INTRODUÇÃO
:A análise de loci de características quantitativas (Quantitative trait loci analysis - QTL) tem demonstrado ser uma poderosa ferramenta para o estudo de características agronômicas complexas em plantas, mostrando uma precisão muito maior do era possível anteriormente na análise genética destas características (Paterson, 1998). A abordagem de mapeamento de QTLs tem permitido a descrição do número, efeito genético e posição cromossômica de genes determinantes de algumas características agronômicas importantes (Bushman et al., 2002; Jampatong et al., 2002; de Vienne et al, 1999; Vigouroux et al., 2002).
Loci de características quantitativas e mapeamento de QTLs
Uma característica quantitativa é definida como uma característica com distribuição contínua. A avaliação destas características é geralmente obtida por métodos de medidas ao invés de métodos de contagem. As características quantitativas são geralmente controladas por vários genes, cada gene tendo um pequeno efeito na determinação da característica (Liu, 1998).
Alguns mecanismos de resistência de plantas a doenças são geneticamente simples e tem sido bastante estudados por métodos genéticos tradicionais (Hulbert & Michelmore, 1985; Jorgensen & Moserman, 1972). Mas, muitas formas de resistência são consideradas como característica quantitativa complexa, onde vários genes respondem por esta resistência. Neste tipo de característica de resistência, como em qualquer outra característica quantitativa, os genes interagem entre si e também com o meio ambiente e esse conjunto de interações é que irá determinar a característica fenotípica. Estes genes apresentam padrão de herança complexa, de forma que estas características não podem ser totalmente entendidas por experimentos de genética qualitativa (Doerge, 2002). Para o estudo destes tipos de características complexas, onde a variação é baseada na interação cumulativa entre os alelos positivos
e negativos dos genes, o mapeamento de QTLs tem se mostrado uma abordagem bastante eficaz (Geiger & Geun, 1989; Frey et al., 1997).
Um locus de característica quantitativa se refere a um locus genético identificado através de análises estatísticas da característica complexa em estudo como, por exemplo, a resistência de plantas a doenças. A estratégia de mapeamento de QTLs se baseia na construção de mapas genéticos e no estudo das relações entre a característica estudada e os marcadores moleculares presentes no mapa. Estes marcadores representam sítios de heterozigose para algum tipo de variação silenciosa de DNA e podem ser usados nas análises de mapeamento assim como alelos de heterozigotos convencional. Funcionam como sítios e pontos de referência para a localização da QTL no cromossomo (Liu, 1998).
Uma associação significativa (determinada por análises estatísticas) entre a característica de interesse e os marcadores moleculares pode evidenciar, nas proximidades destes marcadores, um locus que estaria determinando essa característica de resistência quantitativa (Liu, 1998). Em resumo, um QTL é uma região do genoma responsável pela variação de uma característica quantitativa de interesse (Doerge, 2002). Desta forma, com o mapeamento de QTLs, é possível localizar os genes que estão determinando esta característica, descrever e entender as regras para: a resistência de loci específicos, a resistência parcial raça-específica e interações entre os genes de resistência, desenvolvimento vegetal e também interação destes genes com meio ambiente (Young, 1996).
A estratégia de mapeamento de QTLs tem sido amplamente utilizada para o estudo de diferentes características complexas, em especial aquelas determinantes de fenótipos agronômicos interessantes economicamente como o peso de grãos (Stuber, 1995), resistência a doenças e insetos (Ramalingam et al, 2002; Byrne et al., 1996), para o estudo da via metabólica de formação de flavonóides em milho (McMullen, et al., 1998)
DIMBOA e sua relação com a resistência em plantas
Os metabólitos secundários são importantes componentes que participam do mecanismo de defesa em plantas e funcionam como pesticidas naturais.Os ácidos hidroxâmicos cíclicos DIBOA (2,4- dihydroxy-2H- 1,4-benzoxazin-3(4H)-one) e DIMBOA (2,4-dihydroxy-7-methoxy-2H-1,4-benzoxazin- 3(4H)-one) desempenham um papel importante como agentes químicos de defesa em cereais contra fungos, bactérias patogênicas e insetos predadores (Frey et al., 1997; Sicker et al., 2000). Nas plantas intactas, estes ácidos benzoxazinoides existem predominantemente como 2-β-O-D-glicosídeos, a sua
forma estável. Estes glicosídeos são praticamente inativos biologicamente, mas em situação de injúria de tecidos, eles são enzimaticamente convertidos a agliconas, sua forma ativa, através da ação de β-
glicosidases (Argandona et al., 1981; Massardo et al., 1994; Hashimoto & Shudo, 1993; Macías et al., 2005).
O composto DIMBOA é um dos bezoxazinoides agliconas mais estudados (Long et al., 1975; Corcuera et al., 1978; Niemeyer, 1988; Larsen & Christensen, 2000; Oikawa et al., 2002; Gierl & Frey, 2001). Este é o ácido benzoxazinoide de principal ocorrência em milho e trigo e sua via de biossíntese (Figura 11) ocorre a partir de uma ramificação da via do triptofano. O idol é o último intermediário comum entre as duas vias (Figura 12) (Melanson et al., 1997). O DIMBOA é tóxico para uma grande variedade de insetos, bactérias e fungos (Glenn et al., 2002), Agrobacterium tumefaciens (Sahi et al., 1990), contra as brocas de milho européia e asiática (Campos et al., 1989; Barry et al., 1994) contra o western corn rootworm (Xie et al., 1990) e contra insetos afídeos (Escobar et al., 1999; Bravo et al., 2004). O DIMBOA age contra estes patógenos e insetos, inibindo proteases e enzimas oxidativas (Niemeyer, 1988). Além disso, já foi demonstrado que o composto DIMBOA e outros benzoxazinoide aglyconas são aleloquímicos bastante fortes (Barnes & Putnam, 1987; Perez, 1990; Bravo &Lazo, 1996), e possuem atividade mutagênica (Hashimodo & Shudo, 1993). Estes dados mostram claramente
que o composto DIMBOA e os benzoxazinoide aglyconas similares são de grande importância para a agricultura como compostos de defesa químicos.
Figura 12: Via de formação de DIMBOA e triptofano, mostrando a ramificação e a formação das duas vias em separado a partir do Indol.
Os genes responsáveis pela codificação das enzimas da via de síntese do DIMBOA a partir de indol já foram clonados, caracterizados e, através de mapeamento, foi mostrado que estes genes se encontram posicionados no cromossomo quatro de milho (Melanson et al., 1997). Apesar disso, nada se sabe a respeito dos fatores de transcrição que regulam a via de síntese deste composto. Neste trabalho nós utilizamos a estratégia de mapeamento de QTL/ genes candidates, para procurar os loci candidatos para estes fatores de transcrição. Nosso primeiro objetivo foi identificar o QTL mais significativa em uma população de milho originada de um cruzamento entre linhagens com alta e baixa produção de DIMBOA e comparar sua (s) posição (ões) com as dos genes estruturais para analisar o quanto de variação genética poderia ser atribuída aos genes codificadores destas enzimas. Os QTLs mais
significativos que não estivessem ligadas aos genes estruturais seriam consideradas loci candidatos para os fatores de transcrição e regulação das enzimas desta via.