INTERAÇÕES ENTRE AS INTEGRINAS E OS COMPONENTES DA MATRIZ EXTRACELULAR

Dentre as integrinas mais estudadas, destacam-se a α2β1 que se adere

principalmente ao colágeno e laminina, α3β1 que se liga mais a laminina e epiligrina, e

α5β1 que apresenta uma maior especificidade a fibronectina (JENSEN, WHEELOCK,

Grundström et al (2003) referiram que quatro integrinas apresentam ligação intersticial ao colágeno, que são α1β1, α2β1, α10β1 e α11β1. Emsley et al (2004) relataram

que o colágeno contém sítios de ligação específicos para as integrinas anteriormente referidas. Segundos estes autores, estas interações exercem um papel importante em diversas funções celulares, incluindo, adesão, disseminação, migração, divisão e expressão de diferentes fenótipos celulares. Adicionalmente, a desregulação das interações célula-proteínas da matriz extracelular está implicada no desenvolvimento de alguns processos patológicos como a trombose, crescimento tumoral e metástase.

De acordo com Heino (2000) e Haier e Nicolson (2001), a integrina α2β1 é

expressa em vários tipos celulares, incluindo plaquetas, células epiteliais, fibroblastos, osteoblastos, condrócitos, células endoteliais, linfócitos e também células tumorais. Esta integrina serve como receptor de ligação ao colágeno ou laminina. Segundo estes autores, a ativação da integrina α2β1 pode ser acompanhada pela ligação de proteínas

regulatórias ao domínio citoplasmático da integrina, que resulta em alterações conformacionais que permitem alta afinidade de ligação ao colágeno.

Ha-Chung, Wu e Huang (2004) referiram que, uma vez que as integrinas α1β1 e

α2β1 promovem migração celular, proliferação e reorganização da matriz extracelular,

seria possível que a ativação destas esteja envolvida também nos processos angiogênicos.

Segundo relatos de Darribère et al (2000), a perda da integrina α3β1 afeta a

organização da membrana basal epidérmica, observando-se em conseqüência disto uma descontinuidade ultraestrutural e desgarramento celular, uma vez que a α3 pode

dimerizar com a subunidade β1 para formar um receptor para a laminina e entactina.

Segundo estes autores, a ausência desta integrina ou de outras associadas à subunidade β1 afetam tanto na formação quanto na manutenção das membranas basais.

Hemler e Rutishauser (2000) enfatizaram que a integrina α3β1 atua não apenas

como receptor de membrana basal, mas também como organizadora da matriz extracelular e moduladora na migração celular, na organização do citoesqueleto e na

produção de metaloproteinases. Os autores ressaltaram ainda que estas funções são efetuadas com a ligação da integrina α3β1 com outras proteínas transmembrana além da

laminina.

Labat-Robert (2002) ressaltaram que a α5β1 é uma integrina amplamente

difundida entre os tecidos e está envolvida na deposição ativa da fibronectina na matriz extracelular pericelular, bem como na remodelação da mesma, exercendo um importante papel no crescimento, migração e tumorigenicidade celulares. Sua expressão inativa os genes de proliferação celular, destacando-se o c-fos, c-jun e jun B, reduzindo destarte o crescimento das células e a tumorigenicidade conseqüentemente.

2.4.3. ESTUDOS AVANÇADOS COM AS INTEGRINAS α2β1, α3β1 E α5β1.

Vários estudos têm sido realizados com o intuito de esclarecer a participação das integrinas α2β1, α3β1 e α5β1 em diversas situações, desde eventos fisiológicos até a

possível participação das referidas integrinas em processos patológicos.

