Métodos de quantificação da imunorreactividade

Todas as preparações foram avaliadas num microscópio Nikon FXA®, usando, quando necessário, uma ocular micrométrica Zeiss®_.

3.4.1. Proliferação: Proteína Ki-67

A reacção foi considerada positiva quando a marcação ocorria no núcleo, independentemente da sua intensidade. Após observação de toda a área atingida pelo tumor, seleccionou-se a área com positividade mais elevada e homogénea, evitando-se áreas de necrose e de fenómenos inflamatórios exuberantes. A observação da área seleccionada foi realizada com a objectiva de 40X. O índice de Ki-67 foi determinado contando, pelo menos, 1000 células em 8 a 10 campos e estabelecendo a sua fracção percentual (Peña et al., 1998).

3.4.2. Proteínas de membrana: c-Kit

Foi considerada reacção positiva quando a marcação ocorria na membrana citoplasmática e no citoplasma dos mastócitos. Os tumores foram considerados positivos quando apresentavam mais de 5% das células tumorais positivas, de acordo com o descrito (Morini et al., 2004).

A gradação dos tumores foi efectuada pela localização da marcação e pela intensidade desta, conforme descrito por Webster et al. em 2004. Assim definiram-se três padrões de imunomarcação para o c-Kit:

1. Padrão membranar (c-Kit padrão 1) - Marcação membranar citoplasmática com

marcação citoplasmática mínima.

2. Padrão citoplasmático focal (c-Kit padrão 2) - Marcação citoplasmática focal,

paranuclear, apresentando ou não marcação membranar.

3. Padrão citoplasmático difuso (c-Kit padrão 3) - marcação citoplasmática intensa,

difusa, mascarando as demais características citoplasmáticas.

As lesões foram classificadas como apresentando padrão membranar sempre que mais de 50% das células apresentavam marcação na periferia do citoplasma e marcação citoplasmática escassa ou nula, tal como observado nos mastócitos normais. Nas lesões de padrão citoplasmático focal, mais de 50% das células apresentava marcação citoplasmática focal paranuclear (Golgi-like), podendo apresentar ou não padrão membranar. Nas lesões de padrão citoplasmático difuso, a maioria das células apresentava marcação citoplasmática difusa, independentemente de poder apresentar também marcação membranar de intensidade variável.

3.4.3. Matriz extracelular 3.4.3.1. Fibronectina

3.4.3.1.1.Marcação dos mastócitos

Os tumores foram classificados em três grupos, de acordo com a quantidade de mastócitos neoplásicos marcados, como exposto no quadro 3.3.

Quadro 3.3: Avaliação semi-quantitativa da marcação de fibronectina nos mastócitos % mastócitos positivos

1 <25% mastócitos 2 [25-50%] mastócitos 3 > 50% mastócitos

3.4.3.1.2. Marcação do estroma

Avaliou-se também a reactividade à fibronectina no estroma, tendo-se classificado os tumores como positivos quando se observou marcação inequívoca dos componentes da matriz, pelo menos numa área representativa do tumor. Os tumores positivos foram classificados de forma semi-quantitativa em 3 classes, de acordo com estudos anteriores, efectuados em carcinoma da mama humano (Ioachim et al., 2002).

Quadro 3.4: Avaliação semi-quantitativa da marcação de fibronectina no estroma Imunorreactividade

1 Imunorreactividade escassa

2 Imunorreactividade moderada

3 Imunorreactividade intensa

3.4.3.2. Metaloproteinases de Matriz -1 e -2 (MMP-1 e MMP-2)

Foi considerada reacção positiva quando a marcação ocorria no citoplasma dos mastócitos. A avaliação da imunorreactividade baseou-se na determinação de um índice, adaptado de um método semi-quantitativo previamente descrito por Kallakury et al. em 2001, em carcinoma renal humano e que tem por base a quantidade e a intensidade de imunomarcação. O índice de imunorreactividade foi calculado, combinando a percentagem de células imunorreactivas, (definida por grau de imunorreactividade - GI), com a intensidade de marcação, (definida por intensidade de marcação - IM), como se descreve de seguida:

GI IM

1 <25% 1 Ténue

2 [25-50%] 2 Moderada

Para se obter o índice de imunorreactividade, (Índice de IR), multiplicou-se o grau de imunorreactividade pela intensidade de marcação, empregando-se a seguinte fórmula:

Índice de IR = GI x IM

Considerou-se haver sobre-expressão da proteína quando o índice de imunorreactividade foi igual ou superior a 6 (Kallakury et al., 2001).

