METODOLOGIA ANALÍTICA

3.9.1 ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA

As análises espectrofotométricas foram realizadas com base em dois métodos:

O método da hidrólise alcalina, com base no método segundo Kato et al., (1992) e o outro embasado em Yabiru e Takahashi, (1992), que emprega clorofórmio como solvente. Estas metodologias serão aqui referenciadas como metodologia I e metodologia II, respectivamente.

- Metodologia I - via hidrólise alcalina

Para determinação do teor de bixina foi feita uma adaptação do método descrito por KATO et al. (1992), pois, neste trabalho, as quantidades de bixina presentes em solução eram freqüentemente reduzidas, dificultando a determinação das massas com precisão. Sendo assim, volumes de amostras que podiam variar de 5 a 50 mL foram coletados para determinação da massa de extrato sólido. Paralelamente, alíquotas de 20 a 500µL das soluções foram coletadas com micropipeta e transferidas para balões de 100mL. Depois de eliminado o solvente, sob vácuo e/ou pela passagem de nitrogênio, adicionava-se ao balão solução de NaOH 0,5N com posterior aquecimento em banho-maria (40o C) e sob agitação por 30 min, em cuba de ultra-som, de forma a facilitar a hidrolise da bixina. Resfriado à temperatura ambiente completava-se o conteúdo do balão com a mesma solução alcalina, procedendo-se em seguida à leitura espectrofotométrica, no comprimento de onda de 482 nm.

Com os dados de massa de extrato seco e o valor de absorbância determinava-se a concentração da amostra pela aplicação da Equação: (1) que tem base na lei de Beer.

i i c % d V d m E V A X ₁ 1 1 ⋅ × × = (48) onde: X = % de bixina (g/ 100g de amostra); m = massa da amostra (g);

V = volume inicial de extração (mL); Vi = volume de diluição (mL);

di = volume da alíquota para a diluição; (mL);

A = absorbância lida no comprimento de onda de 482 nm;

% 1 cm 1 E = coeficiente de absortividade (2870); dc = caminho ótico da célula (1,0 cm).

Para converter o resultado obtido em percentual de bixina, multiplica-se pelo fator 1,076.

- Metodologia II - via clorofórmio

As análises espectrofotométricas das amostras e padrão solubilizados em clorofórmio foram adotadas no presente trabalho como metodologia para análise de controle do teor de bixina, em substituição ao método (Kato et al, 1992). As leituras foram determinadas a 501

nm e 471 nm, região do espectro onde apresentavam picos de máxima absorção. Foi utilizado para análise da bixina, o valor 3230 (471nm), citado por Reith e Gielen, (1971), sendo assumido deste modo como estando o composto na forma de cis-bixina.

% cm

1 1

ε

A metodologia aqui empregada, usando clorofórmio como solvente foi adaptada da técnica descrita por Yabiku e Takahashi (1992). Na metodologia original, as sementes são trituradas. Contudo, por se tratar de extrato, o procedimento adotado neste trabalho emprega a massa de extrato sólido, ou alíquota da solução da qual o solvente é previamente eliminado. Para determinação da massa de extrato seco foi aplicado o procedimento descrito na seção (3.9.2). As alíquotas contendo baixa concentração e reduzido volume de amostra foram analisadas por comparação a uma curva de calibração, esta elaborada com clorofórmio como solvente ou hidróxido de sódio, neste caso quando da adoção da metodologia por hidrólise. Este procedimento analítico foi denominado-Variante.

O procedimento de cálculo para determinação do percentual de bixina fez uso da equação (1) da seção anterior, procedendo à leitura espectrofotométrica no comprimento de onda de 471nm, e substituindo-se o valor do coeficiente de absortividade por 3230.

Na determinação espectrofotométrica de amostras (sólidas), estas eram pesadas diretamente no balão volumétrico; acrescentava-se o clorofórmio e após agitação em banho ultra-sônico, aguardava-se o resfriamento para, só então, “aferir” o balão. Para proceder à diluição, colocava-se em outro balão volumétrico, um pouco de solvente, sobre o qual a alíquota era transferia com o auxílio de uma micropipeta. Depois de drenada a ponteira, secava-se a parte externa com um papel umedecido no solvente. Na seqüência lavava-se o interior da ponteira com solvente, transferindo a solução de limpeza para dentro do balão completando-se então o volume com o restante do solvente até a aferição.

Variante para pequenos volumes de amostras

Para amostras com baixa concentração e volume insuficiente para determinação da massa de extrato seco, procedia-se à leitura espectrofotométrica e com o valor da absorbância obtido, determinava-se a concentração da amostra pelo confronto com uma curva de calibração elaborada com o mesmo solvente diluente da amostra e preparada com um padrão de concentração conhecida. Esta metodologia foi empregada tanto para amostras procedentes de soluções aquosas quanto para aquelas provenientes de solventes orgânicos. Amostras contidas em solventes orgânicos eram previamente secas sob vácuo e posteriormente

dissolvidas em solução de NaOH, quando adotada a metodologia I, seção (3.9.1), ou em clorofórmio no caso da adoção da metodologia II.

3.9.2 DETERMINAÇÃO DA MASSA DO EXTRATO SECO

Para determinação da massa do extrato seco (ES), um volume preciso da solução (10 a 50 mL), coletado com pipeta volumétrica, era transferido para uma placa petri/ou Becker (pré- tarados) e colocados na estufa a 60o C até total evaporação do solvente. Após estabilização da temperatura, em dessecador, determinava-se a massa de extrato seco. Para volumes acima de 10 mL as secagens foram efetuadas em Becker de 100mL.

Procedimento para coleta de amostra em solvente volátil.

Visto ser crítica a relação volume/massa de amostra na determinação do teor de bixina, cuidados especiais foram tomados no sentido de aumentar a precisão na coleta. Quando da coleta de solução com micropipeta, as ponteiras eram sempre enxaguadas, com a própria solução, no sentido de transferir totalmente o conteúdo residual retido nas paredes internas da ponteira.

Naquelas amostras cuja concentração de bixina era muito reduzida, ou ainda quando se usava solvente com elevada pressão de vapor, o emprego de pipeta volumétrica como também as micropipetas automáticas tornava-se impraticável, pois era impossível manter o fluido nestes dispositivos sem que houvesse expulsão de gotas de solução, o que acarretava erro de medida. Para este propósito foi adaptada uma bureta, cuja extremidade era constituída de uma coluna graduada com reduzida secção interna, conforme ilustra a Figura 15. Utilizando-se as duas escalas da bureta foi possível coletar, por transferência, volumes precisos, como aqueles necessários à espectrofotometria, ou mesmo volumes maiores para a determinação do extrato seco. A extremidade inferior, abaixo da torneira, era enxaguada internamente com o solvente, antes e após a transferência da alíquota.

Figura 15 – Conjunto para coleta de amostra volátil.

3.10 ACOMPANHAMENTO ESPECTROFOTOMÉTRICO NO CURSO DA