Blaschuk e Holland (1994) examinaram a expressão da integrina α5β1 durante o

crescimento e diferenciação de culturas de células musculares de bíceps humanos. O tratamento de algumas destas culturas com o BudR, um análogo da timidina que inibe a diferenciação das células musculares, resultou em um aumento na expressão da subunidade α5. Entretanto, houve uma redução na expressão da α5β1 quando, mesmo

acrescentando ao meio o BudR, foi retirado deste os fatores de crescimento, levando a crer que a expressão da α5β1 não é uma conseqüência da diferenciação terminal das

células musculares, mas é dependente da combinação destes fatores de crescimento exógenos que também são necessários para a diferenciação e proliferação das células musculares.

Jensen e Wheelock (1995) avaliaram o papel das integrinas α2β1 e α3β1 na

adesão celular em cultura de ceratinócitos humanos. Inicialmente foram dirigidos anticorpos contra os receptores das referidas integrinas para verificação dos efeitos na adesão celular. Observou-se que a α2β1 e α3β1 não apresentaram papel preponderante na

devido ao seu envolvimento significativo na motilidade celular. Adicionalmente foi verificado que as referidas integrinas foram susceptíveis à influência regulatória da E- caderina na adesão celular.

Becker e Schuppan (1995) investigaram a expressão imuno-histoquímica de proteínas da matriz extracelular, bem como das integrinas α2, α3, α4, α5, α6 e β4 em 14

espécimes de líquen plano, 5 de gengivas ortoceratinizadas e 4 hiperplasias fibrosas. As integrinas α2, α3 e α5 apresentaram expressão aumentada nas células epiteliais das

camadas suprabasais no líquen plano, bem como uma maior expressão das mesmas na região pericelular das células inflamatórias na lâmina própria. Entretanto, os autores não verificaram correlação entre a distribuição das proteínas da matriz extracelular e os seus receptores de integrinas. Segundo os referidos pesquisadores, a reação auto-imune no líquen plano pode não ser direcionada aos ceratinócitos orais, e sim a um antígeno desconhecido no tecido conjuntivo subjacente.

Nishimura et al (1998) verificaram a expressão imuno-histoquímica das integrinas α2, α3 e β4 em 9 casos de ceratocistos odontogênicos e em 6 casos de cistos

dentígeros. As integrinas α2 e α3 foram expressas em todas as camadas celulares nos

epitélios de revestimento cístico de ambas lesões. Nos epitélios de menor espessura, a expressão foi observada fortemente na camada basal, enquanto nas células suprabasais foi fraca ou esporádica. Segundo estes autores, a estratificação do epitélio pavimentoso depende do contato célula-célula que é mediado pela qualidade adesiva das integrinas α2 e α3. Logo, a perda de expressão destas integrinas aparentemente leva a uma redução

na adesão célula-célula e constante desgarramento das células superficiais, favorecendo, portanto a ceratinização dessas células e conseqüente descamação. Os autores concluíram desta maneira que a espessura epitelial dos cistos odontogênicos está relacionada à distribuição das integrinas e que estas moléculas exercem importante papel na regulação do espessamento epitelial.

Decline e Rousselle (2001) investigaram o papel da laminina-5 na migração dos ceratinócitos no processo de reparação de feridas através de cultura de células. Foi verificado que, os ceratinócitos migraram através da fibronectina e colágeno IV, necessitando para isto a deposição da laminina-5 recém-sintetizada. A respeito do papel

da laminina-5 na migração celular, observou-se que este processo é acompanhado por uma redução significativa na adesão a laminina-5 “selvagem”. Entretanto, a laminina-5 recém-sintetizada interage com a α3β1 tornando as células mais aderidas e retardando

desta forma a migração celular. Já a interação da laminina-5 com a α2β1 mostrou-se

essencial para a migração celular por toda extensão da laminina-5.

