Manuscrito submetido à AIDS (Journal of International AIDS Society)

“Avaliação das citocinas (ELISA e RT-PCR) e da fibrose hepática na

coinfecção pelo HIV e vírus da hepatite C”

“Citocinas e fibrose hepática na coinfecção HIV/VHC”

Alexandre N. Barbosa

, Sueli A. Calvi

, Eliana Peresi

, Vanessa C. Nicoleti

,

Domingos A. Meira

.

a _{Serviço de Ambulatórios Especializados e Hospital Dia Professor Emérito Domingos Alves}

Meira, Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista - UNESP, Botucatu, Estado de São Paulo, Brasil.

b _{Laboratório Experimental de Doenças Tropicais - Departamento de Doenças Tropicais e}

Diagnóstico por Imagem, Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista - UNESP, Botucatu, Estado de São Paulo, Brasil.

Correspondência para Alexandre Naime Barbosa. Endereço: SAE e Hospital Dia - Departamento de Doenças Tropicais, Faculdade de Medicina de Botucatu-UNESP, s/n, Distrito de Rubião Jr. Botucatu-SP, Brasil, CEP-18618-970.

Tel: +55 14 38116537; fax: +55 14 38116537. E-mail: [email protected]

Suporte financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).

Apêndice

Resumo

Objetivo: Avaliar o padrão das citocinas na coinfecção HIV/VHC e na progressão da

fibrose hepática

Métodos: IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α, INF-γ, TGF-β foram dosadas por Elisa e RT-PCR em cinco

grupos: pacientes coinfectados pelo HIV/VHC (n=22), monoinfectados pelo HIV com supressão virológica pelo tratamento, e sem supressão virológica (n=17), monoinfectados pelo VHC (n=22) e um grupo controle composto por indivíduos doadores de sangue (n=10). Biópsia hepática e classificação METAVIR foram realizados em todos os pacientes com infecção pelo VHC (n = 44).

Resultados: As características basais (sexo, idade e raça) entre todos os grupos foram

semelhantes. IL-4 e IL-10 estiveram aumentadas consistentemente nos quatro grupos de estudo, determinando predomínio do perfil Th-2. INF-γ, TNF-α e TGF-β estiveram aumentados apenas nos dois grupos com infecção pelo VHC, refletindo o processo progressivo de acúmulo de inflamação e fibrose hepática. No grupo de monoinfectados pelo HIV com supressão virológica, a IL-2 dosada por RT-RCR esteve aumentada, porém os níveis séricos dosados por Elisa estavam normais. O predomínio de IL-4 e IL-10 em todos os grupos demonstram a incapacidade de produção de uma resposta citotóxica Th-1. Mesmo naqueles indivíduos com supressão virológica pelo tratamento e com aumento da expressão da IL-2, as citocinas do perfil Th-2 foram as predominantes, perpetuando a inflamação crônica.

Conclusões: Além de drogas antivirais, novos tratamentos imunomoduladores têm sido

propostos para a erradicação viral, ou a interrupção das lesões causadas pelo estado inflamatório crônico. A avaliação das citocinas tem papel principal verificar a eficácia de intervenções, e também se constituir como ferramenta de determinação evolutiva e de prognóstico.

Apêndice

Introdução

Apesar de conhecidas relativamente há pouco tempo, a aids e a infecção pelo vírus da hepatite C (VHC) têm se destacado como duas das mais importantes e prevalentes doenças em todo o mundo, por gerar alta morbi-mortalidade e grande

impacto social e financeiro, mesmo em países mais desenvolvidos (1,2). Desde os primeiros

relatos em 1981, estima-se que aproximadamente 65 milhões de pessoas se infectaram pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), sendo que dessas, cerca de 25 milhões já

morreram (1). Em relação ao VHC, estima-se que cerca de 180 milhões de pessoas, ou

cerca de 3% da população mundial esteja infectada, sendo que 130 milhões com alto risco

de desenvolver cirrose e/ou carcinoma hepatocelular (2). A hepatite crônica pelo vírus C

