A inativação de sptS e sptR aumenta a expressão de genes relacionados com a produção de peróxido de hidrogênio, biogênese de de

parede celular, adesão e formação de biofilmes.

As alterações nas quantidades relativas de transcritos de diversos genes investigados nas cepas mutantes SKsptS- _{e SKsptR}- _{em relação a cepa selvagem,} estão ilustradas nas Figuras 20A e 20B, respectivamente. Os genes que sofreram aumento significativo no mutante SKsptS- _{foram ackA (5,28 vezes), spxB (27,88} vezes), SSA_0094 (2,14 vezes), gldA (4,83 vezes) e cdwP/SSA_0304 (14,70 vezes). No mutante SKsptR- _{observaram-se alterações em um número maior de} genes. Os genes que sofreram aumento significativo no mutante SKsptR- _foram aqueles envolvidos na produção de H2O2 [ackA (9,65 vezes), tpK (12,19 vezes),

spxB (15,54 vezes)] biogênese de parede celular [cwdP (3,55 vezes)], além de

ortólogos de genes regulados por este sistema em S. pyogenes [mecA (3,08 vezes), prtS (7,13 vezes), ssaB (5,41 vezes), gldA (3,66 vezes)].

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Figura 20: Análises das razões dos níveis de transcritos de diversos genes nas cepas mutantes

em relação a cepa selvagem em crescimento planctônico em aerobiose (A550nm=0,7). A) níveis de

transcritos dos genes expressos por SKsptS- _{em relação a SK36. B) níveis de transcritos dos}

genes expressos por SKsptR- _{em relação a SK36. Os níveis de transcritos de cada gene foram}

normalizados pelo gene de referência gyrA. Asteriscos indicam diferenças significativas entre a cepa SK36 e respectivas mutantes (REST 2009: * p<0,01, **p<0,05). As colunas representam médias de três experimentos independentes.

67 6 DISCUSSÃO

Streptococcus sanguinis são os principais colonizadores primários dos

biofilmes dentários e possuem papel importante no estabelecimento da microbiota dos dentes, pois é encontrado em alta proporção nas etapas iniciais de formação do biofilme e por possuir alta capacidade de adesão às superfícies dentárias recobertas pela película adquirida. Há ainda evidências de que S. sanguinis é competidor do principal patógeno da cárie dentária, Streptococcus mutans (Ge et

al., 2008), que normalmente se estabele em biofilmes já formados e sob condições

ambientais que aumentam a sua competitividade, como a disponibilidade de sacarose. As razões do grande sucesso na colonização inicial dos dentes por S.

sanguinis estão relacionadas à expressão de diversas adesinas de superfície com

alta afinidade aos componentes salivares, o que o torna altamente competitivo frente ao grande número de Streptococcus e outros gêneros bacterianos presentes na cavidade bucal. O genoma de S. sanguinis SK36 contêm um número maior de proteínas ancoradas em sua parede celular, em comparação com outras espécies como S. mutans e S. pnenumoniae (Eguchi et al., 2011). Toda a dinâmica de competição pelos sítios do hospedeiro, colonização e formação de biofilmes dentários envolve os sistemas reguladores de dois componentes (SDC).

O sistema de dois componentes SptRS caracterizado na espécie S.

pyogenes GAS5005 M1 (Shelburne et al., 2005), indicou que a mutação dos

genes que compõem esse sistema, promove a redução da viabilidade desta espécie em saliva humana, bem como regula a transcrição de genes relacionados com a virulência, o que salienta o interesse por esse sistema em outras espécies bucais de Streptococcus, como um alvo terapêutico. Neste estudo, foi demostrado que o sistema SptRS em S. sanguinis regula funções biológicas como a formação de biofilmes, alterações de morfogênese, produção de peróxido de hidrogênio, liberação de DNA genômico para o meio extracelular, adaptação e sobrevivência em saliva humana. Estas alterações fenotípicas foram ainda associadas a

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alterações nos níveis de transcritos relacionados e potenciais genes envolvidos na virulência.O sucesso na obtenção dos mutantes dos genes sptS, sptR e sptR/S que compõem o sistema SptRS de S. sanguinis, isoladamente ou em conjunto, a partir da cepa S. sanguinis SK36 indica que ambas as proteínas SptS com SptR não são essenciais para a viabilidade de S. sanguinis, embora regulem fatores importantes para o estabelecimento deste microrganismo na cavidade bucal.

