Método da Placa Quente Hot Plate Test

A atividade antinociceptiva foi avaliada também pelo método placa quente descrita por Eddy e Leimback (1953). Foi avaliado o tempo que o animal resiste quando colocado sobre uma placa aquecida a 55°C ± 1,0°C. Sobre a placa foi colocado um funil de vidro invertido, para contenção do animal (Fig. 36). A resposta observada foi o ato do animal retirar as patas dianteiras, lambendo-as em seguida. O tempo decorrido desde que o animal foi colocado sobre a placa aquecida até o aparecimento da resposta (tempo de latência) foi mensurado utilizando-se um cronômetro. Foi estabelecido o tempo de corte de 60 segundos para a permanência máxima do animal na placa, com o objetivo de evitar danos teciduais às patas dos animais e eventuais interferências nas leituras subseqüentes. A latência foi medida nos tempos 0, 30, 60, 90 e 120 minutos após administração dos compostos.

Os animais foram tratados (i.p.) com a solução controle ou com soluções dos compostos sintetizados: BTZ-1 (100, 150 e 200 mg/kg), BTZ-2 (30, 50 e 80 mg/kg) e BTZ-3 (100, 150 e 200 mg/kg). A morfina (10 mg/kg; i.p.) e indometacina (10 mg/kg; v.o.) foram utilizados como fármacos padrões.

A = Indometacina; B = Morfina; C = Solução dos derivados; D = Solução controle;

Figura 37: Roteiro do método da placa quente na avaliação da atividade antinociceptiva.

5.3.1.3 Análise Estatística

Os resultados apresentados foram submetidos à análise de variância (one- way ANOVA), seguido pelos testes de Dunnett ou de Bonferroni, adotando um intervalo de confiança de 95%. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa GraphPad Prism 5.0.

5.3.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram avaliados apenas os derivados que não apresentaram nenhum sinal de toxicidade até a dosagem de 300 mg/kg. Assim, apenas os compostos BTZ-1, BTZ-2 e BTZ-3 foram avaliados quanto à atividade antinociceptiva.

A tabela 28 e figura 38 apresentam os resultados obtidos no método das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6%. Foi observada redução significativa no número de contorções após a indometacina, morfina e dipirona, conforme esperado. A Indometacina induziu á redução de aproximadamente 80,1% em relação ao grupo controle, enquanto a morfina e a dipirona reduziram 95,3% e 79,8%, respectivamente. Os compostos BTZ-1 (200 mg/kg) e BTZ-3 (150 e 200 mg/kg) foram capazes de reduzir o número de contorções abdominais, com percentuais de redução de 21,7%, 24,5% e 48,1%, respectivamente. Estes

60 45 0 30 60 90 120

Tratamento

T (minutos)

resultados indicam atividade antinociceptiva, porém a redução do número de contorções está aquém da redução observada para os fármacos padrões utilizados. Por apresentar maior percentual de redução no número de contorções (48,1%), atividade antinociceptiva moderada pode ser atribuída ao BTZ-3 na dose de 200 mg/kg, porém esta redução ainda é insuficiente para seu uso na terapêutica.

O método das contorções é considerado inespecífico, embora bastante utilizado em triagens, pois permite a detecção de compostos com atividade antinociceptiva periférica. O ácido acético induz a dor indiretamente, pois não estimula os receptores nociceptivos peritoneais de forma direta, agindo liberando substâncias endógenas que excitam as terminações nervosas, ou seja, produz inflamação aguda na área peritoneal (GYIRES e KNOLL, 1975).

A tabela 29 apresenta os resultados obtidos no método da placa quente. Foi observado aumento no tempo de latência para o composto BTZ-1 na dose 200 mg/kg, nos tempos 60, 90 e 120 minutos após a administração. A resistência dos animais na placa quente também foi significativa para o BTZ-3 nas doses 100 mg/kg (90 minutos) 150 e 200 mg/kg (60, 90 e 120 minutos).

Os animais tratados com o BTZ-3, na dose 100 mg/kg, apresentaram aumento discreto no tempo de latência (13,1 segundos) quando comparado aos animais tratados com morfina (29,3 segundos). O composto BTZ-3, 200 mg/kg no tempos 60, 90 e 120 minutos induziu ao aumento no tempo de latência de maneira semelhante à indometacina. A indometacina é um analgésico não esteroidal e demonstra atividade reduzida no método da placa quente, que é considerado seletivo para compostos com atividade opióide (LE BARS et al.,

2001). A morfina, de acordo com o esperado, aumentou a resistência dos animais ao calor.

