Avaliação das citocinas (ELISA e RT-PCR) e da fibrose hepática na coinfecção pelo HIV e vírus da hepatite C

(1)

Alexandre Naime Barbosa

Avaliação das citocinas (ELISA e RT-PCR) e da fibrose hepática na

coinfecção pelo HIV e vírus da hepatite C

Botucatu - SP

2010

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Doenças

Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu -

Universidade Estadual Paulista - UNESP para a obtenção do

Título de Doutor em Doenças Tropicais.

(2)

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE

Barbosa, Alexandre Naime.

Avaliação das citocinas séricas e dosadas por RT-PCR, e da fibrose hepática na coinfecção pelo HIV e vírus da hepatite C / Alexandre Naime Barbosa. _– Botucatu, 2010

Tese (doutorado) _– Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2010

Orientador: Domingos Alves Meira Assunto CAPES: 40100006

1. Medicina tropical. 2. Hepatite C. 3. HIV (Vírus).

(3)

(4)

(5)

Epígrafe

“A tarefa não é tanto ver o que ninguém viu ainda,

mas pensar o que ninguém pensou sobre algo que todos vêem”

(6)

(7)

Agradecimentos

Ao Prof. Titular Emérito Dr. Domingos Alves Meira,

pelo modelo de conduta na prática médica, no ensino e na pesquisa,

pelo convívio e ensinamentos científicos, éticos e culturais,

pela energia que contagia, pela capacidade de sonhar.

À minha família:

meu pai, pela dedicação e condução desde cedo, ao mundo dos livros;

minha mãe, pelo carinho e apoio à toda prova;

meu irmão, pelo incentivo e companheirismo;

meus avós, referência pessoal de moral e de bondade.

Aos colegas da Disciplina:

Lenice do Rosário de Souza, Ricardo Augusto Monteiro de Barros Almeida e

Carlos Magno Fortaleza Castelo Branco, pelo companheirismo e amizade.

Ao Dr. Lucas Marques da Costa Alves pela ajuda no recrutamento.

Aos Funcionários do Hospital Dia e Residentes da MIP pela ajuda na

identificação dos pacientes e coleta das amostras.

À Equipe do Laboratório de Doenças Tropicais:

Sueli Aparecida Calvi, Eliana Peresi e Vanessa Cristina Nicoleti pelo

processamento das amostras.

Aos funcionários do Departamento de Doenças Tropicais e da Seção de

(8)

Agradecimentos

Aos funcionários da Biblioteca do Campus de Rubião Jr. e do Grupo de

Apoio à Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp pelo apoio

técnico.

Aos meus queridos amigos, minha família em Botucatu (e fora dela

também): Abigail, Jú, Zumira, Saci, Faiado, Stella, Maligno, Secrê, Jeba,

Kesan, Ritchie, Pardal, Dalva, Marila, Anabele, Amanda, Vidal e tantos

outros que não cabem aqui.

E principalmente aos pacientes e voluntários que aceitaram em participar

dessa pesquisa. Espero que os resultados possam contribuir de alguma

forma para aprimorar o conhecimento sobre a infecção pelo HIV/aids e a

(9)

(10)

Sumário

Sumário

I. Resumo... x

II. Abstract... xii

III. Introdução... 01

1. Fundamentação Científica... 02

2. Objetivos... 08

II. Casuística e Métodos... 09

1. Casuística... 10

2. Métodos... 10

III. Resultados... 24

1. Homogeneidade entre os grupos... 25

2. Linfócitos T CD4, carga viral do HIV, genótipo do VHC e fibrose hepática... 26

3. Valores de referência de normalidade para as citocinas... 30

4. Comparação entre as citocinas nos grupos de estudo e o grupo controle... 31

IV. Discussão... 40

V. Considerações Finais... 49

VI. Referências Bibliográficas... 51

VII. Apêndice... 60

1. Manuscrito submetido à AIDS (Journal of International AIDS Society)…….…. 61

2. Manuscript submitted to AIDS (Journal of International AIDS Society)…... 80

(11)

(12)

Resumo

Resumo

A aids e a hepatite C crônica são infecções caracterizadas por importante processo

inflamatório contínuo, regulado por uma complexa interação entre citocinas. A

persistência da atividade inflamatória crônica está intimamente relacionada com a

progressão da patogênese da aids, bem como na indução de fibrose na hepatite C. Com o

objetivo de avaliar o padrão de citocinas na infecção pelo HIV e na hepatite C crônica, as

citocinas IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α, INF-γ, TGF-β foram dosadas por Elisa e RT-PCR em cinco

grupos: pacientes coinfectados pelo HIV/VHC (n=22), monoinfectados pelo HIV com

supressão virológica pelo tratamento, e sem supressão virológica (n=17), monoinfectados

pelo VHC (n=22) e um grupo controle composto por indivíduos doadores de sangue

(n=10). IL-4 e IL-10 estiveram aumentadas consistentemente nos quatro grupos de

estudo, determinando predomínio do perfil Th-2. INF-γ, TNF-α e TGF-β estiveram

aumentados apenas nos grupos com infecção pelo VHC, com ou sem coinfecção pelo HIV.

No grupo de monoinfectados pelo HIV com supressão virológica, a IL-2 dosada por RT-RCR

esteve aumentada, porém os níveis séricos dosados por Elisa estavam normais. A alta

produção de citocinas pró-inflamatórias INF-γ, TNF-α e TGF-β nos dois grupos de

pacientes com infecção pelo VHC refletem o processo progressivo de acúmulo de

inflamação e fibrose hepática. Já o predomínio de IL-4 e IL-10 em todos os grupos,

citocinas ligadas ao perfil Th-2, demonstram a incapacidade de produção de uma resposta

citotóxica Th-1, perpetuando a infecção e a inflamação crônica, mesmo naqueles

indivíduos com supressão virológica pelo tratamento. Além de drogas antivirais, novos

tratamentos imunomoduladores têm sido propostos para a erradicação viral, ou a

interrupção das lesões causadas pelo estado inflamatório crônico. A avaliação das

citocinas tem papel principal verificar a eficácia de intervenções, e também se constituir

(13)

(14)

Abstract

Abstract

Both AIDS and chronic hepatitis C (HCV) are characterized by continuous

inflammatory process, regulated by a complex interaction between cytokines. The

persistence of chronic inflammatory activity is closely related to the progression of the

pathogenesis of AIDS, as well as the induction of fibrosis in HCV. In order to analyze the

role of cytokines in HIV/HCV coinfection and the fibrosis progression, IL-2, IL-4, IL-10,

TNF-α, INF-γ, TGF-β were measured by ELISA and RT -PCR in five groups: HIV/HCV coinfected

patients (n = 22), HCV monoinfected patients (n = 22), HIV monoinfected patients with

and without virological suppression (n = 17) and a control group composed by blood

donors (n = 10). Hepatic biopsy and METAVIR classification were performed in all HCV

patients (n=44). The baseline characteristics (sex, age and race) of all groups were similar.

No correlations were found between cytokines and hepatic fibrosis. IL-4 and IL-10 were

consistently increased in the four study groups, findings associated to a Th-2 profile.

INF-γ, TNF-α and TGF-β were increased only in groups with HCV infection. In the group of HIV

monoinfected patients with virological suppression, IL-2 measured by RT-RCR was

increased, but serum levels measured by ELISA were normal. The high production of

pro-inflammatory cytokines INF-γ, TNF-α and TGF-β in two groups of patients with HCV

infection reflect the gradual process of inflammation and liver fibrosis. The predominance

of IL-4 and IL-10 in all study groups demonstrates an inability to promote a cytotoxic Th-1

response. Even in HIV monoinfected patients with virological suppression with increased

IL-2 expression, Th-2 cytokines were the predominant, perpetuating the chronic

inflammation. In addition to antiviral drugs, new immunomodulatory treatments have

been proposed to treat HIV or HCV, and cytokines may be an important marker of efficacy

(15)

(16)

Introdução

I - Introdução

1. Fundamentação Científica

Apesar de conhecidas relativamente há pouco tempo, a aids e a infecção pelo

vírus da hepatite C (VHC) têm se destacado como duas das mais importantes e

prevalentes doenças em todo o mundo, por gerar alta morbi-mortalidade e grande

impacto social e financeiro, mesmo em países mais desenvolvidos (1,2).