(HVC) é responsável por 50% a 76% de todos os casos novos de câncer de fígado e por

dois terços dos transplantes hepáticos nos países desenvolvidos (2). A prevalência da HVC

nas pessoas vivendo com HIV/aids (PVHA) varia muito, dependendo, principalmente, do modo de aquisição do HIV, mas em via de regra, é bem maior do que na população em geral. Pelo fato dos dois vírus compartilharem os mesmos mecanismos de transmissão, essa relação pode ser muito alta, como verificado em usuários de drogas ilícitas (91%) ou em hemotransfundidos (71%), ou mesmo ser mais baixa (7%), como naqueles que tem

apenas fator de risco sexual, via não muito efetiva para transmissão do VHC (3).

Além de mais freqüente, a HVC pode ser considerada uma doença oportunista nas PHVA, pois há aceleração de sua história natural, representada por elevação da carga viral plasmática do VHC, fibrose hepática precoce e maior ocorrência de esteatose, cirrose e de

carcinoma hepatocelular (4,5,6). Como conseqüência, a morbi-mortalidade por doença

hepática terminal é maior nos indivíduos coinfectados pelo HIV/VHC em comparação com

monoinfectados pelo VHC (7). Se a dinâmica imunopatogênica já é complexa em

indivíduos monoinfectados pelo VHC, na situação de coinfecção HIV/VHC poucos estudos abordam especificamente o tema, sem, contudo, avaliar a correlação dos entre a resposta T específica e o estadiamento da lesão hepática. Em indivíduos monoinfectados pelo HIV, sem tratamento antirretroviral e com progressão da doença, observa-se predomínio do

Apêndice

indivíduos tratados com HAART, com carga viral plasmática do HIV (CV-HIV) indetectável ou não, estudos demonstraram não haver recuperação da capacidade de expressão de perfil Th-1, sendo que esses pacientes exibiram em sua maioria perfil Th-0 maduro e baixos níveis de IL-2, sugerindo que a apoptose de linfócitos durante a evolução da

doença seja a responsável por esse fenômeno (9).

A progressão da HVC em PVHA é mais rápida e o prognóstico pior (4,5,6,7). A carga

viral do VHC na coinfecção é maior, tanto no plasma, quanto em tecido hepático, sendo

demonstrada, inclusive, replicação do VHC em macrófagos, linfócitos T CD4 e CD8 e

também em linfonodos nessa situação (10,11,12). Estudos recentes apontam que o TGF-β

está especialmente alto nessa coinfecção, justificando, portanto a instalação mais rápida

de fibrose, já que essa citocina está envolvida em processos pró-fibróticos (13,14).

Adicionalmente, o TGF-β reduz a resposta de linfócitos T CD8 ao IFN-γ, favorecendo a

persistência da infecção e impedindo a resposta T específica (14,15). Em relação ao

tratamento antirretroviral, há evidências que os pacientes coinfectados virgens de HAART apresentem tendência a exibir perfil Th-2 mais freqüentemente do que os indivíduos tratados, sem, contudo diferenças significativas nos níveis de TGF-β (14, 16).

Devido à escassez de estudos que correlacionem a expressão e secreção de citocinas, tanto pró-inflamatórias, quanto indutoras de fibrogênese, na população co- infectada pelo HIV/VHC, com os achados histopatológicos da biópsia hepática, investigações nesse sentido se fazem necessárias a fim de estabelecer parâmetros que possam predizer melhor ou pior prognóstico, ou mesmo, indicar de forma mais precisa a realização da biópsia hepática, sendo o objetivo do presente estudo.