Bennett et al (2001) verificaram as diferenças na expressão das integrinas em diferentes e sucessivos estágios de uma linhagem osteoblástica oriunda da mandíbula humana. Em um grupo, as células cresceram na presença do EGF, dando um fenótipo proliferativo e menos diferenciado; em um outro grupo as células cresceram em um meio administrando vitamina D3 e hidrocortisona, resultando um fenótipo mais diferenciado; no terceiro grupo as células cresceram sem a administração de qualquer componente. A expressão da α5β1 esteve aumentada quando as células cresceram no

meio que favoreceu o fenótipo osteoblástico, sugerindo que a sinalização através do receptor para a α5β1 é mais importante quando necessita a diferenciação celular. A

subunidade α2 foi expressa em baixos níveis, tendo uma maior expressão quando o EGF

foi adicionado, sugerindo-se desta forma que a α2 se expressa em momentos precoces,

em tipos celulares em proliferação. A maior expressão da α3, principalmente nos

osteócitos, sugere um papel para esta subunidade como mediador de interações célula- matriz após a diferenciação osteoblástica. Esses resultados levam a crer que as células em sucessivos estágios de diferenciação exibem diferentes padrões de expressão das integrinas, os quais contribuem para a diferenciação osteoblástica.

De acordo com White et al (2003), experimentos em cultura de células com gel de colágeno que verificaram que as integrinas α1β1 e α2β1 apresentam efeitos distintos

nas células, onde a α1β1 tem sido associada à proliferação celular, enquanto a α2β1

esteve mais associada à regulação da remodelação da matriz extracelular. Adicionalmente, outros estudos indicam que altos níveis de expressão da integrina α2β1

na superfície das plaquetas aumenta o risco de acidente vascular cerebral e enfarte do miocárdio, além de ser verificado um aumento considerável também em um número variável de tumores malignos, dentre eles o melanoma.

Grundström et al (2003) avaliaram a interação da α2β1, devido a sua grande

especificidade de ligação ao colágeno, bem como de fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGF), nas atividades funcionais com o colágeno utilizando para isto cultura de células de linhagem fibroblástica (GD25). Foi verificado que as células que perdiam a expressão das subunidades α1 e α2 das integrinas não aderiram ao colágeno.

Entretanto verificou-se que quando adicionado ao meio o PDGF, houve estimulação para interação dos fibroblastos com o colágeno através da integrina αvβ3 quando a

função da β1 encontrava-se prejudicada, caracterizando, portanto, uma forma alternativa,

sob condição específica, de ligação celular ao colágeno.

Zhang et al (2003) analisaram a possibilidade de diferenciação glandular de um clone de células normais de intestino (Caco-2) em cultura de células, investigando o papel das integrinas α2 e α3 neste processo. Observou-se que, no grupo controle, as

células Caco-2 se diferenciaram e apresentaram um aumento na expressão da α3.

Entretanto, quando foram utilizados anticorpos monoclonais que bloquearam os efeitos das integrinas α2 e α3, não foi observada uma diferenciação glandular destas células,

reforçando, por conseguinte, o papel significativo destas integrinas no referido processo.

Kataoka et al (2003) investigaram a expressão da integrina α2 em meio de

cultura de fibroblastos oriundos da gengiva de ratos, sendo em seguida adicionada ao meio a ciclosporina em um grupo, e em um outro esta droga não foi administrada. A fagocitose colagênica, uma das formas de degradação do colágeno, foi medida in vitro, verificando-se que esta se apresentou sensivelmente reduzida no grupo submetido a ciclosporina. Adicionalmente, observou-se menor expressão da integrina α2 no grupo

tratado com ciclosporina. Concluiu-se desta maneira que um dos fatores implicados na inibição da fagocitose colagênica foi a diminuição da expressão da integrina α2 nos

fibroblastos gengivais.

DeHart, Healy e Jones (2003) pesquisaram se a α3β1 apresentava alguma

participação na organização estrutural das células nas membranas basais. Para isto foi investigado se esta integrina exerce alguma função na modelagem da laminina-5 na matriz extracelular de uma cultura de ceratinócitos oriunda da pele de ratos. Foram

divididos dois grupos, onde um destes constituiu-se de ceratinócitos “selvagens” e o outro de ceratinócitos com ausência da integrina α3. Foi verificado que os ceratinócitos

com a ausência da referida integrina apresentaram uma deficiente organização e remodelação à laminina-5, com as células exibindo uma reduzida capacidade organizacional na matriz extracelular, levando portanto à evidência de que a interação entre a α3β1 e a laminina-5 é um importante determinante para a adesão entre as células

epidérmicas e a membrana basal.