Desde os primeiros relatos em 1981, estima-se que aproximadamente 65 milhões

de pessoas se infectaram pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), sendo que dessas,

cerca de 25 milhões já morreram (1). Os países mais pobres, como muitos da África,

Sudeste Asiático e América Latina, concentram o maior percentual dessas mortes por

falta de recursos para estabelecer políticas de saúde pública adequadas para o

enfrentamento dessa epidemia, em especial, por não poderem sustentar programas de

acesso gratuito ao tratamento da aids (1).

Fato é que, após 1995, o surgimento da terapia antirretroviral combinada e

potente, denominada na língua inglesa de highly active antiretroviral therapy (HAART),

trouxe rápida diminuição na incidência das infecções oportunísticas, levando a uma

conseqüente redução da mortalidade relacionada à aids, nos países onde essa terapia foi

disponibilizada (3,4,5). Porém, com o aumento da sobrevida, muitas doenças crônicas

passaram a ter maior importância para as pessoas vivendo com HIV/aids (PVHA), com

destaque para as complicações da hepatite crônica pelo vírus C (HVC), condição bastante

prevalente nessa população.

Estima-se que cerca de 180 milhões de pessoas, ou cerca de 3% da população

mundial esteja infectada pelo VHC, sendo que 130 milhões com alto risco de desenvolver

cirrose e/ou carcinoma hepatocelular (2). A HVC é responsável por 50% a 76% de todos os casos novos de câncer de fígado e por dois terços dos transplantes hepáticos nos países

desenvolvidos (2).

Se a infecção isolada pelo HIV ou pelo VHC pressupõe alto risco à saúde do

(17)

Introdução

tratamento, a situação específica de coinfecção HIV/VHC traz particularidades ainda mais

complexas.

A prevalência da HVC em PVHA varia muito, dependendo, principalmente, do

modo de aquisição do HIV, mas em via de regra, é bem maior do que na população em

geral. Pelo fato dos dois vírus compartilharem os mesmos mecanismos de transmissão,

essa relação pode ser muito alta, como verificado em usuários de drogas ilícitas (91%) ou

em hemotransfundidos (71%), ou mesmo ser mais baixa (7%), como naqueles que tem

apenas fator de risco sexual, via não muito efetiva para transmissão do VHC (6).

Há, também, muitas variações regionais. No Brasil, estudos dessa prevalência

apontam índices de 14,3% em Belo Horizonte, MG (7), 17,7% em São Paulo, SP (8) e Vitória, ES (9), 37,0% em Santos, SP (10), 53,8% em Campinas, SP (11) e 58,3% em Florianópolis, SC

(12)_{. Nos Estados Unidos da América (EUA), diferentes centros de pesquisa têm taxas que}

variam de 16,1% até 74,2% (13,14,15,16). O EuroSIDA, importante estudo de coorte

observacional prospectivo, com mais de 9800 PVHA de países da Europa mais a

Argentina, revelou prevalência de 34,0%, porém, encontrando novamente grandes

diversidades nacionais (17).

Além de mais freqüente, a HVC pode ser considerada uma doença oportunista nas

PHVA, pois há aceleração de sua história natural, representada por elevação da carga viral

plasmática do VHC, fibrose hepática precoce e maior ocorrência de esteatose, cirrose e de

carcinoma hepatocelular (18,19,20,21,22). Como conseqüência, a morbi-mortalidade por

doença hepática terminal é maior nos indivíduos coinfectados pelo HIV/VHC em

comparação com monoinfectados pelo VHC (23).

A patogênese da infecção pelo VHC difere dos modelos clássicos de infecção por

vírus, reflexo da alta adaptação ao ser humano. Logo após o contágio, durante a fase

aguda, alguns mecanismos de escape do sistema imunológico do hospedeiro foram

descritos, como o efeito supressivo de antígenos virais sobre a resposta inata e

adaptativa, a influência de altas cargas virais já no início da infecção contrapondo a uma

resposta celular mais tardia, queda nas contagens de linfócitos TCD4, baixa efetividade

dos linfócitos TCD8, mutação em quasispecies, impedindo o reconhecimento pelos

(18)

Introdução

A soma desses fatores, a outros ainda não totalmente conhecidos, determina baixas taxas

de eliminação viral espontânea, o que ocorre em apenas 14% a 26% dos indivíduos

infectados (26).

Não havendo a cura espontânea na fase aguda, a maioria dos casos, cerca de 80%,

evolui para hepatite crônica, definida pela persistência do VHC após seis meses do

contágio. Como a infecção aguda geralmente é assintomática e as lesões causadas

durante a fase crônica são de instalação lenta, progressiva e silenciosa, o diagnóstico de

HVC torna-se difícil até que surja descompensação hepática ou hepatocarcinoma. Por

vezes a descoberta é mais precoce, mas de forma acidental, através de investigação

sorológica em doações de sangue ou exames de check-up.

Em cerca de um terço dos indivíduos com HVC, conhecidos como progressores

lentos, seguidos por 30 anos ou mais, a infecção parece não evoluir, cursando com

transaminases normais e lesões histológicas leves. Nos dois terços restantes, conhecidos

como progressores rápidos, a inflamação e a fibrose estão ativas, e em menos de 20 anos

pode haver evolução para cirrose e hepatocarcinoma (26,27).

A interação entre diversos fatores virais e imunológicos explica a persistência da

infecção, já que não há evidências de integração de material genético do VHC no

hospedeiro, pois nunca foi encontrado um DNA intermediário (28).

Os mecanismos que determinam as lesões encontradas na HVC não são

totalmente conhecidos. Inicialmente, existe controvérsia sobre a existência do efeito

citopático direto pelo VHC. Indivíduos com imunodepressão, como

hipogamaglobulinemia, coinfecção pelo HIV, transplante de medula, rins e fígado

apresentam maior taxa de hepatite crônica em atividade, além de maior viremia e

velocidade de evolução da lesão, fatores favoráveis à teoria de lesão direta pelo VHC.

Porém, em indivíduos imunocompententes a viremia não se relaciona com a gravidade

das lesões hepáticas (29).

Fatores intrínsecos do hospedeiro têm relação mais estreita com a progressão da

HVC, como gênero masculino, a idade acima de 40 anos, a raça negra e alguns

determinantes genéticos, assim como fatores extrínsecos como o uso abusivo de álcool, o

(19)

Introdução

A suscetibilidade genética está intimamente ligada ao desenvolvimento da

doença, desde o reconhecimento e apresentação do antígeno até o tipo de resposta T

helper à infecção pelo VHC (33). A resposta celular a polipeptídeos do core NS4 e NS5 parecem ser mais acentuada em indivíduos que eliminaram o VHC espontaneamente e

em respondedores ao tratamento com interferon. Já a resposta específica contra os

peptídeos da região NS3 promove a eliminação espontânea do VHC(34). Alguns alelos do

complexo principal de histocompatibilidade tipo II (MHC-II), como o DR5, têm sido

relacionados com menor incidência de cirrose em indivíduos cronicamente infectados

pelo VHC (33). A proteína viral core parece ter efeito imunomodulador, se ligando a um receptor de TNF-α e, conseqüentemente, inibindo a apoptose da célula infectada (35). Outro mecanismo antiapoptótico seria a inibição de um fator nuclear Kappa (NF-κβ) (36). Por outro lado, citocinas pró-inflamatórias estão associadas à resposta e à progressão das

lesões, e têm diferentes padrões de expressão individual.

Assim, a reposta imune tem papel principal no entendimento da patogênese dessa

infecção. Na HVC, já na primeira linha de defesa, a resposta inespecífica, alguns modelos

de estudo apontam que células natural killer (NK) são menos ativadas por células

dendríticas e também são inibidas em sua função pela ligação do vírus ao receptor CD81

(37,38)

. A ação do interferon tipo I (IFN I) α e β também se mostra prejudicada em outros

modelos, seja por diminuição da sensibilidade a essa citocina, ou por uma apresentação

de antígenos pelo MHC-II anômala, decorrente da inibição da indução do IFN I por

proteínas virais (39).