3.4.3.3. Metaloproteinase de Matriz -9 (MMP-9)

Foi considerada reacção positiva quando a marcação ocorria no citoplasma dos mastócitos neoplásicos. A imunorreactividade foi avaliada nas células tumorais, tendo sido feita uma avaliação semi-quantitativa da percentagem de mastócitos marcados, conforme exposto no quadro 3.5.

Quadro 3.5: Avaliação semi-quantitativa da marcação de MMP-9 % mastócitos positivos

1 <25% Mastócitos 2 [25-50%] Mastócitos 3 > 50% Mastócitos

3.4.4. Angiogénese

3.4.4.1. Factor de crescimento endotelial vascular A (VEGF A)

A imunorreactividade foi avaliada quando a marcação ocorria no citoplasma dos mastócitos e classificada em presente ou ausente.

3.4.4.2. CD31

Foi considerada imunorreactividade a marcação citoplasmática, tendo-se avaliado a densidade de microvasos, de acordo com métodos descritos anteriormente (Weidner, 1996). Efectuou-se a observação de toda a área atingida pelo tumor,

seleccionando-se a área do tumor com positividade mais elevada e homogénea, tendo-se calculado a média do número de microvasos em três campos de maior ampliação. Todos os aglomerados de células endoteliais marcados com ou sem lume e separados claramente de outros conjuntos celulares, foram considerados como sendo vasos individuais e incluídos para contagem. Os vasos com parede muscular e/ou calibre superior a 45-50 μm foram excluídos desta contagem.

3.4.5. Infiltrado inflamatório associado ao tumor 3.4.5.1. Proteína mielomonocítica L1 (Mac 387)

Foi considerada imunorreactividade positiva quando a marcação ocorria no citoplasma dos macrófagos. Avaliaram-se três campos de 40X, onde foi feita a contagem de células positivas, sendo depois feita a média das contagens dos três campos. Os campos foram seleccionados nas áreas mais internas do tumor, evitando regiões ulceradas.

3.4.5.2. Marcadores de linfócitos: CD3 (Linfócitos T) e CD79 (Linfócitos B)

Foi considerada imunorreacção positiva quando esta ocorria no citoplasma ou na membrana citoplasmática das células linfóides. Avaliou-se a totalidade do tumor em ampliação de 4X, tendo-se depois quantificado e classificado a densidade de linfócitos em três classes:

1. Infiltração focal escassa – menos de 10 linfócitos por campo distribuídos

focalmente.

2. Infiltração difusa escassa – 10 a 50 linfócitos por campo, distribuídas de forma

difusa.

3. Infiltração difusa abundante – mais de 50 células positivas por campo, distribuídas

3.4.6. Citocinas

3.4.6.1. Eotaxina e Interleucina 5

Foi considerada reacção positiva quando a marcação ocorria no citoplasma dos mastócitos. A imunorreactividade foi observada nas células tumorais em que foi feita uma avaliação semi-quantitativa da percentagem de células marcadas, descrita no quadro 3.6.

Quadro 3.6: Avaliação semi-quantitativa da marcação das quimiocinas IL-5 e eotaxina % mastócitos positivos

1 < 25% mastócitos 2 [25-50%] mastócitos 3 > 50% mastócitos

3.4.6.2. Regulated on Activation Normal T Cell Expressed and Secreted -RANTES

Considerou-se positiva a imunorreactividade citoplasmática e foi classificada em presente e ausente.