Imunohistoquímica

A percentagem de células CD3-positivas encontra-se representada na Figura 16. Podemos verificar que o grupo CTR 48h apresenta uma percentagem de 11,7% de células marcadas e que é superior aos restantes grupos, uma vez que nos grupos de diabetes a percentagem obtida foi de 6,4% para o DM 48h e 5,4% para o DM 3S, e nos grupos controlo das 3 semanas a percentagem foi de 6,1%. Os grupos de animais diabéticos (DM 48h e DM 3S) possuem uma percentagem de células positivas menor que os grupos dos animais controlo, sendo que o grupo DM 3S é o que apresenta uma percentagem menor. A média do

C

A

A

D

B

Figura 13 - Análise histológica da pele dos animais diabéticos e controlo que foram eutanasiados 48 horas (A e B) e 3

semanas (C e D) após a implantação, observando-se o implante de membrana de colagénio e infiltrado inflamatório adjacente. Nas Fig. A e B observa-se infiltrado inflamatório marcado, enquanto nas Fig. C e D se observa infiltrado inflamatório escasso. A- grupo CTR 48h; B- grupo DM 48h; C- grupo CTR 3S; D- grupo DM 3S. HE, objetiva 40x.

número de células positivas visualizadas por campo está representada na Tabela 11. Analisando a tabela podemos verificar que o número de células CD3+

é superior nos grupos de animais sacrificados 48 horas após implantação (CTR 48h e DM 48h) do que nos grupos de animais sacrificados às 3 semanas (CTR 3S e DM 3S). Podemos observar também que os grupos de animais controlo (CTR 48h e CTR 3S) possuem um número de células positivas mais elevado do que animais diabéticos (DM 48h e DM 3S).

Tabela 11 - Média das células CD3-positivas visualizadas por campo referentes a cada um dos diferentes

grupos.

Na Figura 17 encontram-se imagens representativas da imunomarcação observada em cada um dos grupos de animais. Nesta figura distinguem-se as células CD3-positivas, a castanho, com uma intensidade de marcação forte no citoplasma. Nas imagens podemos

CTR 48h DM 48h CTR 3S DM 3S CD3+

17±7,36 5±3,36 4±1,64 2±1,40

Figura 14 – Valores da percentagem de células CD3-positivas, obtidos a partir da contagem de células

marcadas e o total de células presentes em cada campo, para os diferentes grupos experimentais. (diferença estatisticamente significativa do grupo CTR 48h (p<0,001), ** diferença estatisticamente significativa do

grupo DM 48h (p<0,050). 11,7 6,4 7,8 _5,4 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 CTR 48h DM 48h CTR 3s DM 3s % D E L IN F Ó C IT O S MA R C A D O S * * **

observar que no grupo CTR 48h (Figura 18 A) se observam mais células marcadas do que nos grupos DM 48h, CTR 3S e DM 3S (Figura 18 B, C e D, respetivamente).

2.2.2. BLA

A percentagem de células marcadas para o BLA encontra-se representada na Figura 18. Podemos verificar que os grupos de animais diabéticos possuem uma maior percentagem de células marcadas (9,3% no grupo DM 48h e 8,7% no grupo DM 3S) do que os animais controlo (7,2% no grupo CTR 48h e 6,6% no grupo CTR 3S). Os grupos relativos às 48 horas obtiveram uma maior percentagem de células marcadas do que os grupos de animais das 3

C

A

A

D

B

Figura 15 - Análise imunohistoquímica anti-CD3, sendo observada positividade maior no grupo CTR 48h (A). A- grupo

semanas. A Tabela 12 apresenta a média do número de células marcadas por campo e analisando a tabela podemos verificar que existe um maior número de células marcadas nos animais sacrificados às 48 horas relativamente aos grupos das 3 semanas. O grupo de animais CTR 48h apresenta um maior número de células positivas do que o grupo DM 48h; no entanto, comparando os grupos relativos às 3 semanas, existe um maior número de células BLA+ no grupo DM 3S do que no grupo CTR 3S. A Figura 20 representa a marcação deste anticorpo em imagens representativas cada uma correspondente a um grupo diferente de animais.

Tabela 12 - Média das células BLA-positivas visualizadas por campo referentes a cada um dos diferentes

grupos. CTR 48h DM 48h CTR 3S DM 3S BLA+ 8±4,25 7±3,20 3±1,70 5±2,04 7,2 9,3 6,6 8,7 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 CTR 48h DM 48h CTR 3S DM 3S % D E L IN F Ó C IT O S MA R C A D O S * **/***

Figura 16 – Valores da percentagem de células BLA-positivas, obtido a partir da contagem de células

marcadas e o total de células presentes em cada campo, para os diferentes grupos experimentais. (* diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo CTR48h (p<0,001), ** diferença estatisticamente

significativa relativamente ao grupo DM48h (p<0,050), *** diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo CTR 3S (p<0,050)).