Em relação à resposta imune humoral, após a evasão da imunidade inata, há

produção de altos títulos de anticorpos contra vários epítopos virais, porém sem

capacidade de eliminação viral (39). A pressão seletiva exercida pelos anticorpos

neutralizantes estimula alta taxa de mutações nucleotídeas, e a conseqüente coexistência

de múltiplas quasispecies impedem a ação humoral específica, estratégia essa que ajuda a

perpetuar a infecção (40).

A resposta imune celular específica está relacionada tanto com a eliminação viral

(20)

Introdução

que estimulam a síntese de colágeno pelos fibroblastos e formação de fibrose (42). Há também indução de apoptose, e os restos celulares fagocitados por células estreladas

amplificam a produção de colágeno por TGF-β, aumentando a fibrose hepática (43).

Contudo, não há consenso entre os diversos estudos que objetivam determinar

qual é o perfil de citocinas relacionado com melhor ou pior prognóstico na HVC (44). Alguns trabalhos, utilizando determinação de citocinas no sangue periférico, apontam

que a resposta Th-1, definida principalmente pela produção de IL-2 e IFN-γ, se relaciona

com melhor controle da infecção e evolução mais benigna, e que o perfil Th-2,

determinado principalmente pela expressão de IL-4 e IL-10, é responsável pela

cronificação da infecção e progressão das lesões hepáticas (44, 45, 46, 47, 48). Outros estudos, com dosagem de citocinas no ambiente intra-hepático apontam resultados

absolutamente inversos, relacionando o perfil Th-1 com pior prognóstico (49, 50, 51). Uma hipótese para explicar essa disparidade seria a “compartimentalização” da resposta

imune, com perfil Th2 nos tecidos linfóides periféricos, e perfil Th1 no fígado, nos

pacientes com tendência de progressão da doença (44, 52).

Se a dinâmica imunopatogênica já é complexa em indivíduos monoinfectados pelo

VHC, na situação de coinfecção HIV/VHC poucos estudos abordam especificamente o

tema, sem, contudo, avaliar a correlação dos entre a resposta T específica e o

estadiamento da lesão hepática. Em indivíduos monoinfectados pelo HIV, sem

tratamento antirretroviral e com progressão da doença, observa-se predomínio do perfil

Th-0/Th-2, principalmente influenciados pelo aumento de IL-10 (53). Mesmo em indivíduos tratados com HAART, com carga viral plasmática do HIV (CV-HIV) indetectável ou não,

estudo realizado em nosso meio demonstrou não haver recuperação da capacidade de

expressão de perfil Th-1, sendo que esses pacientes exibiram em sua maioria perfil Th-0

maduro e baixos níveis de IL-2, sugerindo que a apoptose de linfócitos durante a evolução

da doença seja a responsável por esse fenômeno (54).

A progressão da HVC em PVHA é mais rápida e o prognóstico pior, como já

colocado anteriormente (18, 19, 20, 21, 22, 23). A carga viral do VHC em PVHA é maior, tanto no plasma, quanto em tecido hepático, sendo demonstrada, inclusive, replicação do VHC em

(21)

Introdução

Estudos recentes apontam que o TGF-β está especialmente alto nessa coinfecção,

justificando, portanto a instalação mais rápida de fibrose, já que essa citocina está

envolvida em processos pró-fibróticos (60,61). Adicionalmente, o TGF-β reduz a resposta de linfócitos T CD8 ao IFN-γ, favorecendo a persistência da infecção e impedindo a resposta T

específica (61, 62, 63). Em relação ao tratamento antirretroviral, há evidências que os pacientes coinfectados virgens de HAART apresentem tendência a exibir perfil Th-2 mais

freqüentemente do que os indivíduos tratados, sem, contudo diferenças significativas nos

níveis de TGF-β (61, 64).

Devido à escassez de estudos que correlacionem a expressão e secreção de

citocinas, tanto pró-inflamatórias, quanto indutoras de fibrogênese, na população

co-infectada pelo HIV/VHC, com os achados histopatológicos da biópsia hepática,

investigações nesse sentido se fazem necessárias a fim de estabelecer parâmetros que

possam predizer melhor ou pior prognóstico, ou mesmo, indicar de forma mais precisa a

(22)

Introdução

2 - Objetivos

- Comparar o perfil de citocinas por ELISA e por RT-PCR de coinfectados HIV/VHC,

com grupos de pacientes monoinfectados pelo HIV ou pelo VHC, bem como, com

um grupo de indivíduos normais.

- Comparar os perfis de citocinas por ELISA e por RT-PCR com a graduação de

fibrose observada na biópsia hepática em pacientes com coinfecção HIV/VHC e

monoinfectados pelo VHC.

- Comparar os achados histológicos entre biópsias hepáticas de coinfectados

HIV/VHC e indivíduos monoinfectados pelo VHC.

- Comparar os perfis de citocinas por ELISA com os valores obtidos por RT-PCR nos

pacientes coinfectados HIV/VHC e estabelecer a correlação e concordância entre

(23)

(24)

Casuística e Métodos

II. Casuística e Métodos

1 - Casuística

Foram estudados 61 pacientes, de ambos os sexos, atendidos no Serviço de

Ambulatórios Especializados e Hospital Dia Domingos Alves Meira (SAE/HD), unidade do

complexo médico-hospitalar da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp

(FMB-Unesp), no período entre outubro de 2008 e agosto de 2009. Além dos pacientes,

também foram estudados 10 doadores de sangue do Hemocentro do Hospital das Clínicas

da FMB-Unesp (HC Unesp).

2 - Métodos

Foi realizado estudo prospectivo de corte transverso não randomizado em

pacientes com coinfecção HIV/VHC, monoinfecção pelo HIV ou pelo VHC, além de

indivíduos normais, doadores de sangue.

2.A - Caracterização das Populações Estudadas

2.A.1 - Indivíduos com coinfecção HIV/VHC

Do total de indivíduos com infecção pelo HIV, foram selecionados 22 pacientes

que, inicialmente triados por sorologia reagente para o VHC, apresentaram também

detecção do ácido ribonucléico (RNA) desse vírus, por técnica de amplificação pela reação

em cadeia da polimerase qualitativa (RT-PCR).

Critérios de Inclusão

- ambos os sexos, idade maior que 18 anos completos;

- diagnóstico de infecção pelo HIV;

- estabilidade clínica e função hepática preservada;

- diagnóstico de infecção pelo VHC, confirmado por PCR;

- concordância e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE - anexo

(25)

Critérios de Exclusão

- idade menor que 18 anos completos;

- diagnóstico de infecção pelo HIV ou pelo VHC não confirmados;

- instabilidade clínica

- insuficiência hepática (Child-Pugh B ou C);

- presença de infecção inativa ou ativa pelo vírus da hepatite B (VHB);

- outras causas de imunossupressão;

- gestantes;

- não concordância com o TCLE.

2.A.2 Indivíduos Monoinfectados pelo HIV

Do total de indivíduos com infecção pelo HIV foram selecionados 17 pacientes, em

uso ou não de terapia antirretroviral. Esses indivíduos, necessariamente, tiveram

posterior exclusão, sorológica e por PCR qualitativo, de infecção pelo VHC.

- idade maior que 18 anos completos;

- diagnóstico de infecção pelo HIV;

- estabilidade clínica

- função hepática preservada;

- concordância e assinatura do TCLE.

- diagnóstico de infecção pelo HIV não confirmado;

- instabilidade clínica

- infecção pelo VHC ou presença de infecção inativa ou ativa pelo VHB;

- outras causas de imunossupressão ou gestantes;

(26)

2.A.3 - Indivíduos Monoinfectados pelo VHC

Do total de indivíduos com infecção pelo VHC foram selecionados 22 pacientes,

com confirmação do diagnóstico por PCR qualitativo, porém, sem tratamento específico

prévio. Esses indivíduos, necessariamente, tiveram posterior exclusão sorológica de

infecção pelo HIV.

- idade maior que 18 anos completos;

- diagnóstico de infecção pelo VHC, confirmado por PCR;

- função hepática preservada;

- concordância e assinatura do TCLE.