Em relação ao crescimento das cepas nos diferentes meios de cultura testados, observou - se que não houve diferença entre as cepas mutantes e selvagem SK36, quanto ao crescimento em meios BHI e quimicamente definido sob condições aeróbias. Entretanto, os mutantes apresentaram crescimento significativamente mais lento em meio RPMI, o qual é mais pobre nutricionalmente do que os meios BHI e CMD. Estes dados são compatíveis com um papel do sistema SptRS na adaptação bacteriana a condições com menor disponibilidade de nutrientes (Figura 11).

Análises de morfologia dos mutantes em diferentes fases de crescimento revelando a formação de cadeias de cocos extremamente longas e a formação de grumos (Figura 9) sugere uma função deste sistema em coordenar a biogênese da parede celular, o que é compatível com alterações transcricionais observadas nos genes SSA_0304 (cwdP) e SSA_0094 (Figura 20). SSA_0094 e cwdP são genes que codificam hidrolases de mureína e participam da atividade de integridade celular. A CwdP (SSA_0304) codifica uma hidrolase de mureína, que é uma proteína de degradação de parede celular e SSA_0094 é um gene que codifica uma proteína do tipo LysM, também implicada no metabolismo de sínstese de parede celular. Os genes SSA_0094 e cdwP contêm um motivo proteico de lisina (LysM) que serve para a ligação do peptideoglicano durante a divisão celular. Além disso CdwP contêm um domínio CHAP (cisteína / dependentes de histidina amidopeptidase / amido hidrolase) que é um domínio típico de hidrolases de mureína com atividade de amidase (Layec et al., 2008). O gene cwdP foi recentemente identificado como parte do regulon do sistema VicRK, o qual é um sistema essencial para a viabilidade de S. sanguinis, também envolvido na

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regulação positiva de spxB, gene necessário para a produção de H2O2 (Moraes et

al., 2014). Porém, o mutante duplo SKSptRS- _{mostrou um fenótipo morfológico}

semelhante ao da cepa selvagem SK36 (Figuras 9 e 10) indicando que a mutação dupla pode ter induzido a ativação de outros SDC como mecanismo compensatório da ausência do sistema SptRS. O sistema VicRK pode estar envolvido neste processo, uma vez que regula genes com atividade alterada nos mutantes sptRS (Moraes et al., 2014). Análises da expressão dos genes vicKR entre as cepas analisadas neste estudo poderão auxiliar na elucidação deste ponto. Nas bactérias, o processo de divisão celular envolve as hidrolases de mureínas, algumas dessas denominadas autolisinas, que são expressas para ter funções específicas na quebra das ligações do peptideoglicano durante a biogênese da parede celular das bactérias. Essas funções incluem a organização e modelamento da parede celular durante o crescimento bacteriano, separação dos septos de divisão, autólise, competência, montagem de estruturas de superfície celular (importantes para a adesão e mobilidade) e formação de biofilmes (Vollmer et al., 2008). Proteínas com homologia a hidrolases de mureína já foram identificadas na espécie S. mutans incluindo GbpB (Mattos- Graner et al., 2001) e LysM (Stipp et al., 2013). A GbpB participa da formação de biofilmes, possivelmente mediando as interações de parede celular bacteriana à matriz extracelular de biofilmes (Mattos – Graner et al., 2001; Duque et al., 2011). Em S.

sanguinis, o ortólogo de GbpB também foi identificado, sendo designado ssapcsB

(Moraes, 2011), mas S. sanguinis não apresenta LysM e outras hidrolases de mureína expressas por S. mutans. Por outro lado, S. sanguinis apresenta genes de hidrolases de mureína como SSA_0094 e cwdP, não presentes em S. mutans, o que ressalta diferentes mecanismos de biogênese de parede celular entre estas espécies.