2.2.3. CD79

A percentagem de células CD79-positivas estão representadas na Figura 20. Podemos verificar que, assim como acontece com o anticorpo BLA, existe uma maior percentagem de células marcadas nos grupos diabéticos, 9,9% no grupo DM 48h e 8,2% no grupo DM 3S, do que nos grupos controlo (8% de células marcadas no grupo CTR 48h e 7,7% no grupo CTR 3S). Na Tabela 13 estão representadas as médias do número de células positivas por campo. Observando a tabela podemos verificar que existe um maior número de células positivas nos animais controlo do que nos animais diabéticos, do mesmo modo, verifica-se que o número de células CD79+ é superior nos animais sacrificados 48 horas após implantação do que nos animais sacrificados às 3 semanas.

C

A

D

B

Figura 17 - Análise imunohistoquímica anti-BLA na periferia do implante em cada um dos grupos experimentais. A-

Na Figura 21 observam-se imagens representativas de cada um dos grupos relativamente à marcação com o anticorpo CD79. Na imagem podemos ver uma marcação citoplasmática intensa, de cor castanha, tornando possível a distinção das células imunorreativas das células não marcadas.

Tabela 13 - Média das células CD79-positivas visualizadas por campo referentes a cada um dos diferentes

grupos. CTR 48h DM 48h CTR 3S DM 3S CD79+ 11±4,36 8±3,12 5±2,68 4±2,46 8,0 9,9 7,7 8,2 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 CTR 48h DM 48h CTR 3S DM 3S % D E L IN F Ó C IT O S MA R C A D O S * * **

Figura 18 - Valores da percentagem de células CD79-positivas, obtido a partir da contagem de células marcadas e

o total de células presentes em cada campo, para os diferentes grupos experimentais. (* diferença estatisticamente significativa do grupo CTR 48h (p<0,001), ** diferença estatisticamente significativa do grupo CTR 3S

C

A

A

D

B

Figura 19 - Análise imunohistoquímica anti-CD79 na periferia do implante em cada um dos grupos experimentais. A-

V. DISCUSSÃO

A implantação de dispositivos médicos ou biomateriais despoleta, por parte do hospedeiro, uma resposta imune, que desempenha um papel fundamental na sua biocompatibilidade (Brown e Pandit, 2015).

Grande parte destes dispositivos médicos tem sido testada em animais e indivíduos normais. No entanto, é comum na prática clinica referir-se que os dispositivos médicos implantados em condições diabéticas geram problemas de rejeição, infeção e degradação precoce. Tem sido descrito que a resposta imune em condições diabéticas está alterada, tendo sido a hiperglicemia apontada como uma das causas mais frequentes (Rubinstein et al. 2008). Dado o exposto torna-se relevante caracterizar a resposta imune em condições diabéticas.

Para avaliar a resposta imune à implantação de uma membrana de colagénio em condições diabéticas utilizámos como modelo animal ratos machos da estirpe Wistar, e induzimos a condição diabética com STZ. Dentro da variedade de modelos animais da diabetes optámos por ratos porque estes são animais pequenos e, por conseguinte, fáceis de alojar, por se adaptarem facilmente ao novo espaço, por constituírem um modelo animal de baixo custo e pelo seu fácil manuseamento. Por outro lado, são animais geneticamente idênticos entre si, o que torna os resultados mais uniformes, e a sua genética e características biológicas são semelhantes às dos humanos mimetizando, assim, a diabetes humana (Rand, 2008; Iannaccone e Jacob, 2009). A escolha do sexo dos animais deveu-se ao facto de animais machos não possuírem ciclos reprodutivos nem flutuações hormonais que poderiam interferir com os resultados do estudo. Outra característica que influenciou a escolha de ratos machos foi por possuírem maior susceptibilidade ao STZ do que ratos fêmea (Deeds et al., 2011).

Embora o número de estudos realizados in vitro tenha vindo a aumentar ao longo dos últimos anos, com o objetivo de reduzir o número de animais utilizados na investigação, neste trabalho optamos por utilizar o método in vivo uma vez que o objetivo foi estudar a resposta inflamatória aguda e crónica após a implantação da membrana de colagénio e os vários processos da inflamação só podem ser parcialmente simulados in vitro (Ullm et al., 2014). O número de animais utilizados foi o menor possível e todos os procedimentos tiveram em atenção minorar o sofrimento e dor e maximizar o bem-estar animal.