- diagnóstico de infecção pelo VHC não confirmado;

- infecção pelo HIV;

- presença de infecção inativa ou ativa pelo VHB;

- outras causas de imunossupressão;

- gestantes;

- não concordância com o TCLE.

2.A.4 Indivíduos Normais

Foram selecionados ao acaso 10 indivíduos normais, sem queixas espontâneas ou

sinais evidentes de doenças, doadores de sangue do Hemocentro de Botucatu - HC

(27)

2.B - Caracterização dos Grupos de Estudo

Grupo 1 (G1): 22 pacientes com coinfecção HIV/VHC;

Grupo 2 (G2): 22 pacientes monoinfectados pelo VHC;

Grupo 3 (G3): 06 pacientes com monoinfecção pelo HIV, com carga viral detectável;

Grupo 4 (G4): 11 pacientes com monoinfecção pelo HIV, com carga viral indetectável;

Grupo 5 (Grupo Controle): 10 indivíduos normais doadores de sangue.

2.C - Coleta de Parâmetros Clínicos e Laboratoriais da Rotina

Para a composição dos grupos de estudo, foram revisados todos os prontuários

médicos dos pacientes atendidos no SAE/HD para verificação do status sorológico para o

HIV-1 e para o VHC, bem como para coleta de parâmetros clínicos e laboratoriais da

rotina desse serviço, que permitiram a inclusão ou exclusão no presente estudo.

2.C.1 - Grupos 1: População com coinfecção HIV/VHC

Nos pacientes com diagnóstico sorológico confirmado de infecção pelo HIV-1, e

que também tiveram sorologia reagente para o VHC, foi verificado a confirmação dessa

coinfecção por PCR qualitativo, bem como a subseqüente genotipagem e subtipagem do

VHC. Foram, então, selecionados 22 pacientes com estabilidade clínica, preservação da

função hepática e exclusão de infecção ativa ou inativa pelo VHB.

Foi, então, observado o score relativo às alterações anátomo-patológicas da

biópsia hepática, o uso ou não de terapia antirretroviral, a contagem de linfócitos T CD4,

além da CV-HIV, em um mesmo momento. Nesse grupo de pacientes também foram

coletadas informações sobre sexo, idade, cor da pele, além dos valores de

(28)

2.C.2 - Grupo 2 – População com Monoinfecção pelo VHC

Nos pacientes com diagnóstico sorológico de infecção pelo VHC, foi verificada a

confirmação dessa infecção por PCR qualitativo, bem como a subseqüente genotipagem e

subtipagem do VHC. Foram, então, selecionados 22 pacientes sem tratamento específico

prévio e sem evidências de insuficiência hepática demonstrada clínica e/ou

laboratorialmente relacionados ou não à infecção pelo VHC, bem como, ausência de

marcadores sorológicos para HIV ou VHB.

Foi, então, observado o score relativo às alterações anátomo-patológicas da

biópsia hepática, e, também foram coletadas informações sobre sexo, idade, cor da pele,

além dos valores de aminotransferases.

2.C.3 - Grupo 3 e 4: População com Monoinfecção pelo HIV-1

Nos pacientes com diagnóstico sorológico confirmado de infecção pelo HIV-1, com

sorologia não reagente para o VHC, foi confirmada a exclusão desta coinfecção por PCR

qualitativo. Foram selecionados 17 pacientes com estabilidade clínica em relação à

infecção pelo HIV-1, em uso ou não de terapia antirretroviral, preservação da função

hepática e com exclusão de infecção ativa ou inativa pelo VHB.

Foram, também, observado a contagem de linfócitos T CD4, além da CV-HIV, em

um mesmo momento. Nesse grupo de pacientes também foram coletadas informações

sobre sexo, idade, cor da pele, além dos valores de aminotransferases.

2.D - Diagnóstico Laboratorial de Infecção pelo HIV-1

O diagnóstico de infecção pelo HIV-1 foi determinado de acordo com o fluxograma

estabelecido pelo Ministério da Saúde do Brasil, utilizando testes sorológicos (65). Esses testes fazem parte da rotina de acompanhamento de pacientes seguidos nos

ambulatórios do SAE/HD, sendo realizados pelo Hemocentro de Botucatu - HC

(29)

2.E - Diagnóstico Laboratorial de Infecção e Genotipagem do VHC

A investigação de infecção pelo VHC foi inicialmente realizada por testes

sorológicos. Em caso de reação não reagente, o paciente foi classificado como não

infectado pelo VHC, salvo em condições que permitam supor janela sorológica. Nos casos

de sorologia reagente ou inconclusivo, foi indicada a pesquisa de RNA do VHC por PCR

qualitativo (limite de detecção mínimo: 50 cópias/ml), sendo considerado como não

infectados pelo VHC aqueles indivíduos com dois testes com resultado não detectado

com intervalo mínimo de um ano. Nos casos de PCR qualitativo detectado, foi realizado

também a genotipagem do VHC.

Esses testes fazem parte da rotina de acompanhamento de pacientes seguidos nos

ambulatórios do SAE/HD, sendo que os testes sorológicos foi realizado pelo Laboratório

Clínico do HC FMB-Unesp, e o PCR qualitativo e a genotipagem do VHC, realizados pelo

Hemocentro de Botucatu - HC FMB-Unesp.

2.F - Caracterização de Estabilidade Clínica relacionada à infecção pelo HIV-1

Para inclusão no presente estudo, o indivíduo infectado pelo HIV-1 teve que

apresentar estabilidade clínica no momento da observação, caracterizada pela ausência

de infecções oportunistas decorrentes da imunossupressão causada pelo HIV-1, a saber:

pneumocistose, neurotoxoplasmose, candidíase esofágica, neurocriptococose,

criptosporidiose, histoplasmose disseminada, citomegalovirose disseminada, tuberculose

disseminada e micobacteriose atípica, entre outras.

A justificativa para os limites acima descritos é que a biópsia hepática tem como

principal função, indicar ou não o tratamento específico para a HVC, sendo que esse

tratamento tem sérios efeitos adversos, e conseqüentes contra-indicações,

principalmente na população infectada pelo HIV-1 com falha clínica.

2.G - Contagem de linfócitos T CD4

Foi observada a contagem de linfócitos T CD4, realizado pelo Hemocentro do HC

FMB-Unesp, utilizada na rotina do acompanhamento de pacientes infectados pelo HIV-1.

(30)

com marcador CD4+ foi a técnica de citometria de fluxo, com emprego do Coulter

Monoclonal, Antibodies, Reagents.

2.H - Determinação da Carga Viral Plasmática do HIV-1

A quantificação da CV-HIV foi determinada por técnica de bDNA, pelo kit HIV 3.0

RNA, tendo limites mínimos e máximos de detecção de 50 e 500.000 cópias/ml (log10 1,69

e 5,69), respectivamente. Esse exame é realizado na rotina dos indivíduos infectados pelo

HIV-1, pelo Hemocentro de Botucatu - HC FMB-Unesp.

2.I - Caracterização de Insuficiência Hepática

Os critérios utilizados para graduar insuficiência hepática foi a classificação de

Child-Pugh(66), representada nos quadros abaixo. Não foram incluídos no presente estudo aqueles indivíduos com estadiamento B ou C.

Classificação de Child-Pugh:

Pontuação 1 2 3 Unidade

Bilirrubina total < 2 2 - 3 > 3 mg/dL

Albumina Sérica > 3,5 2,8 – 3,5 < 2,8 mg/dL

RNI < 1,7 1,71 - 2,20 > 2,20 -

Ascite ausente Resolvida com medicação Refratária -

Encefalopatia

Hepática ausente Resolvida com medicação Refratária -

RNI: razão internacional de normalidade

Classe Pontuação

Sobrevida (anos)

1 2

A 5 - 6 100% 85%

B 7 - 9 81% 57%

(31)

As determinações de bilirrubina total e albumina no soro foram realizadas pelo

Laboratório Clínico do HC FMB-Unesp, e a RNI pelo Hemocentro desse HC. Esses exames

fazem parte da rotina de acompanhamento dos pacientes infectados pelo VHC no

SAE/HD.

