4. MATERIAL E MÉTODOS
6.6 Identificação das DTU(s) do Trypanosoma cruzi segundo o novo consenso taxonômico
A Tabela V relaciona os resultados obtidos na análise do polimorfismo de diferentes alvos gênicos para a caracterização molecular das amostras de T. cruzi isoladas dos pacientes e dos clones de referência das seis DTU(s) dessa espécie, segundo o critério proposto por Lewis et al. (2009). Esses resultados mostram que foi possível identificar 84,31% (43) das amostras avaliadas nesse estudo como pertencentes a linhagem TcII que apresentaram em conjunto: um fragmento de 125pb para rDNA, 1 banda de 432 a 462pb no RFLP-HSP60/ECORV e 3 bandas com tamanhos entre 200pb e 500pb no RFLP- GPI/HhaI. Entretanto, em oito amostras (15,68%), isoladas dos pacientes de Berilo e José Gonçalves não foi possível determinar a classificação final seguindo o tripé de análise proposto por esses autores.
As amostras 229, 452, 748, 798, 1205, 1337, 2118 e 2119 apresentaram diferentes combinações de resultados daqueles previamente determinados para as seis DTU(S) do T. cruzi por Lewis et al. (2009). Todas essas amostras apresentaram um fragmento de 125pb na análise do polimorfismo da região 3’ do rDNA que seria característico das linhagens TcII, TcIV e TcVI. Entretanto, as amostras 229 e 798 apresentaram um perfil de banda único no RFLP-PCR HSP60 e um perfil de banda dupla no RFLP-PCR GPI/HhaI as quais somente poderiam ser identificadas como
PM C1 C2 C3 C4 C5 C6 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 Br
Figura 7: Perfis de DNA obtidos pela genotipagem de isolados de Trypanosoma cruzi provenientes de pacientes da região do Vale do Jequitinhonha, MG, por meio da análise do polirmorfismo do espaçador intergênico do miniexon.
PM – padrão de peso molecular de 1KB; C1 - clone Cutia cl1(DTU TcI), C2 clone Tu18cl1 (DTU TcII), C3 e C4 clones X109/2 (DTU TcIII) e 9212210R2 (DTU TcIV), C5 e C6 clones SO3cl5 e Tula cl2 representantes das DTU(s) TcV e TcVI respectivamente, A1: amostra 229; A2 - 452; A3 - 748; A4 - 798; A5 - 1205; A6 - 1337; A7 - 2118; A8 - 2119; A9 - 376; A10 - 2497, A11 - 493; A12 - 820; A13 - 1107; A14 - 2478; A15 - 1918; A16 - 2014; Br: controle negativo da reação. O espaçador intergênico do Mini-exon (Freitas et al., 2006) é capaz de separar as DTU’s TcIII e TcIV, que apresentam perfis de bandas de 200pb, das demais DTU’s TcI, TcII, TcV e TcVI, esses com fragmentos de 150 a 157pb.
característicos a linhagem do TcI baseada no perfil desses dois marcadores. Por outro lado, os isolados 452, 748, 1205, 1337, 2118 e 2119 apresentaram perfil de bandas triplo para o gene HSP60/ECORV e bandas duplas para a GPI/HhaI respectivamente, sem a possibilidade de classificação segundo a metodologia adotada.
Desse modo, nesse sistema de classificação não existe essas possibilidades de combinação de resultados entre os marcadores, necessitando da investigação de novos alvos gênicos para identificação final dessas amostras.
Atualmente muitos autores tem empregado a análise combinada do polimorfismo da região do 24Sα rDNA, da subunidade II do gene da Citocromo Oxidase (CoII) e do espaçador intergêncio do mini-exon (SL-IR) para acessar a variabilidade genética em populações do T. cruzi (D’ávila et al,. 2009; Câmara et al., 2010; Andrade et al., 2011, Zafra et al., 2011; Zingales et al., 2012). Os resultados esperados para as seis diferentes DTU(s) estão descritos na Tabela V e fundamentados na mesma. As oito amostras com resultados incongruentes no sistema proposto por Lewis et al. (2009) foram todas classificadas como pertencentes a linhagem TcVI, seguindo a metodologia de classificação proposta por D’ávilla et al., (2009). Estas apresentaram perfil de 125pb no rDNA, aproximadamente 150pb no espaçador intergênico dos mini-exon e, após digestão dos produtos amplificados do gene CoII com a enzima ALUI, apresentaram perfil de bandas duplas (294pb, 81pb) podendo assim serem enquadradas como pertencentes ao haplogrupo Mitocondrial B, e em uma análise conjunta das três técnicas, ao isolados classificados como TcVI.
Vale ressaltar que todos os outros isolados foram classificados como TcII pelas duas metodologias de classificação adotadas neste estudo (Lewis et al., 2009 e D’ávilla et al., 2009). Na identificação dos DTU(s) segundo Lewis et al., (2009) as amostras apresentaram perfis de 125pb para o LSU-rDNA + 1banda para o RFLP-PCR HSP60/ECORV + 3 bandas para o RFLP-PCR GPI/HhaI, compatível com os clones de referência pertencente ao DTU TcII (MAScl1). Para a genotipagem segundo D’ávilla et al., (2009) os mesmos isolados apresentaram perfis de: 125pb para LSU-rDNA + perfis característico do haplogrupo mitocondrial C (212pb + 81pb) + 150/157pb no SL-IR, podendo assim afirmar a genotipagem dos 43 isolados como TcII.