Não houve diferença significativa entre os resultados observados para os animais do grupo controle ao longo do tempo, o que demonstra a consistência do método utilizado.

Embora existam muitos relatos das atividades de compostos benzotiazínicos, este foi o primeiro estudo que avaliou comparativamente o efeito antinociceptivo in vivo em dois modelos experimentais: método das contorções induzidas pelo ácido acético e método da placa quente, descritos na literatura como modelos para avaliação da atividade analgésica central e periférica, respectivamente (VERMA et al, 2005).

No método da placa quente o calor induz à ação termoceptiva cutânea (LE BARS et. al., 2001). O estímulo térmico do ensaio da placa quente é utilizado para avaliar a atividade analgésica mediada por mecanismos centrais (AL-GHAMDI, 2001). Fármacos opióides e outras drogas com atividade central, tais como sedativas e hipnóticas, mostraram atividade no modelo da placa quente (HIRUMA-LIMA et. al., 2000). Hendry e cols (1999) relataram que a integração do estímulo ocorre devido à estimulação das fibras C de condução lenta, que apresentam terminais não capsulados de receptores termais e mecânicos e fibras do tipo Aδ de condução rápida, que induzem o reflexo de retirada da pata através da ativação de termoreceptores. A latência do reflexo de retirada da pata ocorre por integração medular (HENDRY et al., 1999).

Atividade antinociceptiva moderada pode ser atribuída ao BTZ-3 na dose de 200 mg/kg, demonstrada pelo método das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. No método da placa quente, o aumento no tempo de

permanência dos animais sobre a placa aquecida sugere um efeito analgésico central (LORO et al,1999; RAMEZANI et al, 2001) para os compostos BTZ-1 (200 mg/kg) e BTZ-3 (150 e 200 mg/kg).

Schiaffella e cols (1999) realizaram estudos sobre relação estrutura- atividade para compostos benzotiazínicos e demonstraram que os derivados mais ativos farmacologicamente foram os que apresentaram um grupo metil em N-4, uma cadeia lateral em C-6, C-7 ou C-8, e um grupo carbonila, enxofre ou sulfóxido no C-3 do núcleo benzotiazínico. No presente estudo, os resultados observados estão em acordo com o referido estudo, pois os compostos mais ativos foram o BTZ-1 e BTZ-3, que possuem o grupo metila na posição 4, uma cadeia lateral na posição 6 (grupos nitro e benzoilamina, respectivamente) e um grupo carbonila na posição 3.

Novos trabalhos envolvendo estudos da relação estrutura-atividade podem ser realizados, atribuindo a atividade à estrutura química dos compostos e sugerindo novos grupos a serem inseridos como cadeias laterais nas moléculas, favorecendo o resultado de maiores atividades antinociceptivas nos ensaios com animais.

Tabela 28: Número total de contorções em 30 minutos induzidas pelo ácido acético 0,6% em camundongos. Os valores representam a média ± e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido do teste Dunnett).

GRUPO Dose N° de Contorções

(mg/kg) X. ± e.p.m. Controle X 21,2 ± 0,60 Morfina 10 1,0 ± 0,16 * Indometacina 10 4,2 ± 0,19 * Dipirona 200 4,3 ± 0.19 * BTZ 1 100 22,40 ± 0,40 150 19,80 ± 0,86 200 16,60 ± 1,29 * BTZ 2 30 24,80 ± 1,53 50 21,80 ± 0,86 80 18,60 ± 0,93 BTZ 3 100 20,20 ± 1,59 150 16,00 ± 1,30 * 200 11,00 ± 0,84 *

* p < 0.01 comparados com os animais do Grupo Controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).

0 5 10 15 20 25 30 Controle Morfina Indometacina Dipirona BTZ1 100mg/kg BTZ1 150mg/kg BTZ 1 200 mg/kg BTZ 2 30mg/kg BTZ 2 50mg/kg BTZ 2 80mg/kg BTZ 3 100mg/kg BTZ 3 150mg/kg BTZ 3 200mg/kg * * * * * * Nú m e ro t ot a l de c on tor ç õe s em 30 m in

Figura 38: Número total de contorções (em 30 minutos) induzidas pelo ácido acético 0,6% em camundongos tratados com os fármacos padrões e os derivados sintetizados. Os valores representam a média ± e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido do teste Dunnett).

Microrganismos testes ATCC

Candida albicans (C. albicans) ATCC 18804

Candida krusei (C. Krusei) ATCC 6258

Candida parapsilosis (C. parapsilosis) ATCC 22019 Candida tropicalis (C. tropicalis) ATCC 750