2.J - Infecção pelo Vírus da Hepatite B

Não foram incluídos no presente estudo indivíduos com infecção ativa ou inativa

pelo VHB, sendo, portanto, desconsiderados aqueles com marcador sorológico AgHBs

reagente. Foram incluídos aqueles indivíduos que, eventualmente, sejam portadores

ocultos do VHB (AgHBs não reagente, anti-HBc reagente, anti-HBs reagente ou não), pois

além da baixa freqüência da detecção do DNA viral nessa situação, a replicação viral no

caso se faz em baixíssima velocidade, levando a pouca ou nenhuma agressão tecidual.

Os marcadores sorológicos para diagnóstico de VHB são solicitados na rotina do

SAE/HD para os pacientes infectados pelo HIV-1 e/ou pelo VHC, e realizados pelo

Laboratório Clínico do HC FMB – Unesp.

2.K - Biópsia Hepática e Classificação Anátomo-Patológica

2.K.1 - Critérios para indicação de biópsia hepática

A biópsia hepática é indicada na rotina do SAE/HD para todo indivíduo com

infecção pelo VHC confirmada por PCR qualitativo detectado, independente dos valores

das aminotransferases, e que não tenham contra-indicações ao procedimento e/ou ao

tratamento específico com interferon e ribavirina.

- Contra-indicações ao procedimento: hemoglobina sérica inferior a 10 g/dL,

contagem de plaquetas inferior a 75.000/mm3 e qualquer alteração no coagulograma. - Contra-indicações ao tratamento: consumo abusivo de álcool nos últimos seis

meses, consumo regular de drogas ilícitas, hepatopatia descompensada (Child-Pugh B ou

C), cardiopatia grave, doença tireoidiana descompensada, neoplasias, diabete melittus

tipo 1 de difícil controle ou descompensada, convulsões não controladas,

(32)

indivíduos infectados pelo HIV-1, também é necessário atingir estabilidade clínica, como

descrito no item 2.F deste capítulo.

2.K.2 - Procedimento da Biópsia

A biópsia hepática foi realizada por profissional médico da Seção de

Radiodiagnóstico do HC FMB - Unesp, no momento do exame ultrassonográfico de fígado.

Para tanto, o paciente foi colocado em divã clínico, em posição de decúbito dorsal

horizontal. Durante o exame, foi marcado o ponto para introdução da agulha de biópsia

entre os arcos costais, à direita, realizando-se, aí, antissepsia com Povidine® tópico. Foi utilizada anestesia local, com cerca de 10 ml de lidocaína a 2% sem vasoconstritor, no

ponto marcado para a biópsia. A seguir, a agulha de Trucut 16G para biópsia hepática foi

introduzida até atravessar a musculatura intercostal, extraindo o fragmento de fígado.

Retirada a agulha, o material da biópsia foi recuperado de sua luz, após lavagem com

água destilada, e imediatamente colocado em frasco contendo formol.

As amostras de tecido hepático foram processadas na rotina do Laboratório de

Anatomia Patológica do HC FMB - Unesp, sendo utilizadas as técnicas de

hematoxilina-eosina (HE), retículo e Masson, para o estadiamento histológico . É importante ressaltar

que a supervisão da equipe que realizou as leituras histopatológicas do material da

biópsia foram feitas, em todos os doentes, pela mesma profissional, médica patologista,

responsável pela Seção de Hepatologia do Departamento de Patologia da FMB - Unesp.

As amostras foram classificadas e estadiadas de acordo com a classificação METAVIR (67). Os pacientes submetidos à biópsia hepática foram internados e mantidos em

observação por período de seis horas, na Enfermaria de Moléstias Infecciosas e

Parasitárias do HC FMB - Unesp. Durante a internação, foram realizadas medidas de pulso

periférico, pressão arterial e exame físico de abdome, a cada hora. Os pacientes

receberam alta quando, após todos esses cuidados, não fossem verificados sinais ou

(33)

2.K.3 - Classificação das Alterações Histológicas Hepáticas (METAVIR)

A classificação das alterações histológicas das hepatites crônicas, utilizada no

presente estudo, foram propostas pelo grupo METAVIR em 1996, e observa os seguintes

parâmetros (67):

Alterações Estruturais (Fibrose)

0: ausência de fibrose;

1: expansão fibrosa portal, sem septos porta-porta;

2: expansão fibrosa portal, com poucos septos;

3: muitos septos, sem cirrose;

4: cirrose.

2.L - Determinação sérica de alanina-aminotransferase (ALT)

A determinação sérica de ALT foi realizada através do Método Química Seca, pelo

Laboratório de Análises Clínicas do HC FMB - Unesp, como parte da rotina de

atendimento ambulatorial dos pacientes infectados pelo HIV e/ou VHC no SAE/HD. A

coleta foi realizada no mesmo dia da biópsia hepática.

2.M - Determinação de citocinas séricas

Nos cinco grupos de estudo foi realizada a determinação das seguintes citocinas

séricas: IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α, INF-γ, TGF-β

Foram colhidos em tubo seco oito ml de sangue. Os soros obtidos foram

estocados em alíquotas sob refrigeração a - 80°C. Os níveis séricos das citocinas foram

determinados pelo método de ELISA, por meio de kits comerciais (R&D Systems).

Inicialmente, microplacas de 96 orifícios foram sensibilizadas com anticorpo

monoclonal anticitocina a ser dosada (IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α, IFN-γ e TGF-β). A seguir,

foram adicionados os soros testes (diluição 1:2) e dos controles positivo e negativo, que

foram então incubados à temperatura ambiente por duas horas. Após esse

procedimento, foram realizadas quatro lavagens com solução detergente contendo

(34)

substrato. Posteriormente, as placas foram incubadas à temperatura ambiente com

anticorpo policlonal anticitocina a ser dosada, conjugado com peroxidase. Após o período

de incubação, o substrato formado por peróxido de hidrogênio (0,02%) e

tetrametilbenzina (2%) foi adicionado aos orifícios das placas. A interrupção da reação foi

realizada à temperatura ambiente, utilizando-se ácido sulfúrico 2M. Os resultados foram

avaliados pela leitura da densidade óptica (DO) em leitor automático de ELISA (Titertek

Multiskan), em comprimento de onda de 450 nm. As concentrações das citocinas, em

pg/ml, foram calculadas a partir dos resultados em DO aplicados em curva padrão de

citocina recombinante utilizada como controle.

2.N - Quantificação relativa de mRNA por PCR em tempo real para citocinas

Nos cinco grupos de estudos foi realizada a quantificação relativa de mRNA por

PCR em tempo real das seguintes citocinas: INF-γ, IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α e TGF-β.

2.N.1 - Isolamento e cultura de células mononucleares totais

Foram coletados 20 ml de sangue periférico por punção venosa, e colocados em

tubo estéril, contendo 200 μL de heparina (Liquemine, Roche®). As células mononucleares

foram obtidas por meio de separação em gradiente de Ficoll-Hypaque. O anel rico em

linfócitos e monócitos foi lavado por duas vezes com meio de cultura RPMI 1640 (Gibco

Laboratories, Grand Island, N. Y.) por 10 minutos a 200 g, cada lavagem. Após este

período, a suspensão celular foi ressuspensa em meio de cultura RPMI 1640

suplementado com 2 mM de L-glutinina (Sigma Chemical Co., ST Louis, MO, USA), 40

μg/ml de gentamicina e 10% de soro sendo a identificação, a verificação de viabilidade e a

contagem realizadas utilizando corante Turk (alíquotas de 50 μl da suspensão celular

acrescidas de 50 μl da solução corante a 5%). A concentração celular foi ajustada para

2x106 células viáveis/ml após contagem em câmara hemocitométrica.

2.N.2 - Extração de RNA

(35)

extraído foi tratado com DNAse (RQ1 RNAse Free-DNAse, M6,101, Promega) para a

purificação do RNA, de acordo com as instruções do fabricante. O RNA obtido foi

quantificado com o auxílio de espectofotômetro NanoDrop (NP-1000) a 260 nm e 280 nm.

