanguinis, foram pesquisados genes de interesse envolvidos em virulência e
viabilidade em saliva. Os genes descritos por Shelburne et al., (2005), em S.
pyogenes foram cruzados contra o genoma de S. sanguinis através da análise de
BLAST das sequências proteicas, e as similaridades encontradas estão descritas nas Tabelas 2 e 3. Alguns desses genes foram utilizados nas análises de qPCR, bem como outros genes relacionados à formação de biofilmes, crescimento planctônico e biogênese de parede celular (ssapcsB, SSA_0094, gtfP e cwdP), à resposta ao estresse oxidativo e produção de peróxido de hidrogênio (ccpA, spxB,
ackA e tpK). Os genes mecA, prtS, ssaB, e gldA também foram utilizados nas
análises. O gene mecA é uma proteína adaptatória implicada na sinalização celular, que possivelmente codifica um fator de virulência em espécies de estreptococos (Shelburne et al., 2005). Em S. sanguinis ainda não há dados sobre
mecA, porém codifica também uma proteína adaptatória com função na
sinalização celular; prtS é um gene que codifica uma serina protease que catalisa a quebra de ligações peptídicas em proteínas, participando do metabolismo proteico e possivelmente envolvida na integridade do envelope celular (Xu et al., 2007); ssaB codifica proteínas transmembranares utilizadas no transporte de Manganês e Zinco (Sistema de transporte ABC Mn/Zn), importantes para a viabilidade celular, virulência de S. sanguinis em modelos de endocardite infecciosa e patogenicidade (Makhlynets et al., 2013), além disso está envolvido na aderência a matriz extracelular de biofilmes, contribuindo para a formação e acúmulo da placa dental (Xu et al., 2007); e o gene gldA codifica uma glicerol deidrogenase, implicada no metabolismo glicerol lipídico (Xu et al., 2007).
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Tabela 2: Similaridade encontrada através da análise de BLAST entre os prováveis genes de virulência
de S. pyogenes MGAS5005 M1 e ortólogos encontrados em S. sanguinis SK 36.
Fatores de Virulência
S. pyogenes Função Ref. Ortólogo S. sanguinis (%) Função da proteína ortóloga Ref.
Spy_0267: cbf Participa da atividade catalítica e ligação de ácido nucléico.
1 SSA_2116: cbf (80%) Participa da atividade catalítica e ligação de ácido nucléico.
7
Spy_0731: eno
Codifica a enzima fosfopiruvato hidratase, da família das liases. Fundamental para a glicólise e
gliconeogênese.
2, 3 SSA_0886: eno (94%)
Codifica a enzima fosfopiruvato hidratase, da família das liases. Fundamental para a glicólise e
gliconeogênese. 7 SPy_0453: mtsA Codifica proteínas transmembranares (Sistema de
transporte ABC) que utilizam ATP para translocação de substratos através da membrana.
Papel importante na resposta ao estresse ambiental, e são essenciais para a viabilidade
celular, virulência e patogenicidade.
1, 4 SSA_ 0260: ssaB (78%)
Codifica proteínas transmembranares utilizadas no transporte de Manganês e Zinco. (Sistema de transporte ABC Mn/Zn).
Importantes para a viabilidade celular, virulência e patogenicidade.
7
SPy_0416: prtS
Codifica uma proteinase possivelmente envolvida na integridade do envelope celular.
1, 5 SSA_1882: prtS (43%)
Codifica uma proteína serina protease que cliva ligações peptídicas em proteínas. Importante
no mecanismo catalítico.
7
SPy_2216: htrA
Codifica possivelmente uma serina protease que cliva ligações peptídicas em proteínas.
Importante no mecanismo catalítico.
1 SSA_2381: htrA (54%)
Codifica a proteína DegP que atua como protease, degradando proteínas. Importante na catálise
enzimática.
7
SPy_0281: mecA
Codifica proteína adaptadora (acessória) de principais proteínas em uma via de transdução de sinal. Importante
na sinalização celular.
1 SSA_1958: mecA (50%)
Codifica proteína adaptadora (acessória) de principais proteínas em uma via de transdução de sinal.