Há ainda pouca informação sobre os mecanismos de formação de biofilmes por S. sanguinis. Ge et al. (2008) analisaram a capacidade de formação de biofilmes maduros (18 h) em S. sanguinis em diferentes meios de culturas, como BHI, BM (meio de cultura modificado por Loo et al., 2000), CMD (Meio

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quimicamente definido utilizado por Kuramitsu & Yoshida, 2002), FCM (Meio quimicamente definido desenvolvido por Terleckyj et al., 1975), THB (Todd Hewitt Broth), TSB (Trypticase Soy Broth) e triptona com extrato de levedura, suplementados ou não com sacarose ou glicose. Estes autores verificaram que S.

sanguinis SK36 foi capaz de formar biofilmes robustos em meio BM suplementado

com 1% de sacarose em condições anaeróbias, seguido dos meios FCM e TSB com 1% de sacarose em aerobiose. Esses dados diferem os resultados de Moraes, 2011 que não observou a formação de biofilmes nos ensaios em microplacas de titulação utilizando meio TSB suplementado com 0,2% e 1% de sacarose após 18 h de incubação em aerobiose. Porém, no presente estudo foi possível observar a formação de biofilmes pela cepa S. sanguinis e mutantes em meios Brucella adicionado de 5% de sangue e 0,1 % de sacarose e CMD adicionado de 1% de sacarose, sem presença de saliva humana, tanto em atmosfera de 10% de CO2 como em aerobiose, indicando que condições nutricionais e fatores biofísicos interferem na capacidade de formar biofilmes pelas cepas estudadas. Além disso, não houve formação de biofilme em meio BHI acrescido de 1% de sacarose pelas cepas estudadas, porém quando as placas foram tratadas e/ou os meios de cultura adicionados de saliva humana, formou-se biofilme tanto em aerobiose como 10%CO2 (Figura 13), indicando que além de fatores nutricionais e biofísicos, S. sanguinis necessita de componentes salivares. A adesão inicial de S. sanguinis a superfícies de vidro também foi altamente dependente da presença de componentes salivares, compatível com o papel de S.

sanguinis como colonizador pioneiro das superfícies bucais recobertas pela

película adquirida (Rosan e Lamont, 2000; Li et al., 2004; Kuramitsu et al., 2007; Hojo et al., 2009; Lee et al., 2011). Como controle das condições experimentais utilizadas, a cepa S. mutans UA159 foi incluída nos ensaios por já ter sido caracterizada (Mattos–Graner et al., 2001). UA159 forma biofilmes de grande biomassa em meio BHI acrescido de sacarose mesmo sem a adição de saliva humana, o que caracteriza diferenças nos mecanismos de formação de biofilmes entre as espécies S. mutans e S. sanguinis. Essas diferenças encontradas

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possivelmente residem no fato de que S. sanguinis não apresenta os genes gtfB,

gtfC que estão presentes em S. mutans, os quais codificam as enzimas

glicosiltransferases, responsáveis pela síntese de glucano insolúveis em água (ricos em ligações do tipo α 1-3) a partir da sacarose, os quais são polissacarídeos de glicose essenciais para a formação de biofilmes e virulência de

S. mutans (Senadheera et al., 2005; Mattos - Graner et al., 2006). Em S. sanguinis

SK36, foi identificado pelo menos um gene que codifica Gtf, gtfP, mas este codifica uma enzima que sintetiza glucanos solúveis (ricos em ligações do tipo α 1- 6) (Xu et al., 2007). O papel de gtfP na virulência de S. sanguinis ainda não foi totalmente esclarecido.