2.N.3 - Obtenção do cDNA

O cDNA foi sintetizado a partir de 1Pg de RNA total. Para cada 1 Pg de amostra de

RNA foram adicionados 4 μl de Tampão da reação, 1 μl da mistura de nucleotídeos

(dNTP-mix) 10 mM, 1 μl de Random Primers, 1 μl Superscript, 1 μl de inibidor de RNAse

(GeneAmp- Applied Biosystems), 1 μl DTT, 1ul RNAse H e H2O deionizada tratada com

0,1% de DEPC (dietilpirocarbonato).

Para a obtenção do cDNA, foi programado o aparelho Temociclador Mastercycler

(Eppendorf) por 25°C por cinco minutos, 50°C por 50 minutos, 70°C por 15 minutos e 37°C

por 20 minutos.

2.N.4 - RT-PCR

Para a detecção da produção de mRNA para as citocinas foram utilizados primers

específicos:

Forward Reverse

β-actina CTGGAACGGTGAAGGTGACA AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA

TNF-α CACGCTCTTCTGCCTGCTG GATGATCTGACTGCCTGGGC

TGF-β GGACACCAACTATTGCTTCAG TCCAGGCTCCAAATGTAGG

IFN-γ AGCTCTGCATCGTTTTGGGTT GTTCCATTATCCGCTACATCTGAA

IL-2 GAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCC GACACTGAAGATGTTTCAGTTCTGT

IL-4 AACAGCCTCACAGAGCAGAAGACT GCCCTGCAGAAGGTTTCCTT

(36)

Os primers foram desenhados utilizando o software IDSciTools (www.idtdna,com)

a partir de seqüência publicada no Genebank.

A reação de PCR em tempo real para a quantificação relativa de mRNA das

citocinas, foi desenvolvida no aparelho de PCR em tempo real modelo 7300 ( Applied

Biosystems, EUA) com o uso do kit Power Syber Green PCR Master Mix (Applied

Biosystems, EUA) conforme as instruções do fabricante, em um volume final de 20 μl,

com adição de 4 μl da amostra de cDNA (obtido conforme item 2.N.3) por reação e 300

nM de cada primer. As condições da reação foram: 95°C por 10 minutos, seguidos de 40

ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por um minuto, sendo os sinais de fluorescência

adquiridos nos passos de anelamento e extensão do ciclo de amplificação (60°C por um

minuto). Em todas as placas foi adicionado o cDNA de uma mesma amostra utilizada para

construção da curva padrão. Paralelamente, foi realizada a amplificação do gene da E

-actina, visto que o valor real de expressão gênica foi realizado através da comparação do

resultado da amplificação dos genes de interesses, e desse gene constitutivo. Os valores

de expressão relativa para cada amostra testada foi fornecida diretamente pelo programa

SDS versão 1.23, (Sequence Detection Systems 1.2.3 – 7300 Real Time PCR Systems-

Applied Biosystems, EUA), e posteriormente normalizados pelos valores de expressão

relativa da β-actina.

2.O - Análise Estatística

Para comparar as variáveis sexo, idade e cor da pele foi utilizado o teste χ2 e o teste exato de Fisher, com um nível de significância de p < 0,05.

Na análise das citocinas, foi calculado para o grupo controle (G5) média ( ) e

desvio padrão (σ). Os valores inferiores e superiores de normalidade das citocinas séricas

e por RT-PCR foram então calculados subtraindo e somando respectivamente dois desvios

padrão ( -/+ 2σ) dos valores de G5. A comparação entre os grupos também foi obtida

pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, ajustado pelo teste de Dunn, com o cálculo

das estatísticas H e p (com distribuição de χ2) e contrastes entre postos médios dos

(37)

Os perfis de citocinas séricas e por RT-PCR foram definidos por alteração de dois

desvios padrão em relação às médias normais de G5. Então, o perfil Th-1 foi definido

quando as médias de IL-2 e INF-γ foram maiores que dois desvios padrão do G5, e as

médias de IL-4 e IL-10 foram comparáveis ao G5. O perfil maduro Th-0 foi considerado

quando as médias de INF-γ e a IL-4 foram maiores que dois desvios padrão de G5,

independente da elevação de outras citocinas (IL-2 e/ou IL-10). O perfil Th-2 foi definido

quando as médias de IL-4 e a IL-10 foram maiores que dois desvios padrão do G5, e as

médias de IL-2 e o IFN-γ foram comparáveis ao G5. A mesma interpretação foi refeita com

os resultados obtidos pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, ajustados pelo teste

de Dunn. Essa linha de análise de perfil de citocinas foi também utilizada em outro

trabalho realizado em nosso meio (54).

3. Apreciação pelo Comitê de Ética em Pesquisa

O presente estudo foi submetido e aprovado pelo do Comitê de Ética em Pesquisa

da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, sob o protocolo Of. 243/2007-CEP

FMB/Unesp (anexos 2 e 3).

4. Registro de Ensaio Clínico

O presente estudo foi registrado no ClinicalTrials.gov sob o protocolo NCT

00499434 (anexo 4).

5. Financiamento e Apoio Institucional

O presente estudo recebeu financiamento da Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado de São Paulo (FAPESP), modalidade auxílio à pesquisa, processo nº 2007/56695-6

(anexo 5). Houve por contrapartida da Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp, o

fornecimento de insumos para a coleta das amostras, a retirada de prontuários médicos,

a análise estatística, a tradução para o inglês, a revisão da referência bibliográfica e a

(38)

(39)

Resultados

III - Resultados

1 - Homogeneidade entre os grupos

A distribuição dos 71 indivíduos estudados em relação ao gênero, idade e cor da

pele está apresentada na tabela 1.

Tabela 1: Distribuição dos 71 indivíduos estudados em relação ao sexo, idade e cor da pele. Porcentagem de ocorrências e médias. Estatísticas calculadas e comentários.

Sexo (Masculino %) Idade em Anos ( ) Cor da Pele (Branca %) n

G1 68,2% 39,1 81,8% 22

G2 68,2% 41,0 86,4% 22

G3 66,7% 37,3 100,0% 6

G4 63,2% 34,7 81,8% 11

G5 30,0% 33,9 100,0% 10

Total 62,0% 37,2 87,3% 71

Hipótese G1=G2=G3=G4=G5 G1=G2=G3=G4=G5 G1=G2=G3=G4=G5

Estatística χ 2 = 5,12 F = 1,14 χ 2 = 3,24

Significância p = 0,27 p = 0,34 p = 0,52

Comentários G1=G2=G3=G4=G5 G1=G2=G3=G4=G5 G1=G2=G3=G4=G5

G1: pacientes portadores da coinfecção HIV/VHC; G2: pacientes monoinfectados com o VHC; G3: pacientes monoinfectados pelo HIV com carga viral detectável; G4: pacientes monoinfectados pelo HIV com carga viral indetectável; G5: indivíduos doadores de sangue.

Em relação ao sexo, no total 62% dos indivíduos eram do sexo masculino e 38% do

feminino; no G1 e G2, 68,2% dos pacientes eram do sexo masculino e 31,8% do sexo

feminino; no G3, 66,7% dos pacientes eram do sexo masculino e 33,3% do sexo feminino;

no G4, 63,2% dos pacientes eram do sexo masculino e 36,8% do sexo feminino e, no G5,

30% dos indivíduos eram do sexo masculino e 70% do sexo feminino.

Em relação à idade, no total a média encontrada foi de 37,2 anos, no G1 a média

foi de 39,1 anos, no G2 a média foi de 41,0 anos, no G3 a média foi de 37,3 anos, no G4 a

média foi de 34,7 anos e, no G5, a média foi de 33,9 anos.

Em relação à cor da pele, no total 87,3% dos indivíduos se declararam brancos e

12,2% negros; no G1, 81,8% dos pacientes se declararam brancos e 18,2% negros; no G2,

(40)

Resultados

se declararam brancos; no G4, 81,8% dos pacientes se declararam brancos e 18,2%

negros; e no G5, 100,0% dos pacientes se declararam brancos.