Andrade (2003) analisou a expressão imuno-histoquímica das integrinas α2β1,

α3β1 e α5β1 em ameloblastomas, tumores odontogênicos adenomatóides (TOAs) e

germes dentais fetais. Para isto, foram utilizados 30 ameloblastomas (20 sólidos e 10 unicísticos), 12 TOAs e 5 germes dentais fetais em diferentes fases da odontogênese. Foi verificada uma diferença estatisticamente significativa entre o ameloblastoma e o TOA e entre o ameloblastoma e os germes dentais fetais para a integrina α2β1 ; entre o

ameloblastoma e os germes dentais e entre o TOA e os germes dentais para a integrina α3β1; e entre o ameloblastoma e o TOA para integrina α5β1. Adicionalmente, não foi

identificado diferença na expressão das referidas integrinas entre as variantes do ameloblastoma. O autor concluiu que as variações observadas na expressão imuno- histoquímica das integrinas α2β1, α3β1 e α5β1 nas referidas entidades sugerem uma

possível influência das mesmas nos eventos celulares e nas interações célula-matriz nestas neoplasias e na odontogênese.

Modolo et al (2004) pesquisaram a intensidade e padrão de distribuição das integrinas α2, α3, α5, αv, β1, β3 e β4 em 14 espécimes de ameloblastoma, dos quais 4 eram

do subtipo folicular, 6 plexiformes, 2 acantomatosos e 2 unicísticos, e compararam a sua expressão com amostras de germe dentário, lâmina dentária e epitélio de mucosa oral. Todas as integrinas foram expressas em todos os casos estudados, especialmente nas células periféricas do ameloblastoma, sugerindo um importante papel destas na interação entre as células e a membrana basal. Observou-se que o germe dentário na fase de campânula apresentou forte marcação em padrão reticular para todas as integrinas, e todas as camadas do epitélio do órgão do esmalte foram positivas. A imunomarcação no epitélio interno do órgão do esmalte concentrou-se no pólo basal das

células, enquanto a papila dentária apresentou ausência de marcação para as referidas integrinas. Já na lâmina dentária, a distribuição reticular e fortemente positiva localizou- se na camada basal das células periféricas e por todo o citoplasma das células centrais. Adicionalmente, os autores verificaram que o ameloblastoma folicular, acantomatoso e unicístico exibiram padrão de expressão das integrinas semelhante ao epitélio de mucosa oral, enquanto a variante plexiforme foi similar ao germe e à lâmina dentária.

2.4.4. ESTUDOS COM AS INTEGRINAS α2β1, α3β1 E α5β1 EM NEOPLASIAS

MALIGNAS

De maneira geral, nos tumores humanos, as células neoplásicas apresentam as mesmas integrinas que os tecidos de origem, entretanto, em tumores pobremente diferenciados, ocorre a diminuição ou perda de expressão de algumas destas integrinas (VIRTANEN et al, 1990).

Jones et al (1993) avaliaram a distribuição das subunidades de integrina α2, α3,

α6, β1 e β4em epitélio normal, hiperplásico, displásico e em carcinoma de células

escamosas. Observou-se que a expressão destas integrinas foi maior na camada basal dos espécimes de epitélio normal, enquanto que no epitélio displásico e no hiperplásico adjacente a áreas de ulceração, a marcação nas camadas suprabasais esteve mais pronunciada. Com relação aos carcinomas de células escamosas, verificou-se que 13 dos 17 casos avaliados apresentaram perda de expressão da maioria das integrinas, sendo verificada inclusive esta perda em relação as integrinas α2 e α3. Os autores

concluíram que, uma vez que as integrinas regulam não apenas a adesão dos ceratinócitos, mas também a diferenciação dos mesmos, as alterações na expressão destas proteínas transmembrana podem apresentar papel relevante no comportamento individual dos tumores.