Para o estudo da diabetes existem vários modelos animais como os modelos espontâneos da diabetes, indução química da diabetes através de agentes químicos como o STZ e Aloxano, remoção cirúrgica do pâncreas, diabetes induzida geneticamente e diabetes

induzida por vírus (King, 2012). A indução química é o método mais utilizado para produzir a diabetes em ratos e tem provado ser extremamente eficaz, além de ser um método barato e simples (Kumar, 2013), sendo deste modo a administração de STZ o modelo escolhido para a indução da diabetes no presente estudo.

A escolha do STZ em vez do Aloxano deve-se ao facto de o STZ ser menos tóxico, mais eficaz na indução da diabetes, mais específico e apresentar uma taxa de mortalidade mais baixa (Islas-Andrade et al., 2000). A ação citotóxica do STZ é mediada por espécies reativas de oxigénio, assim, as suas propriedades alquilantes provocam a fragmentação do DNA, modificando as macromoléculas biológicas e levando à destruição das células β. O STZ reconhece o transportador GLUT2 que está presente nas células β levando à sua destruição, no entanto, este indutor químico também pode afetar outros órgãos que possuam ao GLUT2 (Chatzigeorgiou et al., 2009; King, 2012).

Quando administrado numa única dose de elevada concentração, o STZ destrói totalmente as células β pancreáticas levando ao aparecimento da diabetes tipo 1. Assim, aos animais deste estudo foi administrado STZ com a concentração de 50 mg/kg, através de uma única injeção intraperitoneal. O nível de glucose foi medido após 15 dias em cada animal e todos apresentaram um índice glicémico superior a 250 mg/dl, podendo ser assim demonstrada a eficácia do STZ. O modo de administração poderia ser feito por uma injeção subcutânea, intravenosa (IV) ou intraperitoneal (IP). A administração foi realizada por via IP pelo facto de ser um método mais aconselhável para pequenos animais.

A escolha de uma concentração de STZ apropriada é muito importante. Na literatura são descritas concentrações diferentes de STZ para diferentes protocolos utilizados. No estudo realizado por Wang et al. (2014) foi utilizada uma concentração de 65 mg/kg em ratos, que levou a uma taxa de mortalidade de 43,33%. O estudo conduzido por Qinna e Badwan (2015), onde foi utilizada uma concentração de STZ de 80 mg/kg, apresentou uma taxa de mortalidade de 70%, o que revela que estas dosagens são demasiado elevadas.

A diabetes é um doença crónica que afeta milhões de pessoas em todo mundo. Além de todas as complicações que podem surgir derivadas da diabetes, um problema grave que afeta os pacientes com diabetes é a dificuldade de cicatrização dos tecidos, existindo uma grande diversidade de fatores fisiológicos que contribuem negativamente para a cicatrização nestas condições. O organismo dos indivíduos diabéticos possui uma capacidade baixa para combater infeções podendo tornar-se incapaz de alcançar uma resposta imune adequada (Brem e Tomic-Canic, 2007). A resposta imune à implantação das membranas de colagénio

em condições diabéticas ainda não é bem entendida, tornando-se necessário a avaliação de vários parâmetros que permitam verificar a biocompatibilidade e a biodegradabilidade deste biomaterial em condições diabéticas.

Depois da indução da diabetes, foram notadas algumas alterações nos animais e no seu comportamento caraterísticas da diabetes, como apatia, aumento do apetite, aumento do consumo de água, perda de peso, aumento do volume de urina e glicosúria. Os animais tiveram sempre água e comida à disposição e ad libitum e todas as semanas foi medido o consumo de água e comida. No final do protocolo experimental pudemos verificar que os animais diabéticos consumiram mais água e comida do que os animais controlo. Vários autores, que realizaram trabalhos nas mesmas condições, obtiveram resultados semelhantes (Akbarzadeh et al., 2007; Modi et al., 2012). O excesso de consumo de água deve-se à glicosúria desencadeada pela hiperglicemia. A glicosúria, por sua vez, contribui para o aparecimento da diurese osmótica (poliúria) que induz hiperosmolaridade e que leva ao esgotamento de água intracelular. Deste modo, esta desidratação gera um sinal estimulante que é enviado para os osmorreguladores cerebrais da sede, aumentando assim a sensação de sede (polidipsia) e consequentemente o consumo de água (Okon et al., 2012; Offor, 2015). O aumento do consumo de alimento por parte dos animais diabéticos (polifagia) é devida à hiperglicemia. Na diabetes não tratada, a glicose em excesso na corrente sanguínea não consegue passar para o meio intracelular devido à falta de insulina; deste modo, não ocorre a metabolização de glicose levando a uma diminuição de energia. Outro factor que contribui para a polifagia é a teoria glicostática, que defende que os sensores da glicose estão localizados no hipotálamo e que os níveis de glicose são detetados por estes sensores. Deste modo, redução da metabolização e utilização de glicose desencadeia um sinal nas regiões glicossensitivas que leva à perceção e expressão do apetite (Chaput e Tremblay, 2009; Pimentel et al., 2013).