2 - Linfócitos T CD4, carga viral plasmática do HIV, genótipo do VHC e fibrose hepática

2.A - Contagem de Linfócitos T CD4+

O gráfico 1 ilustra a distribuição dos valores de linfócitos T CD4 entre os grupos de

indivíduos portadores de infecção pelo HIV (Grupos 1, 3 e 4).

Gráfico 1: Distribuição dos valores de linfócitos T CD4+ entre os grupos de indivíduos

portadores de infecção pelo HIV (Grupos 1, 3 e 4).

0%

25%

50% 75% 100%

Grupo 1 Grupo 3 Grupo 4 Total

50% 33,3% 81,2% 56,5% 27,3% 33,3% 18,2% 25,6% 22,7% 33,3% 17,9%

> 351 201-350 < 200

CD₄

G1: pacientes portadores da coinfecção HIV/VHC; G3: pacientes monoinfectados pelo HIV com carga viral detectável;

G4: pacientes monoinfectados pelo HIV com carga viral indetectável. CD4: contagem de linfócitos T CD4+ em células/mm3.

Em G1, a distribuição dos valores de linfócitos T CD4 mostrou que na faixa menor

que 200 células/mm3 se concentraram cinco indivíduos (22,7%), na faixa entre 201 a 350 células/mm3, seis indivíduos (27,3%) e na faixa acima de 350 células/mm3, 11 indivíduos

(50%). Já no grupo 3, a distribuição dos valores de linfócitos T CD4 mostrou uma

concentração de dois indivíduos por faixa de variação de linfócitos T CD4 (33,3%). No

(41)

Resultados

valores de linfócitos T CD4 mostrou que na faixa menor que 200 células/mm3 se

concentraram sete indivíduos (17,9%), na faixa entre 201 a 350 células/mm3, 10

indivíduos (25,6%) e na faixa acima de 350 células/mm3, 22 indivíduos (56,5%).

2.B - Carga Viral Plasmática do HIV-1

O gráfico 2 ilustra a distribuição dos valores de carga viral plasmática do HIV-1

entre os grupos de indivíduos portadores de infecção pelo HIV-1 (Grupos 1, 3 e 4).

Gráfico 2: Distribuição dos valores de carga viral plasmática do HIV-1 entre os grupos de indivíduos portadores de infecção pelo HIV (Grupos 1, 3 e 4).

0% 25% 50% 75% 100%

Grupo 1 Grupo 3 Grupo 4 Total

68,2%

100%

63,9%

31,8%

100%

36,1%

CV Indetectável CV Detectável

G1: pacientes portadores da coinfecção HIV/VHC; G3: pacientes monoinfectados pelo HIV com carga viral detectável; G4: pacientes monoinfectados pelo HIV com carga viral indetectável. Cv: carga viral plasmática do HIV.

No grupo 1, sete indivíduos (31,8%) tiveram CV-HIV detectável, e 15 (68,2%)

indetectável. Os grupos 3 e 4 por definição tiveram 100% dos indivíduos com CV-HIV

detectável e indetectável, respectivamente. No total, 13 indivíduos (36,1%) tiveram

(42)

Resultados

2.C - Genótipos do VHC

O gráfico 3 ilustra a distribuição genotípica do VHC entre os grupos de indivíduos

portadores de infecção pelo VHC (Grupos 1 e 2).

Gráfico 3: Distribuição genotípica do VHC entre os grupos de indivíduos portadores de infecção pelo VHC (Grupos 1 e 2).

0% 25% 50% 75% 100%

Grupo 1 Grupo 2 Total

91%

63,7% 77,3%

9%

4,5% 9%

27,3% 18,2%

Genótipo 1 Genótipo 2 Genótipo 3

G1: pacientes portadores da coinfecção HIV/VHC; G2: pacientes monoinfectados pelo VHC.

No grupo 1, 20 indivíduos (91%) eram do genótipo 1 do VHC, enquanto 2 (9%)

eram do genótipo 3. Já no grupo 2, 14 indivíduos (63,7%) pertenciam ao genótipo 1, dois

indivíduos (9%) ao genótipo 2 e seis (27,3%) ao genótipo 3. No total, 34 indivíduos

(43)

Resultados

2.D - Fibrose Hepática

O gráfico 4 ilustra a distribuição de fibrose hepática (classificação METAVIR) entre

os grupos de indivíduos portadores de infecção pelo VHC (Grupos 1 e 2).

Gráfico 4: Distribuição da fibrose hepática (classificação METAVIR) entre os grupos de indivíduos portadores de infecção pelo VHC (Grupos 1 e 2).

0% 25% 50% 75% 100%

Grupo 1 Grupo 2 Total

4,5% 9% 6,8%

54,5% 59% 56,9%

32% 23% 27,3%

9% 9% 9%

Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4

Fibrose

G1: pacientes portadores da coinfecção HIV/VHC; G2: pacientes monoinfectados pelo VHC.

No grupo 1, um paciente (4,5%) exibiu grau 1 de fibrose hepática, 12 (54,5%)

tinham grau 2, sete (32%) grau 3 e dois pacientes (9%) grau 4. No grupo 2, dois pacientes

(9%) tinham grau 1 de fibrose hepática, 13 (59%) grau 2, cinco grau 3 (27,3%) e dois (9%)

(44)

Resultados

3 - Valores de referência de normalidade para as citocinas

A tabela 2 ilustra os valores de referência de normalidade das citocinas, que foram

calculadas a partir dos resultados do G5 (doadores de sangue).

Tabela 2: Valores estipulados como de referência de normalidade, com limites inferiores e superiores ( -/+ 2σ), baseados nos resultados encontrados no Grupo 5 (G5).

Média Desvio Padrão Limite Inferior Limite Superior RT PCR (mRNA)

TNF-α 22,40 5,36 11,68 33,12

IFN-γ 25,40 5,42 14,56 36,24

IL-2 23,80 4,29 15,22 32,38

IL-4 19,60 4,48 10,65 28,55

TGF-β 43,30 9,24 24,82 61,78

IL-10 19,80 4,87 10,06 29,54

ELISA (pg/ml)

TNF-α 109,30 14,61 80,09 138,51

IFN-γ 180,20 63,96 52,28 308,12

IL-2 130,30 40,86 48,57 212,03

IL-4 7,20 4,87 0,00 16,94

TGF-β 139,50 24,75 90,00 189,00

IL-10 11,70 5,77 0,15 23,25

G5: indivíduos doadores de sangue

Houve tendência de distribuição simétrica, permitindo o cálculo dos valores

inferiores e superiores de normalidade pelo desvio padrão, seguindo descrição contida no

(45)

Resultados

4 - Comparação entre as citocinas nos grupos de estudo e o grupo controle

4.A - Comparação pelos valores Limite Inferior e Superior e pelo teste estatístico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn

O quadro 01 mostra quais grupos diferiram do controle de acordo com cada

citocina estudada, quando se utilizou os valores Limite Inferior e Superior ou o teste

estatístico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn.

Quadro 1: Comparação dos valores de citocinas por RT-PCR e ELISA entre os grupos de estudo (G1, G2, G3 e G4) e o grupo controle (G5), utilizando o desvio padrão da

normalidade e pelo teste estatístico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn.

Desvio Padrão Kruskal-Wallis Dunn Citocina G1 G2 G3 G4 G1 G2 G3 G4

IFN-γ RT-PCR

ELISA

IL-2 RT-PCR Valores Superiores ao G5

ELISA Valores Equivalentes ao G5

IL-4 RT-PCR

ELISA

IL-10 RT-PCR

ELISA

TNF-α RT-PCR

ELISA

TGF-β RT-PCR

ELISA

G1: pacientes portadores da coinfecção HIV/VHC; G2: pacientes monoinfectados com o VHC; G3: pacientes monoinfectados pelo HIV com carga viral detectável; G4: pacientes monoinfectados pelo HIV com carga viral indetectável; G5: indivíduos doadores de sangue.