Ensaios de biofilmes de 4 horas (Figura 14) realizados em presença ou não de saliva em meio BHI, indicaram grande capacidade de formação de biofilmes por S. sanguinis na presença de saliva, com maior área de cobertura em atmosfera de aerobiose, dados encontrados também por Moraes, 2011. Entretanto, algumas diferenças na estrutura e morfologia de SK36 foi observada entre os biofilmes realizados nesta tese dos observados por Moraes et al. (2014). Desta forma novos ensaios serão realizados para eliminar possibilidades de contaminação das culturas e ou alterações das condições biofísicas, como o grau de aeração dos meios de cultura. Os colonizadores iniciais, incluindo S. sanguinis,

S. oralis e S. gordonii, aderem - se a película dental (PA) em superfícies sólidas

através de ligações moleculares fracas não colvalentes, como interações eletrostáticas, hidrofóbicas e pontes de hidrogênio (Li et al., 2004; Hahnel et al., 2009). Esses eventos podem promover a subsequente adesão de outros microrganismos com adesinas aos componentes de S. sanguinis, porém inibir a colonização de espécies específicas sensíveis a produtos do metabolismo dos colonizadores pioneiros. Sob disponibilidade de oxigênio, S. sanguinis produz peróxido de hidrogênio. O qual é o principal componente de seu metabolismo capaz de inibir o crescimento de S. mutans (Kreth et al., 2008; Chen et al., 2011). A produção de peróxido de hidrogênio parece ativar a liberação de DNA genômico para o meio extracelular (Kreth et al., 2009), por mecanismos ainda não

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compreendidos. Possivelmente, genes de biogênese de parede celular estejam envolvidos neste processo (Moraes et al., 2014). No presente estudo aumentos dos níveis de transcritos de genes de biogênese e manutenção do envelope celular foram observadas nas cepas mutantes, incluindo-se cwdP (SSA_0304), SSA_0094, e prtS (Figura 20), sugerindo papel de SptRS como repressor destes genes. Na cepa mutante SKsptS- _{apresentou aumento no número de transcritos} nos genes SSA_0094 (2,14 vezes), gldA (4,83 vezes) e cdwP/SSA_0304 (14,70 vezes) (figura 20A). Em SKsptR- _{observou-se aumento significativo nos genes prtS} (7,13 vezes), ssaB (5,41 vezes), gldA (3,66 vezes) e cwdP (3,55 vezes) (Figura 21B). Além disto, observou-se aumento significativo na expressão de mecA (3,08 vezes). Não há dados sobre mecA em S. sanguinis, mas em S. pyogenes e S.

pneumoniae mecA é uma proteína adaptatória que atua na resistência a

antibióticos como a penicilina (Ferreti et al., 2001; Tettelin et al., 2001). Estas alterações transcricionais são compatíveis com as alterações nas curvas de crescimento planctônico e liberação de DNA genômico para o meio extracelular. Além disso foi possível observar alterações de aumento no número de transcritos de genes relacionados com a produção de peróxido de hidrogênio (spxB, ackA

tpK) (Chen et al., 2011). As cepas mutantes apresentaram maior produção de

peróxido de hidrogênio, liberação de DNA genômico para o meio extracelular e tolerância ao estresse oxidativo sob tensão de oxigênio (Figuras 15A, 15B e 16B, respectivamente). Aumentos nos níveis de transcritos dos genes ackA (5,28 vezes) e spxB (27,88 vezes) foram observadas em SKsptS- _{(Figura 20A). Em} SKsptR- _{aumentos nos mesmos genes foram detectados; acka (9,65 vezes), tpK} (12,19 vezes), spxB (15,54 vezes). Outro dado importante foi o aumento na transcrição de ssaB (5,41 vezes) no mutante SKsptR- _{(Figura 20B). Este gene} codifica um transportador de manganês, e sua deleção reduziu drasticamente a virulência em S. sanguinis em modelos de endocardite infecciosa, pois a exigência de manganês está associada ao estabelicimento e patogênese de S. sanguinis (Makhlynets et al., 2013). Além disso o gene ssaB está envolvido na aderência a

