PREPARAÇÃO DA COLUNA

a) Dispersão da sílica em hexano e agitação no ultra-som, com posterior transferência da suspensão para a coluna parcialmente preenchida com solvente;

b) Preenchimento da coluna com a sílica, remoção do ar contido nos poros, submetendo à vácuo a extremidade superior e posterior alimentação do solvente, pela mesma extremidade. Este procedimento conduz a uma classificação natural do adsorvente favorecendo a distribuição das partículas menores na região superior da coluna, promovida pelo fluxo ascendente do ar durante o processo para sua remoção. Isto, em conseqüência, tende a criar um empacotamento com diferente adensamento;

c) Procedimento semelhante ao segundo, porém efetuando vácuo pela parte inferior e alimentação do solvente pelo topo da coluna. Este procedimento levou a obtenção de empacotamento mais homogêneo e de maior densidade, particularmente quando comparado ao primeiro.

Preenchimento com fase estacionária

Com a finalidade de reter e suportar o adsorvente coloca-se uma fina tela de nylon e um papel de filtro na base da coluna. Fechada esta extremidade transfere-se 2,75g (coluna de menor diâmetro) ou 10,00g (coluna de maior diâmetro) de adsorvente através de um funil colocado em sua extremidade superior. Esta operação é efetuada com alimentação em pequenas porções, de forma contínua e sob vibração, conseguida por batimentos com um bastão de vidro tendo em sua extremidade uma rolha de borracha. Após total transferência da sílica, introduz-se um bastão de vidro de diâmetro externo próximo ao diâmetro da coluna. Batendo-se no topo do bastão por cerca de 5 minutos, para auxiliar no processo de compactação. Retira-se o bastão e mede-se a altura resultante da coluna.

Empregando duas pinças, fecham-se as extremidades da coluna com mangueira de silicone. Submete-se à vácuo a coluna, através da extremidade inferior. A seguir, fecha-se esta extremidade com a pinça de Hoffman e desconecta-se da bomba de vácuo. Através da mangueira de silicone, conecta-se uma bureta à extremidade superior que é mantida fechada com outra pinça. Na seqüência, abre-se a torneira da bureta e a seguir a pinça, transferindo-se cerca de 4,5 mL (coluna de menor diâmetro) ou 20 mL de hexano (coluna de maior diâmetro) para o interior da coluna. A pressão reduzida no interior desta permite que o solvente preencha os poros do leito. Desconecta-se a bureta, removendo o tubo de silicone.

Quando a coluna líquida através do leito alcança a proximidade da base da coluna, acopla-se ao tubo de silicone conectado a parte inferior, uma seringa e só então se abre a pinça nele acoplado. Empregando-se a seringa, aplica-se uma suave sucção para permitir total preenchimento do leito, o que se observa pelo aparecimento de solvente no tubo de silicone, situado imediatamente abaixo do duto de conexão da coluna. Mede-se então o nível final de solvente acima do topo do leito de sílica, deduzindo este volume do total transferido para a coluna. Conhecido o volume dos poros como também o volume do duto de conexão da coluna à válvula do coletor de frações é possível determinar o correspondente volume de coluna (VC).

Após o procedimento anterior, remove-se o conector ligado a parte inferior da coluna, colocando em seu lugar a válvula de restrição (f) esquematizada em corte na Figura 18. Esta permite controlar o fluxo através da coluna. A seguir, conecta-se a outra extremidade da válvula ao coletor de frações.

Pré-ajuste de vazão da coluna

Após o preenchimento da coluna com massa de adsorvente equivalente àquela que estará associada à amostra, alimenta-se a coluna com a solução eluente em estudo. Em seguida ajusta-se a pressão do nitrogênio monitorando a altura manométrica da coluna de mercúrio, até ser conseguida uma vazão de eluente, próximo de 2mL/min. Havendo impossibilidade de atendimento da vazão requerida, aumenta-se ou diminuía-se a restrição na válvula (f) situada na saída da coluna, pelo ajuste da compressão da mola interna, de forma a aumentar ou diminuir a perda de carga. Uma vez atingida esta vazão, registrava-se o valor de pressão manométrica, de forma a reproduzir esta vazão nos experimentos posteriores, elaborados com a amostra a ser processada.

Preparação da amostra

Considerando a reduzida solubilidade da bixina e também no sentido de evitar alargamento das bandas, como conseqüência de sobrecarga de amostra na coluna, utilizou-se massa reduzida de amostra, na ordem de 0,2 mg. Ainda, para permitir melhor homogeneização e perfeita distribuição da amostra sobre a coluna, determinou-se previamente a capacidade máxima de saturação da sílica pela bixina proveniente de uma solução em clorofórmio. Neste sentido, evitava-se adicionar bixina além do limite de (1,4mg de bixina)/(g de sílica), valor de saturação determinado.