Quando as citocinas dos grupos de estudo foram comparadas ao grupo controle

utilizando os limites inferiores e superiores, o perfil das citocinas dosadas por RT-PCR

ficou do seguinte modo: INF-γ superior em G1, G2, G3 e G4; IL-2 superior em G4; IL-4

superior em G2, G3 e G4; IL-10 superior em G1, G2, G3 e G4; TNF superior em G1, G2, G3

e G4 e TGF-β superior em G1 e G2. Já o perfil de comparação dessas citocinas dosadas por

ELISA teve o seguinte resultado: INF-γ superior em G2; IL-4 superior em G1; G2, G3 e G4;

(46)

Resultados

Quando a comparação foi realizada se utilizando o teste estatístico de

Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn, o perfil das citocinas dosadas por RT-PCR ficou do

seguinte modo: INF-γ superior em G1, G2; IL-2 superior em G4; IL-4 superior em G2, G3 e

G4; IL-10 superior em G1, G3 e G4; TNF superior em G1, G2 e TGF-β superior em G1 e G2.

Já o perfil de comparação dessas citocinas dosadas por ELISA teve o seguinte resultado:

INF-γ superior em G2; IL-4 superior em G2, G3 e G4; IL-10 superior em G1, G2, G3 e G4;

TNF superior em G1, G2 e TGF-β superior em G1 e G2.

4.B - Comparação entre IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10 e interpretação do perfil imune

O quadro 2 ilustra especificamente o comportamento das citocinas mais

intimamente ligadas à caracterização dos perfis de resposta imune Th-1, Th-2 e Th-0

maduro, e sua interpretação.

Quadro 2: Comparação dos valores de IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10 por RT-PCR e ELISA entre os grupos de estudo (G1, G2, G3 e G4) e o grupo controle (G5), utilizando o desvio padrão da

normalidade e pelo teste estatístico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn.

Interpretação do perfil de resposta imune Th-1/Th-2.

IFN-γ IL-2 IL-4 IL-10

Grupo _{DP KD DP KD DP KD DP KD DP KD DP KD DP KD DP KD}RT-PCR ELISA RT-PCR ELISA RT-PCR ELISA RT-PCR ELISA Perfil

G1 Th-2

G2 Th-0/Th-2

G3 Th-2

G4 Th-2

Valores Superiores ao G5 Valores Equivalentes ao G5

G1: pacientes portadores da coinfecção HIV/VHC; G2: pacientes monoinfectados com o VHC; G3: pacientes monoinfectados pelo HIV com carga viral detectável; G4: pacientes monoinfectados pelo HIV com carga viral indetectável; G5: indivíduos doadores de sangue; DP: cálculo pelo desvio padrão da normalidade; KD: teste estatístico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn.

O G1 teve IFN-γ superior ao G5 apenas quando dosado pelo RT-PCR, e a IL-2 se

mostrou equivalente pelos dois métodos, enquanto a IL-4 estava aumentada pelo ELISA

quando utilizado a análise pelo desvio padrão da normalidade, e a IL-10 se mostrou

aumentado por todos os meios. Tal comportamento foi interpretado como mais

(47)

Resultados

No G2 o IFN-γ foi superior por todas as análises, e a Il-2 se mostrou equivalente

pelos dois métodos, enquanto a IL-4 foi superior por todas as análises, o mesmo

acontecendo com a IL-10, com exceção da dosagem pelo RT-PCR utilizando o teste

estatístico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn. Tal comportamento foi

interpretado como intermediário entre Th-0 e Th-2.

Já no G3 o IFN-γ foi superior ao G5 apenas quando dosado pelo RT-PCR na análise

pelo desvio padrão da normalidade, enquanto a IL-4 foi superior por todas as análises, o

mesmo acontecendo com a IL-10. Tal comportamento foi interpretado como mais

compatível com o perfil Th-2.

Finalmente no G4, o IFN-γ foi superior ao G5 apenas quando dosado pelo RT-PCR

na análise pelo desvio padrão da normalidade, e a IL-2 se mostrou superior quando

dosada por RT-PCR, enquanto a IL-4 foi superior por todas as análises, o mesmo

acontecendo com a IL-10, com exceção da dosagem pelo RT-PCR utilizando o teste

estatístico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn. Tal comportamento foi

(48)

Resultados

4.C - Comparação individual entre as citocinas nos grupos de estudos e no grupo controle

4.C.1 - IFN-γ

Os gráficos 5 e 6 mostram a distribuição dos valores de IFN-γ dosados por RT-PCR

e ELISA respectivamente nos grupos estudados.

Gráficos 5 e 6: Distribuição dos valores de IFN-γ dosado por RT-PCR e ELISA respectivamente, nos grupos estudados.

pg/

m

l

G1 > G3/G4/G5 G2 > G5

*p < 0,05

G2 > G1/G3/G4/G5 *p < 0,05

RT-PCR ELISA

G1: pacientes portadores da coinfecção HIV/VHC; G2: pacientes monoinfectados com o VHC; G3: pacientes monoinfectados pelo HIV com carga viral detectável; G4: pacientes monoinfectados pelo HIV com carga viral indetectável; G5: indivíduos doadores de sangue. Estatística: Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn.

Analisando a distribuição dos valores de IFN-γ dosados por RT-PCR, o resultado é

que G1 tem valores significativamente maiores que G3, G4 e G5, e que G2 tem valores

maiores que G5. Já pela dosagem sérica do IFN-γ por ELISA, os valores de G2 foram

(49)

Resultados

4.C.2 - IL-2

Os gráficos 7 e 8 mostram a distribuição dos valores de IL-2 dosados por RT-PCR e

ELISA respectivamente nos grupos estudados.

Gráficos 7 e 8: Distribuição dos valores de IL-2 dosado por RT-PCR e ELISA respectivamente, nos grupos estudados.

pg/

m

l

G4 > G1/G2/G5 *p < 0,05

G4 > G1 *p < 0,05

Analisando a distribuição dos valores de IL-2 dosados por RT-PCR, o resultado é

que G4 tem valores significativamente maiores que G1, G2 e G5. Já pela dosagem sérica

(50)

Resultados

4.C.3 - IL-4

Os gráficos 9 e 10 mostram a distribuição dos valores de IL-4 dosados por RT-PCR e

ELISA respectivamente nos grupos estudados.

pg/

m

l

G2/G3 > G1/G5 G4 > G5

*p < 0,05

G2/G3/G4 > G1/G5 *p < 0,05

que G2 e G3 têm valores significativamente maiores que G1 e G5, e que G4 tem valores

maiores que G5. Já pela dosagem sérica do IL-4 por ELISA, os valores de G2, G3 e G4

(51)

Resultados

4.C.4 - IL-10

Os gráficos 11 e 12 mostram a distribuição dos valores de IL-10 dosados por

RT-PCR e ELISA respectivamente nos grupos estudados.

pg/

m

l

G1/G3 > G5 *p < 0,05

G1 > G2/G4/G5 G2/G3 > G5

*p < 0,05

que G1 e G3 têm valores significativamente maiores que G5. Já pela dosagem sérica da

IL-10 por ELISA, os valores de G1 foram superiores ao G2, G4 e G5 e os de G2 e G3

(52)

Resultados

4.C.5 - TNF-α

Os gráficos 13 e 14 mostram a distribuição dos valores de TNF-α dosados por

Gráficos 13 e 14: Distribuição dos valores de TNF-α dosado por RT-PCR e ELISA respectivamente, nos grupos estudados.

pg/

m

l

G1 > G4/G5 G2 > G5

*p < 0,05

G1 > G2/G4/G5 G2 > G5

*p < 0,05

Analisando a distribuição dos valores de TNF-α dosados por RT-PCR, o resultado é

que G1 tem valores significativamente maiores que G4 e G5, e que G2 tem valores

maiores que G5. Já pela dosagem sérica do TNF-α por ELISA, os valores de G1 foram

(53)

Resultados

4.C.6 - TGF-β

Os gráficos 15 e 16 mostram a distribuição dos valores de TGF-β dosados por

Gráficos 15 e 16: Distribuição dos valores de TGF-β dosado por RT-PCR e ELISA respectivamente, nos grupos estudados.

pg/

m

l

G1/G2 > G3/G4/G5 *p < 0,05

Analisando a distribuição dos valores de TGF-β dosados por RT-PCR, o resultado é

que G1 e G2 têm valores significativamente maiores que G3, G4 e G5. Os mesmo

(54)