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matriz extracelular de biofilmes, contribuindo para a formação e acúmulo da placa dental (Xu et al., 2007);

O sistema SptRS parece influenciar na resposta ao estresse oxidativo em

S. sanguinis. As cepas mutantes crescidas sob aerobiose foram mais resistentes

ao estresse oxidativo quando comparadas à cepa selvagem (Figura 16B). Na presença de oxigênio, ocorre a produção de H2O2, o que ocorre mais intensamente nas cepas mutantes, as quais cresceram melhor após a exposição ao estresse oxidativo (Figura 16B). Os mecanismos de resistência de S. sanguinis a H2O2 ainda não são totalmente compreendidos, mas é provável que para produzir H2O2,

S. sanguinis expresse genes de resistência a esse agente oxidante, e que talvez

envolva mais de um sistema regulador de transcrição. Quando em atmosfera de anaerobiose, S. sanguinis não produz quantidades de H2O2 suficientes para inibir o crescimento de S. mutans (Kreth et al., 2008).

Estudos demonstram que sob aerobiose, S. sanguinis produzem H2O2 a partir da atividade do gene spxB que codifica a piruvato- oxidase (Marquis, 1995; Kreth et al., 2008). Em S. sanguinis o gene spxB é regulado negativamente por CcpA (catabolic control protein A), proteína de controle catabólico (Kreth et al., 2009). Entretanto, não observaram-se variações na transcrição de ccpA nos mutantes SptRS. Mais recentemente, nosso grupo demonstrou que spxB é regulado positivamente pelo SDC VicRK, sendo que mutante knockout deste sistema tem redução significativa da expressão de spxB (Moraes et al., 2014). Dados de RT-qPCR obtidos neste estudo, sugerem fortemente que spxB seja reprimido pelo sistema SptRS, uma vez que a inativação de sptS/R em SK36 promoveu aumentos médios de 27,88 e 15,54 vezes nos níveis de transcritos de

spxB (Figura 20A/B). Análises de interação de proteína SptR com a região

promotora de spxB serão importantes para investigar se spxB é diretamente regulado por SptRS. Além disso observou- se nas cepas mutantes o aumento da expressão de genes como ackA e tpK. A remoção destes genes em S. sanguinis SK36 promoveu reduções significativas na produção de peróxido de hidrogênio (Chen et al., 2011). O mutante ackA demonstrou também diminuição da expressão

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de spxB (Chen et al., 2011). O mutante tpK também produziu menor quantidade de H2O2, porém apresentou aumento da expressão de spxB, indicando que outros fatores de transcrição podem ainda estar implicados no controle da produção de H2O2. O gene ackA codifica uma acetato quinase envolvida na conversão de acetato a acetil CoA, no metabolismo aeróbio, sendo importante para a produção de ATP, rotação flagelar (em bactérias que possuem flagelos) e glicólise. O gene

tpK codifica uma tiamina fosforoquinase, uma enzima que funciona como um co-

fator vital para a respiração celular, durante o metabolismo aeróbio (Chen et al., 2011).