Apêndice

Métodos

Foi realizado estudo de corte transverso não randomizado em 71 pacientes com coinfecção HIV/VHC, monoinfecção pelo HIV ou pelo VHC, além de indivíduos normais, doadores de sangue no período entre outubro de 2008 e agosto de 2009. Foram formados cinco grupos: G1: coinfecção HIV/VHC (n=22); G2: monoinfecção VHC (n=22); G3: monoinfecção HIV com carga viral (CV) detectável (n=6); G4: monoinfecção HIV com carga viral (CV) indetectável (n=11); G5: grupo controle, doadores de sangue (n=10). Pacientes com idade menor de 18 anos, gestantes, coinfecção pelo vírus da hepatite B (VHB), infecção oportunista relacionada à aids e insuficiência hepática (Child-Pugh B ou C) não foram incluídos.

As citocinas IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α, INF-γ, TGF-β foram determinadas pelo método de ELISA, por meio de kits comerciais (R&D Systems), bem como por quantificação de mRNA em tempo real. Após coleta de 20 ml de sangue periférico, as células mononucleares foram obtidas por meio de separação em gradiente de Ficoll-Hypaque. O anel rico em linfócitos e monócitos foi lavado por duas vezes com meio de cultura RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Grand Island, N. Y.) por 10 minutos a 200 g, cada lavagem. Após este período, a suspensão celular foi ressuspensa em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 2 mM de L-glutinina (Sigma Chemical Co., ST Louis, MO, USA), 40 μg/ml de gentamicina e 10% de soro sendo a identificação, a verificação de viabilidade e a contagem realizadas utilizando corante Turk (alíquotas de 50 μl da suspensão celular acrescidas de 50 μl da solução corante a 5%). A concentração celular foi ajustada para

2x106 células viáveis/ml após contagem em câmara hemocitométrica. Para a extração do

RNA, 2x106 células mononucleares totais do sangue periférico foram homogeneizadas em

0,5 ml de Trizol Reagent (Invitrogen). Em seguida o RNA extraído foi tratado com DNAse (RQ1 RNAse Free-DNAse, M6,101, Promega) para a purificação do RNA, de acordo com as instruções do fabricante. O RNA obtido foi quantificado com o auxílio de espectofotômetro NanoDrop (NP-1000) a 260 nm e 280 nm. O cDNA foi sintetizado a partir de 1Pg de RNA total. Para cada 1 Pg de amostra de RNA foram adicionados 4 μl de Tampão da reação, 1 μl da mistura de nucleotídeos (dNTP-mix) 10 mM, 1 μl de Random

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Primers, 1 μl Superscript, 1 μl de inibidor de RNAse (GeneAmp- Applied Biosystems), 1 μl DTT, 1ul RNAse H e H2O deionizada tratada com 0,1% de DEPC (dietilpirocarbonato). Para a obtenção do cDNA, foi programado o aparelho Temociclador Mastercycler (Eppendorf) por 25°C por cinco minutos, 50°C por 50 minutos, 70°C por 15 minutos e 37°C por 20 minutos. Para a detecção da produção de mRNA para as citocinas foram utilizados

primers específicos (Tabela 1). Os primers foram desenhados utilizando o software

IDSciTools (www.idtdna,com) a partir de seqüência publicada no Genebank.

A reação de PCR em tempo real para a quantificação relativa de mRNA das citocinas, foi desenvolvida no aparelho de PCR em tempo real modelo 7300 ( Applied Biosystems, EUA) com o uso do kit Power Syber Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, EUA) conforme as instruções do fabricante, em um volume final de 20 μl, com adição de 4 μl da amostra de cDNA por reação e 300 nM de cada primer. As condições da reação foram: 95°C por 10 minutos, seguidos de 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por um minuto, sendo os sinais de fluorescência adquiridos nos passos de anelamento e extensão do ciclo de amplificação (60°C por um minuto). Em todas as placas foi adicionado o cDNA de uma mesma amostra utilizada para construção da curva padrão. Paralelamente, foi realizada a amplificação do gene da E-actina, visto que o valor real de expressão gênica foi realizado através da comparação do resultado da amplificação dos genes de interesses, e desse gene constitutivo. Os valores de expressão relativa para cada amostra testada foi fornecida diretamente pelo programa SDS versão 1.23, (Sequence Detection Systems 1.2.3 – 7300 Real Time PCR Systems- Applied Biosystems, EUA), e posteriormente normalizados pelos valores de expressão relativa da β-actina.

