As soluções de amostras contendo bixina apresentam diferentes comportamentos no que se refere à instabilidade de leitura espectrofotométrica. As amostras submetidas à hidrólise em solução alcalina, se agitadas antes da determinação espectrofotométrica apresentam leitura oscilante. Este comportamento não se observa para a solução em clorofórmio. As soluções alcalinas, ainda que totalmente cristalinas, quando observadas no balão, logo após enérgica agitação, mostram variações na cor da solução, aparentando a presença de um componente de coloração amarela mais intensa difundindo-se através da solução. Isto porém desaparece, minutos após a agitação, repetindo contudo a qualquer momento que se proceda a nova agitação. Suspeitou-se da presença de oxigênio incorporado durante o processo de agitação, favorecendo a formação de um composto intermediário que imediatamente era incorporado à solução. Neste sentido, uma série de ensaios foi realizada com o propósito de investigar a participação do oxigênio neste processo.
Influência do oxigênio.
Esta série de ensaio teve como objetivo avaliar amostras de mesma origem, submetidas à solução de hidróxido de sódio 0,5 N, porém tomando-se o cuidado de avaliar a interferência do oxigênio durante o processo de solubilização. É importante destacar que nestes ensaios não foram feitas determinações do percentual de bixina, pois nesta prévia, apenas a visualização do espectro poderia acusar presença de outros compostos, o que poderia caracterizar a esperada interferência. Empregou-se como amostra o pigmento removido da semente após cinco lavagens com etanol/hexano 1/1 e 6 ciclos com hexano. Foram processadas quatro amostras como segue:
A - Pigmento extraído com solução de hidróxido de sódio sem aeração;
B-Pigmento extraído com solução de hidróxido de sódio e efetuando-se aeração da solução final por 10 min;
C-Pigmento extraído com solução de hidróxido de sódio previamente desaerada*; D - Pigmento extraído com solução Etanol/água / amônia 40/57/3.
Tabela 26 - Bandas de absorção e valores de absorbância de amostras acompanhadas sob efeito de aeração. λ (nm) 481.0 453 345 273.5 270.5 238 217.5 218.5 Amostras A 0.476 0.551 0.112 0.282 B 1.233 1.411 0.282 0.316 0.371 0.517 C 0.310 .077 0.077 0.241 D 0.958 1.089 0.154 0.429 Branco 0.184 0.184
a) * solução de hidróxido de sódio submetida ao aquecimento e mantida sob vácuo por 30 min.
b) Todas as diluições foram feitas com solução de hidróxido de sódio desaerada c) os experimentos foram realizados sem proteção dos efeitos de luz.
Observa-se na Tabela 26 que:
Todas as soluções, com exceção da amoniacal apresentam absorção em 217,5 nm, porém com maior intensidade de absorção que o branco, sugerindo alguma interação com o solvente;
A intensidade de absorção se acentua, tanto maior quanto maior a concentração de bixina (picos de absorção em 481,0 nm e 453 nm);
Observa-se também que quanto mais aerada maior o aparecimento de outras bandas de absorção, sugerindo a formação de outros compostos;
A amostra com solução de hidróxido de sódio previamente desaerada mostra uma menor intensidade no pico em 273,5 nm, também presente na amostra 1;
O experimento 2 apresenta picos inexistentes nos outros ensaios com solução de hidróxido de sódio, provavelmente decorrentes de processos oxidativos.
O comportamento de instabilidade de leitura também foi observado, da mesma forma que o surgimento de regiões de difusão de cor na solução, ainda que com menor intensidade. A presença na amostra, de alguns compostos lipossolúveis que não foram eliminados adequadamente durante o processo de lavagem com solvente, ainda que em quantidade reduzida, podem ser responsáveis pelo fenômeno observado, se estes apresentarem reduzida solubilidade na solução alcalina. Se ao contrário, os mesmos compostos forem totalmente solúveis no clorofórmio isto explicaria a estabilidade de leitura neste solvente.
4.10 ACOMPANHAMENTO DA ESTABILIDADE DA BIXINA EM
ETANOL
Na Tabela 27 são apresentados os valores de leitura espectrofotométricas de soluções provenientes dos ciclos de extração do experimento 3, monitoradas ao longo de sete meses de estocagem.
Tabela 27 - Acompanhamento da absorbância das soluções com tempo de estocagem.
Ciclos Tempo (dias)
1 9 15 34 50 80 130 200 1 2,713 2,731 2,715 2,712 2,712 2,734 2,707 2,645 2 2,622 2,635 2,645 2,620 2,622 2,660 2,659 2,582 4 2,582 2,614 2,604 2,600 2,622 2,616 2,618 2,563 5 2,546 2,575 2,585 2,488 2,582 2,590 2,596 2,527 6 2,546 2,575 2,585 2,545 2,522 2,531 2,536 2,544 7 * 2,575 2,566 2,563 2,522 2,535 2,502 2,478 8 * 2,594 2,566 2,563 2,552 2,556 2,546 2,563
Obs.: Ausência do terceiro ciclo devido à perda da solução após a extração.
*não disponível no primeiro dia, leitura efetuada no segundo dia de extração (conseqüentemente os tempos referentes a estas amostras estão defasados de 1 dia).
Os valores de absorbância apresentados referem-se à leitura das amostras em repouso após agitação por aproximadamente 5 segundos, visto que sua leitura efetuada após a transferência para cubeta apresentava valores oscilantes e com redução de 20 a 30 milésimos de unidades de absorbância.
O acompanhamento das soluções de bixina em etanol, empregando as amostras provenientes dos ciclos de extração teve como propósito verificar se os outros componentes presentes nas sementes trariam alguma contribuição, no sentido de favorecer a estabilização da bixina durante o período de estocagem. As soluções provenientes dos ciclos de extração apresentam crescentes concentrações de bixina e decrescente teores de outros componentes, ver Tabela 19, experimento 3. Enquanto o extrato sólido proveniente do primeiro ciclo apresenta apenas 5,65 % de bixina, aquele obtido do oitavo ciclo apresenta 52,43 %. Contudo, isto não resultou em mudanças nas absorbâncias. Apesar de todos os valores terem apresentado queda, as leituras determinadas após 200 dias de avaliação corresponderam a números que oscilaram de 96,23 % a 99,92 % daqueles iniciais. Contudo, sem nenhuma
correspondência com o maior ou menor teor de bixina ou dos outros compostos presentes no extrato. Por outro lado, a ausência de uma solução preparada com bixina pura, isenta dos outros componentes, impossibilita fazer qualquer afirmação que relacione alguma possível contribuição na conservação da bixina. O percentual dos outros componentes, presentes na solução do oitavo ciclo é ainda elevado, desta forma pode ter contribuído para os valores encontrados.
Os elevados valores de absorbância encontrados e as oscilações durante a leitura impedem um monitoramento mais preciso. A avaliação da estabilidade pode ser mais evidente em condições de maior diluição. Desta forma, seria conveniente diluir as amostras anteriormente à estocagem. Por outro lado, a diluição da alíquota na ocasião da medida não permitiria uma avaliação acurada, pois teríamos um provável efeito positivo da concentração na estabilização da amostra. Ainda assim, os valores observados sugerem que, a estocagem da bixina em solução alcoólica é mais conveniente do que em clorofórmio. Os padrões mantidos durante uma semana em clorofórmio tinham que ser descartados visto que perdiam rapidamente seu teor original. Entretanto, a baixa solubilidade da bixina em etanol comparada ao clorofórmio, traz dificuldades a sua aplicação.