Importante na sinalização celular. 7
SPy_2007: Imb
Codifica proteína da lâmina basal de adesão dos tecidos. Importantes para a adesão
celular.
1, 6 SSA_1340 (64%)
Codifica proteínas transmembranares (Sistema de Transporte ABC) utilizadas para o
transporte de Zn/Mn.
7
*A função provável dos genes foi identificada através de análises de BLAST das sequências proteicas e pesquisa de domínios funcionais.
1Ferretti JJ, et al. 2001; 2Ehinger S, et al. 2004; 3Ferretti JJ, et al. 2001; 4Janulczy R, et al. 1999; 5Edwards RJ, et al. 2005; 6Terao Y, et al. 2002; 7Xu P,
19
Tabela 3: Similaridade encontrada através de análise de BLAST entre os prováveis genes de metabolização de
carboidratos complexos de S. pyogenes MGAS5005 M1 e ortólogos encontrados em S. sanguinis SK 36.
Metabolismo de Carboidratos complexos
S.pyogenes Função Ref. Ortólogo S. sanguinis % Função da proteína ortóloga Ref.
SPy_1291: glgP
Codifica provavelmente glicogênio fosforilase. Participa do processo
metabólico de carboidratos. Quebra de glucanos.
1 SSA_ 2265: maIP (70%)
Codifica maltodextrina fosforilase. Participa do processo metabólico de
carboidratos. Quebra de glucanos. 7 SPy_1296: malG
Codifica permease (Sistema de transporte ABC), proteína de membrana para o transporte de maltose e maltodextrina.
Importante para absorção celular.
1 SSA_1300 (73%)
Codifica permease (Sistema de transporte ABC), proteína de membrana para o transporte de maltose. Importante para
absorção celular.
7
SPy_2047: gldA
Codifica glicerol deidrogenase. Participa do metabolismo
glicerol lipídico.
1
SSA_0287: gldA (77%)
.
Codifica glicerol deidrogenase. Participa do metabolismo glicerol lipídico. 7 SPy_0174: uIaA
Codifica Sistema Fosfotransferase específico para ascorbato (vitamina C). Sistema de transporte subunidade IIC.
Importante para absorção celular
1
SSA_2093: sgaT (81%)
Codifica Sistema Fosfotransferase específico para ascorbato (vitamina C).
Sistema de transporte subunidade IIC. Importante para absorção celular
7
SPy_0179: araD
Codifica a L-ribulose-5 phosphate-4 epimerase. É uma isomerase que catalisa a
interconversão de ribulose 5-fosfato e Xilose 5-fosfato na fase oxidativa da via das
pentoses. Importante para mecanismo enzimático.
1
SSA_2088: araD (80%)
Codifica a L-ribulose-5 phosphate-4 epimerase. É uma isomerase que catalisa
a interconversão de ribulose 5-fosfato e Xilulose 5-fosfato na fase oxidativa da via das pentoses. Importante para mecanismo
enzimático.
7
SPy_1704:lacD Codifica tagatose 1,6 difosfato aldolase. Participa do metabolismo da galactose.
1 SSA_1696: lacD (69%) Codifica tagatose 1,6 difosfato aldolase. Participa do metabolismo da galactose.
7
SPy_0855
Codifica Sistema Fosfotransferase Frutose
específico (Componente ABC II) 1 SSA_1082: fruA (72%)
Codifica Sistema Fosfotransferase Frutose
específico (Componente ABC II) 7
SPy_1986
Codifica Sistema Fosfotransferase Glicose específico (EIIC BA componente). Transporta especificamente glicose.
1 SSA_1089: ptsG (69%)
Codifica Sistema Fosfotransferase Glicose específico (EIIC BA componente). Transporta especificamente glicose.
7
SPy_1916: lacG
Codifica a enzima 6- fosfato-beta galactosidase. É uma hidrolase que catalisa a hidrólise da lactose em monossacarídeos.
1 SSA_1692: lacG (90%)
Codifica a enzima 6- fosfato-beta galactosidase. É uma hidrolase que
catalisa a hidrólise da lactose em monossacarídeos.
