Identificação e quantificação dos esteróis em sedimentos

A metodologia para a análise dos esteróis foi adaptada de Wakeham e Canuel (1998). Foram pesadas alíquotas de 5 a 6g das amostras de sedimentos mais arenosas e de 4 a 5g das amostras mais argilosas para extração dos esteróis com diclorometano e metanol em 4 etapas. Na 1º etapa foi acrescentado a cada amostra 10ml de diclorometano, na 2º foram acrescentados 5ml de diclorometano mais 5ml de metanol, e na 3º e 4º etapas foram usados 10ml de metanol. Entre cada uma dessas etapas, as amostras foram colocadas em banho-maria com ultra-som à 30°C por 15minutos, em seguida foram centrifugadas a 2.000rpm durante 3 minutos para a precipitação do sedimento. O sobrenadante foi transferido para um tubo de ensaio. Ao final das 4 etapas todos os tubos de ensaio foram centrifugados a 3.000rpm por 5 minutos para a precipitação de qualquer resíduo de sedimento. O sobrenadante foi levado ao roto-evaporador, contudo os solventes não foram totalmente evaporados, deixando-se aproximadamente 1ml de solvente no balão, para evitar a perda de material do extrato nas paredes da vidraria. Aos extratos foram acrescentados 2 mL de heptano, e esse foi transferido pausadamente para vials de 2 mL, enquanto esse volume acrescentado ao vial era seco com N2. Os vials com extrato seco foram armazenados em freezer.

Para o fracionamento, os extratos foram re-eluídos com 1ml de heptano, sendo 500µl eluído em coluna de Sílica Merck (mesh 0,063-0,100mm) previamente ativada em mufla a 120ºC por 24 horas, posteriormente desativada com um volume de água destilada equivalente a 5% da massa da sílica pesada, e diluída em heptano na concentração de 2,5g de sílica/ml de heptano. A coluna cromatográfica foi adaptada para uma pipeta de Paster (figura 4.5), foram adicionados diferentes solventes em diferentes volumes e polaridades, para então separar a fração relativa aos esteróis, de acordo com a tabela 4.2. As demais frações também foram coletadas para se verificar a eficiência do fracionamento. As frações foram secas com N2 e

depois congeladas.

As frações secas foram re-eluídas com 25µl de tolueno e 25µl de derivatizador (bis(trimethylsilyl)trifluoro-acetamida – BSTFA) para substituir os radicais livres por grupos

e quantificados por cromatografia gasosa com detector FID e coluna capilar DB-5. A temperatura do injetor foi de 280°C, do detector de 300°C e a rampa programada para 100°C iniciais, com acréscimos de temperatura de 10°C/min até atingir 215°C (14,5 min); 5°C/min até atingir 250°C (21,5 min); 2°C/min até atingir 280°C (36,5 min) e 10°C/min até atingir 320°C (40,5 min). Os esteróis identificados foram o coprostanol, colesterol, colestanol, colestanona, campesterol, estigmasterol, β-sitosterol e estigmastanol. Esses compostos foram identificados comparando-se com padrões (Sigma-Aldrich) injetados individualmente, com a mesma programação da rampa, possibilitando determinar os tempos de retenção correspondentes nos cromatogramas das amostras.

As concentrações foram calculadas pelas injeções de concentrações conhecidas do padrão interno artificial 5α-colestano. Foi construída uma curva padrão, e pela equação da reta, determinada por essa curva, calculou-se a concentração (µg.g-1) dos esteróis presentes nas amostras. Considerando as diluições realizadas até o momento da injeção da amostra, chegou-se a concentração dos compostos/g de sedimento e concentração dos compostos/g de carbono orgânico.

Figura 4.5 - Esquema da coluna cromatográfica com pipeta Pasteur. 4 cm livre p/ injeção dos solventes

Sílica

Lã de vidro

Vial para coleta da fração

Fluxo de N2 para secagem da fração

Tabela 4.2 – Frações geradas após a extração dos sedimentos. A fração (F4) referente aos esteróis está destacada em negrito.

Fração Volume Solvente Composto

F1 0,5 + 2,0 Heptano n-alcanos

F2 2,5 Heptano + Tolueno

50% Álcools e Graxas,

F3 2 Heptano + Ac. Etila

10%

Cetonas e Alquenonas

F4 3 Heptano + Ac. Etila

20% Esteróis

F5 3 Ac. Etila HPAs

F6 3 Metanol Amostra

(recuperação)

4.3 TRATAMENTO ESTATÍSTICO

Para análises estatísticas foi elaborada primeiramente uma matriz que considerou como casos as amostras de água em 16 estações durante 5 coletas tendo como descritores 10 variáveis (OD, COND, TEMP, PH, SAL, DBO, CLA, MPS, COD, NDT). Posteriormente foi elaborada uma matriz para as amostras de sedimentos do rio (14 casos) e outra para a enseada (15 casos) com 17 descritores (Casacalho, Areia, Silte, Argila. C, N, C/N, 13C, 15N, Coprostanol, Colesterol, Colestanol, Colestanona, Estigmasterol, b-Sitosterol, Estigmastanol), sendo que na enseada não ocorreu o descritor cascalho.

O estudo estatístico das matrizes citadas anteriormente foi realizado pelo programa STATISTICA 7.0 (Copyright © 1984-97, Statsoft Inc.). A normalidade dos parâmetros foi testada pelo teste Shapiro-Wilk (p<0,005), apresentando distribuição não normal. Dessa forma, foi adotado o tratamento estatístico não paramétrico.

Foi utilizada a correlação de Spearman, que opera com ranking das medidas para cada variável (ZAR, 1999). A análise de cluster, entre os parâmetros e as estações, foi realizada mediante o método de agrupamento de Ward, com distância euclidiana.

A análise das componentes principais foi realizada para cada matriz (água, sedimentos rio e enseada) tanto para os casos como para as variáveis. É uma técnica de transformação de variáveis, onde cada variável medida pode ser considerada como um eixo de variabilidade estando usualmente correlacionada com outras variáveis. Graficamente pode ser descrita

como a rotação de pontos existentes num espaço multidimensional originando eixos, ou componentes principais, que dispostos num espaço a duas dimensões representem variabilidade suficiente para indicar um padrão a ser interpretado (BERNARDI et al., 2001).

Os componentes principais são resultados do carregamento das variáveis originais em cada um deles. Tais carregamentos podem ser considerados como uma medida da relativa importância de cada variável em relação às componentes principais e os respectivos sinais, se positivos ou negativos, indicam relações direta e inversamente proporcionais. A matriz de carregamentos de cada variável nas componentes principais ao ser multiplicada pela matriz original de dados fornecerá a matriz de contagens (escores) de cada caso em relação às componentes principais. Esses valores poderão ser dispostos num diagrama de dispersão, onde os eixos são as duas componentes mais importantes e assim mostrar o relacionamento entre os casos condicionados pelas variáveis medidas (BERNARDI et al., 2001).

5 RESULTADOS

Primeiramente estão apresentados os resultados das amostras de água, sendo as estações classificadas como de água doce agrupadas em uma única tabela, as de água salobra em outra e as estações lagoa de estabilização (LE) e calha de água pluvial (AP) em uma terceira. Os gráficos foram elaborados de maneira que as estações são apresentadas conforme o gradiente espacial, exceto no caso da condutividade e salinidade, quando ocorre elevada discrepância entre os valores das estações de água doce e salobra.

Posteriormente estão apresentados os resultados dos sedimentos dos rios seguidos dos da enseada, por parâmetro analisado, de forma que possibilite comparações entre estes compartimentos.