A biópsia hepática foi realizada em todos os indivíduos infectados pelo VHC, com ou sem coinfecção pelo HIV, e o estadiamento da fibrose hepática foi realizada pela classificação METAVIR (17).

Para comparar as variáveis sexo, idade e cor da pele foi utilizado o teste χ2 e o

teste exato de Fisher, com um nível de significância de p < 0,05. Na análise das citocinas, foi calculado para o grupo controle (G5) média ( ) e desvio padrão (σ). Os valores inferiores e superiores de normalidade das citocinas séricas e por RT-PCR foram então

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calculados subtraindo e somando respectivamente dois desvios padrão ( -/+ 2σ) dos valores de G5. A comparação entre os grupos também foi obtida pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, ajustado pelo teste de Dunn, com o cálculo das estatísticas

H e p (com distribuição de χ2) e contrastes entre postos médios dos grupos (no caso de p

< 0,05). Os perfis de citocinas séricas e por RT-PCR foram definidos por alteração de dois desvios padrão em relação às médias normais de G5. Então, o perfil Th-1 foi definido quando as médias de IL-2 e INF-γ foram maiores que dois desvios padrão do G5, e as médias de IL-4 e IL-10 foram comparáveis ao G5. O perfil maduro Th-0 foi considerado quando as médias de INF-γ e a IL-4 foram maiores que dois desvios padrão de G5, independente da elevação de outras citocinas (IL-2 e/ou IL-10). O perfil Th-2 foi definido quando as médias de IL-4 e a IL-10 foram maiores que dois desvios padrão do G5, e as médias de IL-2 e o IFN-γ foram comparáveis ao G5. A mesma interpretação foi refeita com os resultados obtidos pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, ajustados pelo teste de Dunn.

O presente estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp, e foi registrado no Clinicaltrials.gov (NCT 00499434).

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Resultados

As características basais (sexo, idade e cor da pele) estiveram homogeneamente distribuídos entre os grupos estudados, sem diferença estatística (Tab. 2). Nos grupos de paciente com infecção pelo HIV, a maioria dos pacientes exibia contagem de linfócitos T

CD4 maiores que 350 células/mm3 e carga viral indetectável. Já nos grupos com HVC,

havia predominância do genótipo 1, e da fibrose grau 2.

Para a comparação entre as citocinas por ELISA e RT-PCR foram utilizados dois métodos: desvio padrão da normalidade e o teste estatístico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn (Fig.1). IL-4 e IL-10 estiveram consistentemente aumentadas em todos os grupos de estudo, enquanto INF-γ, TNF-α and TGF-β foram maiores principalmente nos grupos com infecção pelo VHC. Porém, não foi encontrada associação entre as citocinas e fibrose hepática.

Houve predomínio de produção aumentada de citocinas do perfil Th-2 (Fig.2), com aumento importante de IL-4 e IL-10. INF-γ esteve aumentado apenas em G2, enquanto IL- 2 se mostrou maior somente em G4 por RT-PCR, o que não caracterizou, porém, mudança de perfil, pois mesmos nesses grupos havia predomínio das citocinas do perfil Th-2.