Dumont e Bitonti (1994) verificaram o papel da PMA, substância que é responsável pela fosforilação de algumas subunidades de integrinas, dentre estas a α1, α2

e α3, no processo de metástase, utilizando para isto uma linhagem de células de

melanoma metastático. Constatou-se que o tratamento com a referida substância proporcionou um aumento na fosforilação tanto da α3 quanto da α1, entretanto não

apresentou nenhum efeito na α2. Estes resultados sugerem que a fosforilação da α3β1

através da PMA pode explicar a facilitação de metástases através da ativação da proteinoquinase C (PKC).

Kosmehl et al (1995) pesquisaram a expressão de algumas proteínas da matriz extracelular (fibronectina, laminina e colágeno IV) e das integrinas α2β1, α6 e α5 em 25

espécimes de carcinomas de células escamosas orais e 6 espécimes de mucosa oral normal. Nos espécimes de mucosa normal verificou-se que a expressão das integrinas α2β1 e α6 esteve restrita às camadas basal e parabasal, enquanto a α5 expressou-se

descontinuamente na interface entre as células da camada basal e a membrana basal. As integrinas α2β1 e α6 também foram expressas nos carcinomas, onde foi verificada uma

expressão da α2β1 semelhante à mucosa normal nas lesões bem diferenciadas,

observando-se um aumento na expressão da α6 e uma redução na expressão da α5 nos

casos de carcinoma. Adicionalmente, constatou-se que a alta atividade proliferativa, verificada através da expressão do Ki-67, que esteve associada com uma redução na expressão das integrinas α2β1 e α6, levando os autores a concluir que há uma possível

participação destas integrinas na patogênese dos carcinomas.

Azuma et al (1996) avaliaram a expressão das integrinas α2, α3, α6 e β1 em

clones de células de glândula salivar normal, bem como nos tumores malignos das referidas glândulas. A marcação por imunofluorescência bem como a análise por “immunobloting” revelou que as subunidades α2 , α3 e α6 estiveram marcadamente

reduzidas nos clones de células metastáticas, enquanto que a subunidade β1 não

apresentou diferença significativa entre os grupos estudados. Entretanto, quando adicionado ao meio o TGF-β1, observou-se uma maior expressão da subunidade β1 nas

células normais. Os autores sugeriram que a redução da expressão das subunidades α2,

α3 e α6 teria uma relação inversamente proporcional com o grau de malignidade celular,

especialmente com a α2, e que o TGF-β1 é um fator regulador positivo na expressão da

subunidade β1 nas células normais mas não nos clones malignos.

Franchi et al. (1997) compararam o padrão de expressão imuno-histoquímico das integrinas α2, α3, α4, α5, α6 e αv em uma série de tumores benignos e malignos

expressas em todos os casos de tumores benignos, com a imunomarcação localizando-se não apenas na interface epitélio-mesênquima, mas também nos contatos célula-célula. A α5 esteve expressa em 76,9% dos casos, com distribuição preferencial nas áreas de

deposição de matriz (tanto condróide quanto mixóide). Quanto aos tumores malignos, a expressão da α2 e α3 foi observada em quase todos os casos, variando de focal a difusa,

exceto em um caso de carcinoma de células acinares, o qual apresentou metástase para linfonodos, e não exibiu marcação para as referidas integrinas.Quanto à α5, nenhum dos

casos dos carcinomas apresentou-se positivo. Os autores sugerem que a perda de expressão de algumas subunidades de integrinas , bem como a manutenção de algumas outras, pode ser uma etapa essencial para a sobrevida celular e também um favorecedor para um perfil proliferativo das células neoplásicas malignas.