Outro resultado importante descrito neste trabalho e intimamente relacionado com a produção de H2O2 foi o aumento da liberação de DNA genômico para o meio extracelular pelas cepas mutantes (Figura 16B), que pode contribuir para a formação de biofilmes mesmo sem a adição de saliva humana, sob condições nutricionais e biofísicas favoráveis (Figura 13). O DNA genômico liberado para o meio extracelular é um importante componente da matriz extracelular de biofilmes em diversas espécies bacterianas (Dominiak et al., 2010; Fleming e Wingender, 2010; Das et al., 2010). Estudos em S. sanguinis SK36 verficaram que a liberação de DNA genômico ocorre por vias independentes da lise bacteriana (autólise) (Kreth et al. 2009; Moraes et al., 2014). Compatível com estes estudos, não houve alterações na atividade autolítica das cepas mutantes

sptR/S estudadas (Figura 17), embora estas fossem capazes de liberar mais DNA

para o meio extracelular comparadas à cepa SK36. A formação de agregados de cocos pelos mutantes sptS e principalmente sptR, pode portanto estar associada à maior liberação de DNA genômico para o meio extracelular (Figura 9,10 e 15B).

Dados de experimentos de viabilidade em saliva humana revelaram que as cepas mutantes sofreram uma queda das contagens de log de ufc/ml, quando comparadas com a cepa selvagem (Figura 18), também implicando a participação deste sistema SptRS na adaptação da espécie S. sanguinis à saliva, como descrito para S. pyogenes (Shelburne et al., 2005). Estes dados reforçam ainda mais o interesse em se estabelecer o regulon de SptRS através de estratégias de

75

larga escala e de investigar como este sistema se comunica com outros SDC reguladores de fatores de virulência e formação de biofilmes em S. sanguinis.

76 1

77 7 CONCLUSÃO

Com bases nos resultados apresentados neste trabalho, pode- se concluir que na cepa S. sanguinis SK36:

7.1 Os genes sptS (codificador da histidina - quinase sensora) e sptR (codificador do regulador de resposta) do sistema SptRS de S. sanguinis não são genes essenciais para a viabilidade.

7.2 O sistema SptRS regula funções importantes para a morfogênese, crescimento em fase planctônica e em biofilmes.

7.3 A inativação de sptR, sptS isoladamente ou em conjunto diminui a capacidade de sobrevivência e adaptação em saliva humana.

7.4 A inativação de sptR e sptS promove o aumento na produção de peróxido de hidrogênio e maior liberação de DNA genômico para o meio extracelular.

7.5 A inativação de sptR e sptS promove diminuição da resistência ao estresse oxidativo sob condições atmosféricas específicas (anaerobiose).

7.6 A inativação de sptR e sptS promove aumento significativo na expressão dos genes ackA, tpK, spxB, SSA_0094 e cwdP, envolvidos na produção de peróxido de hidrogênio, biogênese do envelope celular e crescimento em biofilmes.

7.7. A inativação de sptR promove aumento significativo na expressão dos genes mecA, prtS, ssaB e gldA.

78 1

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REFERÊNCIAS

1. Ajdic D, McShan WM, McLaughlin RE, Savic G, Chang J, Carson MB, Primeaux C, Tian R, Kenton S, Jia H, Lin S, Qian Y, Li S, Zhu H, Najar F, Lai H, White J, Roe BA and Ferretti JJ. Genome sequence of Streptococcus mutans UA159, a cariogenic dental pathogen. PNAS. 2002; 99 (22): 14434-14439.

2. Anh SJ, Burne RA. Effects of oxygen on biofilm formation and the AtlA autolysin of Streptococcus mutans. J Bacteriol. 2007; (189): 6293-6302.

3. Baldek JD, Marquis RE. Targets for hydrogen- peroxide induced damage to suspension and biofilm cells of Streptococcus mutans. Can J Microbiol. 2008; 54: 868-875.

4. Banas JA, and Vickerman MM. Glucan- binding proteins of the oral streptococci. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 2003; (14): 89-99.

5. Bhagwat SP, Nary J, Burne RA. Effects of mutating putative two component systems on biofilm formation by Streptococcus mutans UA159. FEMS Microbiol Lett. 2001; (205):225-30.

6. Birnboim HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 1979 Nov 24; 7(6):1513-23.

7. Biswas I, Drake L, Erkina D, Biswas S. Involvement of sensor kinases in the