Discussão

Em linhas gerais, em todos os grupos de estudo observamos aumento das citocinas IL-4 e IL-10, relacionadas mais intimamente ao perfil Th-2. Já o INF-γ e a IL-2, principais citocinas ligadas ao perfil Th-1, não estão consistentemente aumentadas, e, quando existe tendência superior de expressão, como no caso do G4, sua produção sérica provavelmente esteja sendo inibida pelos altos níveis séricos circulantes de IL-4 e IL-10. O predomínio dos perfis Th-2 e Th-0 maduro nas infecções crônicas seja pelo HIV ou pelo VHC foi demonstrado em diversos trabalhos e estão possivelmente na gênese da perpetuação da infecção, do escape da resposta imune, da atividade inflamatória constante, e, consequentemente, da instalação das lesões e progressão da doença (8,9,18,19)_.

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Na análise global dos perfis de resposta imune, o perfil Th-2 predominou entre os grupos compostos por pacientes com mono ou co-infecção pelo HIV, sendo que o grupo monoinfectado pelo VHC diferiu principalmente pela alta expressão e produção de IFN-γ, levando a uma interpretação de perfil intermediário entre Th-0 e Th-2, apesar da ausência de IL-2. Quando avaliado individualmente o IFN-γ realmente se destaca por suas altas concentrações séricas no G2, talvez refletindo uma tentativa de resposta à infecção pelo VHC, mas que esteja incompleta por falta da IL-2, que pode ser causado pela alta produção de IL-4 e principalmente de IL-10, já descrito como mecanismo de escape do VHC (20,21). Porém, o mesmo comportamento não se verificou no G1, apesar da dosagem de mRNA-IFN-γ ser a mais alta entre todos os grupos. A possível explicação dessa tendência de expressão não se traduzir em produção, é que também no G1 se observam os maiores valores de IL-10, que não ocorre com tanta intensidade em G2. Nos outros grupos, não houve aumento do IFN-γ. No presente estudo, a interação HIV/VHC parece favorecer uma alta expressão de mRNA-IFN-γ, que não é verificada nos outros grupos de monoinfecção pelo HIV, mas essa característica não se traduz em uma produção sérica de IFN-γ, como visto entre os monoinfectados pelo VHC.

A avaliação individual da IL-2 mostra que apenas no G4 houve aumento significativo do mRNA-IL-2, sem que contudo, houvesse uma concentração sérica aumentada, talvez por inibição causada pela IL-10, que tinha níveis elevados nesse grupo e pode ser a explicação para a persistência de baixos níveis de IL-2 mesmo em pacientes

com CV-HIV indetectável por muitos anos (9). É interessante notar que, somente em

comparação com o G1, o G4 exibia níveis circulantes mais elevados de IL-2, o que sugere que a coinfecção HIV/VHC esteve relacionada à diminuída expressão desta citocina. Nos outros grupos não se observou aumento de IL-2. No presente estudo, a condição de CV- HIV indetectável parece favorecer a expressão de IL-2, apesar dos níveis séricos normais. A interação HIV/VHC esteve associada à diminuída produção de IL-2, se comparada aos indivíduos monoinfectados pelo HIV com CV-HIV indetectável.

Em relação à avaliação individual da IL-4, foi observado aumento consistente em todos os grupos, tanto em expressão de mRNA, quanto em níveis séricos, com exceção do G1, que apresentou aumento somente pelo ELISA quando utilizado os valores inferior e

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superior de normalidade. A IL-4 é a principal citocina relacionada à indução do perfil Th-2, o que pode explicar o fato de todos os grupos exibirem essa tendência, tanto em

indivíduos monoinfectados pelo HIV ou VHC, ou em coinfectados HIV/VHC (8,9,18,19). No

presente estudo, a IL-4 esteve elevada em todos os grupos e pode ser o determinante principal para a tendência de predomínio do perfil Th-2 encontrada. A interação HIV/VHC esteve associada a menores níveis de IL-4, sendo que nessa população não houve aumento nas dosagens de mRNA.