Ao longo do protocolo experimental, verificou-se que os animais diabéticos, embora ingerissem mais comida e água, perderam peso relativamente aos animais controlo que, por sua vez, ganharam peso. Esta diminuição de massa dos animais diabéticos deve-se à incapacidade das células utilizarem glicose para a produção de energia, ocorrendo a ativação da via gliconeogénica. Assim, ocorre a catabolização de proteínas e gorduras dos tecidos adiposos para produzir energia pela gliconeogénese. A desidratação, provocada pela diurese osmótica, contribui também para a perda de peso dos animais diabéticos (Punithavathi et al., 2008; Okon et al., 2012).

Neste trabalho foram implantados subcutaneamente membranas de colagénio tipo I. Este biomaterial possui as características necessárias para ser utilizado na regeneração guiada de tecidos (RGT) em implantes dentários e é já um dos materiais mais utilizados para esta terapia uma vez que é bastante biocompatível, não provoca uma resposta inflamatória exagerada por parte do hospedeiro e a inflamação dura poucos dias, depois dos quais o organismo aceita o biomaterial como parte dele; é bioabsorvível, o que permite, no caso da RGT, que à medida que o tecido cicatriza, o biomaterial se degrade até que desaparece completamente, não sendo assim necessária uma cirurgia para remover o biomaterial (Bozkurt

et al., 2014).

A implantação subcutânea de biomateriais é mais vantajosa, no que diz respeito à avaliação da biocompatibilidade, do que a implantação em outros locais. O procedimento é simples, permite uma comparação da resposta do tecido no mesmo animal e não requer uma área de grandes dimensões nos animais (Neto et al., 2008).

A biocompatilidade aos biomateriais pode ser otimizada de forma relevante através do controlo da resposta imune. Desta forma, a caraterização da resposta imune, nomeadamente as células envolvidas, citocinas e anticorpos pode ser fundamental para a otimização deste processo.

Da avaliação do número total de células inflamatórias, verificou-se que este estava diminuído nos animais diabéticos, quer nos animais sacrificados às 48h quer nos animais sacrificados às 3 semanas, comparativamente com os animais controlo. A diminuição do número de células inflamatórias na resposta imune aos biomateriais também já foi descrito por outros autores, em trabalhos que avaliaram a resposta imune a outros biomateriais (Bitar

et al., 1999; Zambuzzi et al., 2006; Socarrás et al., 2010). A diabetes promove uma mudança

no metabolismo dos animais que influencia a função dos mastócitos afetando assim a reação inflamatória uma vez que os mastócitos estão envolvidos na libertação de histamina, que dilata os vasos sanguíneos no local da implantação e que permite a migração de células inflamatórias para o local lesado (Bitar et al., 1999).

Os neutrófilos são responsáveis pela produção de citocinas, quimiocinas e outras proteínas capazes de recrutar, e ativar outras células inflamatórias. Foi demonstrado que a hiperglicemia crónica afeta negativamente a função dos neutrófilos podendo influenciar o recrutamento das restantes células inflamatórias, atrasando assim a resposta inflamatória em animais diabéticos (Maciel et al., 2013).

Os grupos de animais sacrificados às 3 semanas apresentaram número total de células mais baixo do que os animais das 48 horas. Outros trabalhos realizados obtiveram resultados semelhantes (Veríssimo et al., 2010). O colagénio já provou ser um material bastante biocompatível pois não provoca uma resposta exagerada por parte do hospedeiro. A extensão e a duração da inflamação depende da natureza do material implantado. Assim, é aceitável que, às 3 semanas, não se verifique uma resposta inflamatória aguda, mas o início da resposta inflamatória crónica com um número de células inflamatórias total inferior aos grupos das 48 horas uma vez que, devido à elevada biocompatibilidade do colagénio, às 3 semanas o organismo está já a aceitar o biomaterial como parte dele próprio, não havendo assim um infiltrado inflamatório tão acentuado. Neste trabalho, a reação inflamatória aguda é de curta duração, o que vai de encontro aos trabalhos de Macleod et al. (2005) e Engelhardt et al. (2011).