7
SPy_1922: lacB
codifica a enzima galactose-6-fosfato 1 SSA_1698: lacB (74%) Codifica a enzima galactose-6-fosfato
7
*A função provável dos genes foi identificada através de análises de BLAST das sequências proteicas e pesquisa de domínios funcionais. 1Ferretti JJ, et
al. 2001;7 Xu et al., 2007;
20 1
21 3 PROPOSIÇÃO
O objetivo do trabalho foi investigar a participação do sistema de dois componentes SptRS de S. sanguinis na biologia e adaptação desta espécie ao contato com a saliva humana. Para isto, os objetivos específicos deste trabaho incluíram:
1. Construir mutantes knockout dos genes sptR (SSA_1794) e sptS (SSA_1793) isoladamente ou em conjunto a partir da cepa S. sanguinis SK36.
2. Comparar os mutantes de sptR (SKsptR-), sptS (SKsptS-) e sptRS (SKsptRS-) com a cepa selvagem SK36 quanto à morfologia, ao crescimento planctônico, formação de biofilmes e liberação de DNA genômico para o meio extracelular, produção de peróxido de hidrogênio e à sensibilidade ao estresse oxidativo.
3. Analisar o efeito da inativação de sptS, sptR ou SptRS na viabilidade e persistência de S. sanguinis SK36 em saliva humana.
4. Analisar o efeito da inativação de sptS e sptR na expressão de genes possivelmente envolvidos nos fenótipos alterados nos mutantes SptRS.
5. Comparar a expressão dos ortólogos dos genes alvo de SptRS de S.
pyogenes envolvidos na virulência (cbf, eno, ssaB, prtS, htrA e mec) ou em
adaptações às condições nutricionais salivares (malP, gldA e lacD) entre as cepas cepas SK36 e mutantes SKsptR- e SKsptS-.
23 4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Cepas e plasmídeos selecionados para o estudo e condições de crescimento de rotina.
A cepa S. sanguinis SK36 cujo genoma é conhecido (Xu et al., 2007) foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC) e utilizada para a construção dos mutantes SKsptR-, SKsptS- e SKsptRS- (através de uma inserção de alelo mutado) por meio da estratégia de PCR e ligação (Lau et al., 2002). As cepas S.
mutans UA159 (Ajdic et al., 2002) e S. sanguinis SKvic (mutante knock-out de vicK
de S. sanguinis) (Moraes, 2011) foram utilizadas como controles em diversas análises fenotípicas, uma vez que foram previamente caracterizadas. O plasmídeo pVA838 (Macrina et al., 1982) foi utilizado para a obtenção do gene de resistência a eritromicina para a confecção das cepas mutantes, e o plasmídeo pDL 278 (Dunny et al., 1991) foi utilizado como vetor no processo de transformação e confecção das cepas complementadas, ambos utilizando- se a cepa Escherichia
coli DH5-α (Invitrogen) para a propagação dos mesmos.
Para cada ensaio, as cepas foram cultivadas a partir dos estoques congelados mantidos a -20oC em Skim-milk (Difco Labs), dos quais foram estriados em MSA - (Gold et al.,1973) ou MSA acrescido de 10 μg/ml eritromicina (Sigma - Aldrich, EUA) para manutenção das cepas mutantes (MSE) ou estriados em agar Brain Heart Infusion (BHA) (Merck Labs, Alemanha) acrescido de 10 μg/ml eritromicina e 200 μg/ml de espectinomicina (Sigma - Aldrich, EUA) para a manutenção das cepas complementadas em atmosfera de 10% de CO2 a 37ºC (Water - Jacked CO2 Incubators/Cole Parmer Instruments, EUA) durante 24 h. Após o crescimento, cinco colônias isoladas foram inoculadas em 5 ml de caldo
Brain Heart Infusion (BHI) (Difco Labs, EUA), acrescidas ou não de eritromicina 10
μg/ml (BHIerm) ou espectinomicina (200 μg/ml) (BHIerm/espect) e incubadas durante 18 h sob as mesmas condições citadas anteriormente e utilizadas como inóculo starter (inóculo inicial proveniente de culturas overnight) e que possuíam