Classificação segundo Lewis et al., 2009 Classificação segundo D’ávilla et al., 2009 Amostra 24Sα rDNA (pb) HSP60/ECOR GPI/HhaI Classificação 24Sα rDNA (pb)
COII SL-IR Classificação (N° de
bandas)
(N° de
bandas) (haplogrupo) (pb) Final
P209 cl1 110 1banda 2bandas TcI 110 A 150/157 TcI
MAS cl1 125 1banda 3bandas TcII 125 C 150/157 TcII
CM-17 110 2bandas 2bandas TcIII 110 B 200 TcIII
CANIII cl1 ~120 1banda 3bandas TcIV 125 B 200 TcIV
Bug2148 cl1 110+125 3bandas 4bandas TcV 110+125 B 150/157 TcV
Tulahuencl2 125 3 bandas 4bandas TcVI 125pb B 150/157 TcVI
229 125pb 1banda 2bandas ?? 125pb B 150/157 TcVI
264 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
376 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
438 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
440 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
452 125pb 3bandas 2bandas ?? 125pb B 150/157 TcVI
501 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
523 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
525 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
529 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
543 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
595 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
646 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
728 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
748 125pb 3bandas 2bandas ?? 125pb B 150/157 TcVI
791 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
798 125pb 1banda 2bandas ?? 125pb B 150/157 TcVI
817 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
818 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
820 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
839 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
845 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
860 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
896 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
914 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
953 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
1100 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
1107 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
1205 125pb 3bandas 2bandas ?? 125pb B 150/157 TcVI
Tabela V - Identificação das amostras de Trypanosama cruzi isolados de pacientes dos Municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas, Vale do Jequitinhonha MG, segundo o novo consenso táxonômico (Zingales et al., 2009).
1315 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
1337 125pb 3bandas 2bandas ?? 125pb B 150/157 TcVI
1442 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
1635 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
1918 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
2014 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
2118 125pb 3bandas 2bandas ?? 125pb B 150/157 TcVI
2119 125pb 3bandas 2bandas ?? 125pb B 150/157 TcVI
2408 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
2478 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
2491 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
2495 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
2497 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
2535 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
1536 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
1113 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
467 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
479 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
493 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
653 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
PSF 060 125pb 1banda 3bandas TcII 125pb C 150/157 TcII
6.7 RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA)
Os dados de RAPD foram usados para estimar a relação filogenética entre os estoques de T. cruzi, uma matriz foi construída manualmente considerando a presença e ausência de bandas obtidas após observação dos produtos da PCR provenientes da amplificação, empregando 10 diferentes primers. Somente fragmentos demonstrando nitidez foram selecionados. Após amplificação com esses primers, 4731 fragmentos foram observados sendo detectados 2 diferentes genótipos. O tamanho de bandas detectadas variou entre 100pb e 1400pb.
A Figura 8 abaixo representa os perfis de bandas encontrados obtidos para a amplificação com dois primers N9 e B15 (Brisse et al., 2000b).
Gel A
Gel B
PM C1 C2 C3 C4 C5 C6 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17
PM C1 C2 C3 C4 C5 C6 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17
Figura 8: Perfis de RAPD em isolados de Trypanosoma cruzi obtidos de pacientes dos municípios de Berilo e José Gonçalvez de Minas, região do Vale do Jequitinhonha, MG, submetidos a amplificação empregando os primers N9 (Gel A) e B15 (Gel B).
PM – padrão de peso molecular de 100pb, C1 a C6 perfis de bandas apresentado pelos seis clones de referência dos seis DTU’s do Trypanosoma cruzi, onde nos géis A e B, C1 representa os perfis do clone de referência da DTU TcI, P209 cl1; C2: MAS cl1 (TcII), C3: CM-17 (TcIII), C4: CANIII (TcIV), C5: Bug2148 cl1 (TcV), C6: Tulahen cl2 (TcVI), respectivamente.
No gel A, a amostra A1, corresponde ao isolado 953, A2- 820, A3 - 458, A4 - 523, A5- 2014, A6 - 2478, A7 - 467, A8 - 1536, A9 - 818, A10 - 060/05, A11 - 845, A12 - 452, A13- 1315, A14 - 529, A15 - 1918, A16 - 2497 e A17 - 1107 respectivamente.
No gel B, A1 - corresponde a amostra 845, A2 - 264, A3 - 501, A4 - 953, A5 - 2478, A6 - 798, A7 - 2335, A8 - 2491, A9 - 440, A10 - 1442, A11 - 376, A12 - 820, A13- 493, A14 - 2408, A15 - 748, A16 - 896 e A17 - 1315 respectivamente.
O fenograma foi obtido usando o método de UPGMA (Média aritmética não ponderada). Os estoques de T. cruzi se dividiram em dois ramos distintos, um contendo o T. cruzi I e, o outro, as demais que apresentaram subdivisões claramente definidas em T. cruzi II (Zingales et al., 2009) – Figura 9.
A inclusão dos clones de referência permitiu verificar que a grande maioria das cepas apresentou similaridade com aqueles representantes da DTU II, mas esse grupo apresentou a estruturação em dois ramos evidentes um contendo o clone de referência MAS cl1, 728 e 1100 e, no outro, os demais isolados que apresentaram certa variabilidade no interior do grupo. Oito isolados (229, 452, 748, 798, 1205, 1337, 2118 e 2119) se agruparam com o clone de referência pertencente a DTU VI.
Figura 9: Fenograma obtido pelo método de UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Analysis) de todos os 51 isolados de Trypanosoma cruzi e respectivos clones representativo de cada DTU do parasito, submetidos a analise do polimorfismo genético analisados no programa TREECON, e Bootstrap com repetições de 1000 vezes.
P209 cl1, clone representativo do genótipo TcI; MAS cl1 - genótipo TcII; CM-17 – TcIII, CANIII cl1 – TcIV; Bug2148 cl5 – TcV e Tula cl2 TcVI.