Nos grupos CTR 48h e DM 48h verificou-se um infiltrado inflamatório característico de uma reação inflamatória de fase aguda. Nestes grupos observou-se um número elevado de neutrófilos e um número menor de linfócitos, plasmócitos e macrófagos. Os neutrófilos em circulação são rapidamente recrutados para o local da lesão, atuando como a primeira linha de defesa. Deste modo, os neutrófilos estão presentes em maior número nas primeiras 48 horas após a implantação do biomaterial. No entanto, com o decorrer do tempo, e à medida que a reação inflamatória aguda dá lugar a inflamação crónica, a percentagem de neutrófilos diminui e os linfócitos tornam-se as células predominantes. Às 3 semanas é possível verificar um aumento de macrófagos relativamente aos grupos sacrificados às 48 horas. Segundo a literatura, durante a reação inflamatória crónica existe um maior numero de macrófagos, que são células características desta fase. Os neutrófilos estão em maior percentagem nos grupos DM relativamente aos animais CTR, o que demonstra uma persistência da reação aguda nos animais diabéticos e consequentemente um atraso na resposta crónica, o que pode justificar o facto de nos grupos DM das 3 semanas ainda se verificar uma elevada percentagem de neutrófilos e uma baixa percentagem de macrófagos em relação aos animais CTR (Socarrás et

al., 2014). Existem vários fatores que influenciam o atraso na cicatrização em condições

diabéticas como a hiperglicemia e a ausência de insulina (Rubinstein et al. 2008). Esta hormona promove a proliferação de fibroblastos, que são responsáveis pela regeneração do tecido, e assim, a ausência de insulina vai dificultar o processo de regeneração e cicatrização do tecido prolongando a inflamação (Monaco et al., 2009). A hiperglicemia crónica pode levar à glicação não enzimática do colagénio gerando produtos finais da glicação que reduzem

a solubilidade da matriz extracelular; consequentemente, as alterações inflamatórias observadas em condições diabéticas mantêm-se (Pradhan et al., 2009).

Relativamente ao peso dos órgãos recolhidos, verificou-se que os baços dos animais DM estavam diminuídos comparativamente aos baços dos animais CTR. Este resultado deve- se ao efeito imunossupressor do STZ, comprovado por diversos autores (Muller et al., 2011; Diab et al., 2015). O STZ é tóxico para os linfócitos provocando leucopenia nos animais tratados com este antibiótico, uma vez que se verificou induzir apoptose in vitro e é responsável pelo esgotamento precoce de linfócitos no sangue e baço in vivo. Este agente diabetogénico também inibe a proliferação dos linfócitos, o que contribui para a diminuição desta população. Deste modo, o efeito imunosupressor do STZ também pode justificar a leucopenia encontrada nos animais DM relativamente aos animais CTR (Muller et al., 2011).

A resposta imune adaptativa é mediada pelos linfócitos (células T e B) e os seus produtos, nomeadamente citocinas e anticorpos. A interação entre estas células e o biomaterial foi considerada prejudicial para o implante durante vários anos; no entanto, estudos recentes demonstram que as respostas específicas destas células podem favorecer a integração do biomaterial nos tecidos envolventes e melhorar o seu desempenho (Matesanz et

al., 2014). Desta forma, para caracterizarmos melhor a resposta imune em condições

diabéticas, analisámos a expressão de três marcadores específicos: o CD3, específico para linfócitos T, BLA e CD79, específicos para linfócitos B. Observámos que o número de linfócitos T foram sempre superiores nas condições controlo. Matesanz e colaboradores (2014) realizaram contagens das células marcadas em 30 campos por cada grupo com objetiva de 40x. Seguidamente foi calculada a percentagem de área marcada e verificou-se que existe uma maior percentagem de linfócitos T nos grupos controlo. Estes resultados estão de acordo com o observado no nosso trabalho. Uma das explicações possíveis é o facto de os animais diabéticos apresentarem uma percentagem mais baixa de células T, uma vez que elevadas concentrações de glicose e a ausência de insulina verificada na diabetes tipo 1, leva a uma diminuição da proliferação dos linfócitos T (Sakowicz-Burkiewicz et al., 2006; Matesanz et

al., 2014).

Também quisemos averiguar a relação entre o número de linfócitos T e B, e tentar perceber de que forma estas células se comportam na condição diabética. Quando comparámos diretamente o número de células positivas ao CD3, com as positivas ao BLA e