A IL-10 observada individualmente revelou altos níveis séricos em todos os grupos, exceção talvez em G4. As dosagens de mRNA-IL-10 esteve principalmente elevada em G1 e G3, grupos que continham pacientes com CV-HIV detectável, o que pode ser um fator

de influência para a expressão dessa citocina (8,9). A IL-10 é uma potente inibitória das

citocinas do perfil Th-1, e sua elevação pode explicar a não produção de IFN-γ em G1, apesar de mRNA-IFN-γ elevado, e a não produção de IL-2 em G2, apesar do mRNA-IL-2 também elevado. No presente estudo, a IL-10 esteve aumentada em todos os grupos, e pode ter contribuído para a tendência do perfil Th-2 encontrada.

Quando avaliado individualmente, o TNF-α se mostrou elevado principalmente em G1 e G2, tanto por ELISA quanto por RT-PCR. Em G3 e G4 foi verificado aumento, se considerarmos a análise por desvio padrão. O TNF-α é importante citocina ligada à inflamação local e sistêmica, além de induzir apoptose, sendo relacionada à progressão

da inflamação hepática e progressão da fibrose (22). A análise individual do TGF-β mostra

elevação somente nos grupos que continham pacientes infectados pelo VHC monoinfectados, ou coinfectados pelo HIV, sendo que, nos grupos que eram formados por monoinfectados pelo HIV, tanto a dosagem sérica quanto o mRNA-TGF-β estiveram normais. O TGF-β tem reconhecidamente ação fibrogênica hepática, além de efeitos anti- inflamatórios e antagonista do perfil Th-1, além de ser inibidor da proliferação celular e

promover indução de apotose hepática (23). Por todos esses aspectos, alguns autores

sugerem que a dosagem de TGF-β pode ser uma importante arma no diagnóstico de

progressão de doença hepática, como na situação de infecção pelo VHC (23,24).

O processo de infecção crônica e indução constante de apoptose, representado pelos altos níveis de TNF-α estão implicados na progressão tanto da aids, quanto da HVC.

Apêndice

Na infecção pelo HIV, cada vez mais tem sido imputado ao “processo inflamatório crônico” lesões cardiovasculares, renais, neurológicas, entre outras, enquanto que, na HVC a manutenção da atividade inflamatória é reconhecidamente um fator preditivo positivo na progressão para cirrose. Nesse sentido, o TGF-β se mostrou importante marcador de fibrose, que não se confunde em pacientes não infectados pelo VHC.

Além de drogas antivirais, novos tratamentos imunomoduladores têm sido

propostos para a erradicação viral, ou a interrupção das lesões causadas pelo estado inflamatório crônico. A avaliação das citocinas tem papel principal não somente para contribuir no entendimento desse complexo mecanismo, bem como em verificar a eficácia de intervenções, e também se constituir como ferramenta de determinação evolutiva e de prognóstico.

Apêndice

Agradecimentos

Agradecemos a participação dos pacientes e doadores de sangue integrantes do estudo.

Este projeto de pesquisa recebeu suporte financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e apoio institucional da Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp.

A.N.B., S.A.C., E.P., V.C.N. e D.A.M. participaram do desenho, desenvolvimento,

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Referências

1. UNAIDS. 2008 Report on the global AIDS epidemic. Geneva: WHO; 2008 [cited 2010 Jan 04]. Avaiable from: http://data.unaids.org/pub/ GlobalReport/2008/JC1510_2008GlobalReport_en.zip

2. World Health Organization. Hepatitis C fact sheet. 2008 [cited 2010 Jan 04]. Avaiable from: http://www.who.int/immunization/topics/ hepatitis_c/en/index.html.

3. Saillour F, Dabis F, Dupon M, Lacoste D, Trimoulet P, Rispal P, et al. Prevalence and determinants of antibodies to hepatitis C virus and markers for hepatitis B virus infection in patients with HIV infection in Aquitaine. Br Med J. 1996; 313: 461-4.

4. Eyster ME, Fried MW, Di Bisceglie AM, Goedert JJ. Increasing hepatitis C virus RNA