Após a análise do teor de bixina da solução, determinada segundo a metodologia II, Seção (3.9.1), transfere-se um volume preciso para um frasco de vidro, contendo 38,5 mg (coluna de menor diâmetro) ou 140 mg (para coluna de maior diâmetro) de sílica dispersa em 1,0 mL de clorofórmio. Fecha-se o frasco com uma rolha de borracha, sendo introduzido previamente através desta uma agulha, em cuja extremidade foi colocada uma pequena porção de algodão. Efetua-se vácuo até total eliminação do solvente. Terminada a operação observa- se o algodão para constatar a ausência de partículas arrastadas. Se positivo, transfere-se esta sílica para a coluna já preparada, cujo solvente situa-se um pouco acima do leito da coluna. Sobre a amostra depositada, coloca-se uma pequena porção de sílica, (também mantida inundada no solvente presente na coluna). Depois de removido o excedente de solvente acima da sílica, fecha-se a extremidade superior da coluna, acoplando-se a esta a tubulação de alimentação de fase eluente.

Frações coletadas da coluna flash

Para cada fase eluente de diferente polaridade elaborou-se uma curva de calibração. Volumes precisos de uma solução recém analisada de bixina foram transferidos para balões volumétricos e sob vácuo, o solvente era eliminado. Posteriormente re-dissolvia-se com o solvente correspondente a nova fase e fazia-se a varredura espectrofotométrica da solução. Identificado o pico da bixina, efetuava-se neste comprimento de onda a leitura das soluções que compunham a curva.

Percolação da coluna

Com o coletor de frações conectado ao conjunto e programado para coleta de 180 gotas por tubo, coloca-se a fase eluente no vaso de pressão e injeta-se nitrogênio no sistema. Com a válvula de restrição previamente ajustada, manipulações consecutivas na válvula do cilindro de nitrogênio permitem que a vazão através da coluna rapidamente entre em regime. Este ajuste se faz necessário devido à acomodação da coluna sob efeito da pressão aplicada ao leito. Para evitar erros nas variações da vazão durante a “corrida”, mede-se o volume de cada fração, empregando-se para tal um calibrador.

Realimentação do vaso de pressão

Havendo necessidade de realimentar a fase eluente fecha-se primeiro a válvula (4) situada logo abaixo da válvula de restrição (f), depois aquela imediatamente anterior à entrada coluna. Assim procedendo preserva-se a compactação do leito evitando despressurização da

coluna (a). Reduz-se a pressão do vaso (c), aliviando primeiro a válvula (1) reguladora de pressão do cilindro de nitrogênio (h). Faz-se o abastecimento com fase eluente. Pressuriza-se novamente o vaso (c) com a mesma pressão antes aplicada. Abre-se a válvula (3) de alimentação da coluna. Verifica-se se a pressão na coluna de mercúrio fora mantida inalterada. Só então se abre a válvula (4 ) de saída da coluna. Se a pressão da coluna sofrer um leve incremento abre-se levemente a válvula de dreno (2) e reajusta-se a pressão do cilindro. Na situação inversa aplica-se pequeno incremento na pressão do sistema.

Análise das frações

Para cada fração corada coletada, mede-se outra vez o volume no ato da análise corrigindo-se assim o efeito de evaporação ocorrida no intervalo de tempo entre a coleta e a análise. Quando há necessidade de diluição, esta é feita com o mesmo solvente empregado na eluição. Com a leitura da absorbância, determina-se a concentração contra a curva de calibração.

Para cada corrida foram elaborados os gráficos do volume percolado contra a concentração de bixina das correspondentes frações. Após integrar a massa de todas as frações associadas aos correspondentes volumes percolados, obtiveram-se os cromatogramas. Comparava-se ainda, a massa integrada àquela massa inicialmente colocada na coluna, procurando assim fechar um balanço de massa através da coluna.

Avaliação das frações por cromatografia em camada delgada TLC

Frações coletadas na cromatografia flash obtidas de fases móveis de diferentes relações de solventes foram reservadas para análise dos tempos de retenção pela técnica de TLC. A Tabela 10apresenta as composições e os respectivos valores de polaridade das fases móveis empregadas na cromatografia flash e em camada delgada (TLC).

Tabela 10 - composição das fases móveis e suas polaridades Solventes ( % ) Índice de polaridade P

Acetato de etila hexano mistura

90 10 3,87 80 20 3,45 70 30 3,03 60 40 2,06 50 50 2,18 40 60 1,75 30 70 1,33

Índice de polaridade: hexano 0,06; acetato de etila, 4,3. Ref. Snyder, Kirkland, J. J., (1979).