Lundström et al (1998) verificaram os mecanismos moleculares envolvidos na adesão de uma linhagem de células malignas de mama à matriz óssea. Inicialmente foram direcionados anticorpos monoclonais contra as subunidades α2, α3 e α5

impedindo-as de se ligarem ao osso. Os autores verificaram que ao não se aderirem às integrinas, as células não proliferaram, sugerindo portanto que as integrinas, especialmente a α2β1 e α3β1, são essenciais para a adesão destas células malignas à

matriz óssea extracelular.

Thorup et al (1998) avaliaram a expressão imuno-histoquímica das integrinas α2β1, α3β1, α6β4 bem como da laminina-5 em 18 casos de carcinomas de células

escamosas, 21 casos de leucoplasias e 11 espécimes de mucosa oral com inflamação crônica. Verificou-se uma redução na expressão das integrinas α3β1 e α6β4 bem como da

laminina-5 no front invasivo dos carcinomas de células escamosas pobremente diferenciados, enquanto que houve um ligeiro aumento na expressão da α2β1 na referida

região. Nas leucoplasias e nas mucosas orais com inflamação observou-se também pequena redução na expressão da α3β1, α6β4 e laminina-5 nas células da camada

suprabasal. Os autores correlacionam a alteração de expressão das integrinas e da laminina-5 à condição patológica propriamente dita, inclusive nos casos associados à inflamação, cujas células epiteliais sofrem efeito dos produtos das células inflamatórias (proteases e citocinas).

Shaw (1999) relatou que a integrina α2β1 apresenta-se expressa normalmente nas

células luminais bem como nas células mioepiteliais de mama. Sua expressão é mantida em lesões benignas, como nos fibroadenomas e doenças fibrocísticas. Entretanto, sua expressão reduz sensivelmente com o estágio de diferenciação dos adenocarcinomas de mama. Especificamente as lesões pobremente diferenciadas expressam níveis baixos ou quase ausência de expressão da α2β1. Estes achados sugerem que a integrina α2β1 é

importante para a manutenção da diferenciação e controle da proliferação das células epiteliais da mama, e que sua perda de expressão é um importante determinante na progressão para um carcinoma invasivo.

Cai et al (2000) pesquisaram os efeitos do TGF-β1 na expressão da integrina

α5β1 em linhagens de células de carcinoma hepatocelular. Observou-se que houve uma

redução na expressão desta integrina em um grupo sem tratamento com o TGF-β1,

enquanto que no grupo submetido ao referido tratamento, houve um aumento na expressão desta integrina, inclusive nos níveis de RNAm da subunidade α5, estimulando

desta forma a adesão celular à fibronectina e laminina, e promovendo a migração celular, sugerindo portanto que o TGF-β1 pode regular o comportamento das células

tumorais através da sinalização mediada por integrinas, especialmente a α5β1.

Adachi et al (2000) avaliaram a expressão da integrina α5β1, através da imuno-

histoquímica e RT-PCR, em 20 linhagens celulares de câncer de pulmão e em 88 espécimes retirados de pacientes com câncer de pulmão que não apresentavam envolvimento linfonodal. Foi observado que dos 88 espécimes relatados, 44 (50%) apresentaram uma expressão mais intensa da integrina α5β1, e que essa superexpressão

esteve associada com o estágio de diferenciação e com a idade dos pacientes. Foi constatado ainda que os pacientes que apresentaram a superexpressão da referida integrina tiveram um índice de sobrevida significativamente inferior do que aqueles que não apresentaram. Os autores concluíram que a superexpressão da integrina α5β1 pode

ser um fator preditivo para um pior prognóstico nos pacientes com câncer de pulmão sem envolvimento linfonodal.

Loducca et al (2000) observaram a presença e distribuição do colágeno IV e laminina, bem como de seus ligantes (α2β1 e α3β1) em 5 casos de adenocarcinoma