Estudo dos mecanismos de defesa de plantas de milho atraves das abordagens de analise proteomica e mapeamento de QTLs

UNIDADE

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA

BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE BIOLOGIA

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Silva, Adriana Moreira da Silva e

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U defesa de plantas de milho (Zea mays), genótipos resistente e suscetível ao

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Orientador: Sérgio Marangoni.

Tese (Doutorado)- Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia.

1. Milho - Genética.! 2. Pucciniapolysora. 3. Ferrugempolissora do milho. 4. Proteoma. 5. Mapeamento de QTL. I. Sérgio Marangoni. 11. UniversidadeEstadual de Campinas. Instituto de Biologia. ID. Título.

Aos meus maiores incentivadores Meus pais e meu irmão, Lu.

Agradecimentos

Ao Prof. Sérgio Marangoni, pela confiança e por ter apostado no meu potencial como pesquisadora.

Ao Prof. Michael McMullen, pela oportunidade na Universidade do Missouri e pelos valiosos conhecimentos ensinados sempre com tanta paciência e dedicação. E a todos os amigos e companheiros de sua equipe: Jenelle, Chris, Masanori, Sherry, Kate, Jim and Arthuro.

Aos amigos do LAQUIP-UNICAMP, Sil, Glau, Zeca, Dani, Luzia, Paulinho e todos os demais, pelo companheirismo, amizade.

À Bibi pela força nos momentos estressantes, pelo empenho na realização dos experimentos, pela amizade e pelo excelente trabalho.

Á meus pais e meu irmão pelo apoio constante.

A todos que estiveram presentes comigo nesta caminhada e que de alguma forma contribuíram para o sucesso deste trabalho.

“A coisa mais bela que o homem pode experimentar é o mistério. É essa a emoção fundamental que está na raiz

de toda a ciência e toda a arte.”

RESUMO

As plantas são capazes de responder e resistir ao ataque de patógenos ativando uma diversidade de estratégias de defesa. A maioria delas exibe uma estratégia geral onde são ativadas respostas bioquímicas de maneira coordenada, incluindo a reprogramação do metabolismo celular, o reforço das barreiras celulares e produção de compostos antimicrobianos e proteínas que agem diretamente sobre o patógeno. Mas existem também respostas específicas das plantas a determinados patógenos, onde são ativadas vias de defesa específicas.

Apesar da crescente quantidade de dados em literatura descrevendo genes envolvidos na patogênese vegetal, pouco se sabe sobre as modificações ao nível de proteoma associadas com estas interações. Neste trabalho é apresentado um estudo proteômico comparativo de plantas de milho, de dois genótipos contrastantes em relação à resistência ao fungo Puccinia polysora, em que foram caracterizadas as diferenças no perfil de expressão de proteínas em sementes dos dois genótipos. Através de uma ampla caracterização dos perfis de proteína por diferentes métodos eletroforéticos, foram reveladas 12 proteínas diferencialmente expressas no genótipo de maior resistência. Destas, 5 foram identificadas por espectrometria de massas por MALDI-TOF, sendo 3 delas identificadas como proteínas com atividade de defesa: uma lipoxigenase de 96 kDa, uma proteína Vicilin-like de 66 kDa e uma proteína Heat-Shockde 70 kDa. No segundo capítulo da tese, apresentamos um estudo complementar de mapeamento de QTLs em plantas de milho para a identificação dos genes reguladores da síntese de DIMBOA, um composto secundário que atua na defesa de plantas contra fungos e insetos. Neste estudo foi construído um mapa genético de ligação de uma população F2 resultante do cruzamento de uma linhagem com alta produção de DIMBOA e outra linhagem de baixa produção deste composto. O mapa, com um tamanho total de 1432,9 centimorgans, foi construído com 123 marcadores SSR. Com este mapa foi possível identificar quatro QTLs potencialmente relacionadas com a regulação da via de síntese de

DIMBOA, sendo uma no cromossomo 1 (bin 1.08), duas no cromossomo 6 (bin 6.01 e bin 6.02) e uma no cromossomo 10 (bin 10.05).

ABSTRACT

Plants have the ability to respond to invasion by pathogens through activation of a variety of defense strategies. Most plants exhibit a general defense strategy in which a wide range of biochemical responses are induced in a coordinated manner, including reprogramming of cellular metabolism, accumulation of barrier-forming substances and production of antimicrobial compounds and proteins that act directly to prevent pathogen invasion. Some plants show also specific pathogen responses, in a different strategy pathway.

Although there is an increasing amount of literature dealing with genes involved in bacterial and fungal pathogenesis, very few reports have addressed proteome modifications associated with such interactions. In the present work we show a comparative proteomic analysis of maize plants, resistant and susceptible genotypes to Puccinia polysora fungi infection and the characterization of differences in protein expression profiles of seeds. Protein profiles of both genotypes were analyzed by a broad range of electrophoresis methods and we could identify 12 proteins differentially expressed in resistant genotype. Five of them were identified by MALDI-TOF mass spectrometry and 3 of them were identified as defense related proteins, a 96 kDa lipoxygenase, 66 kDa Vicilin-like protein and 70 kDa Heat-Shock protein. We also present a complementary study of QTL mapping for identification of regulatory genes controlling DIMBOA synthesis in maize. In this study is shown a linkage map of a F2 population resultant from crossing between two maize lines presenting high DIMBOA production and low DIMBOA production. This map presents 1432,9 centimorgans and was constructed using 123 SSR markers. Using this map we could identify four QTLs possibly related with DIMBOA production, one QTL on bin 1.08 of chromossome 1, two QTLs on bins 6.01 and 6.02 on chromossome 6, and one last QTL on bin 10.05 on chromossome 10.

ÍNDICE

Resumo………vii

Abstract………ix

Introdução geral………..1

Análise de proteomas vegetais

………...….2

Mecanismos de defesa vegetal

...3

A proteômica no estudo de interação planta-patógeno e respostas de defesa vegetal...6

Análise Genética de proteomas vegetais...7

O Modelo Biológico: Milho...8

O Fungo Puccinia polysora...11

Capítulo I -

………...…………14

Material e Métodos...15

Material Biológico...15

Métodos Extração das proteínas de sementes...15

Fracionamento das proteínas totais de sementes...15

Dosagem de proteínas...16

Eletroforese PAGE nativo, desnaturante e Tricina...16

Geração dos peptídeos trípticos e análise por Espectrometria de massas...17

Análise dos dados spectrométricos...17

Análise da expressão gênica – Northern blot...17

Resultados...19

Perfis das proteínas de sementes...19

Identificação das proteínas diferenciais por Espectrometria de massas MALDI-TOF...24

Análise da Expressão Gênica...25

Capítulo II -

………...…………28

Introdução...………...….29

Loci de características quantitativas e mapeamento de QTLs...29

DIMBOA e sua relação com a resistência em plantas...31

Material e Métodos...35 Material Biológico...35 Métodos Extração de DNA...35 Quantificação do DNA...36 Genotipagem por SSR...36 Condições de PCR...36

Eletroforese em gel de agarose...37

Eletroforese capilar automatizada...37

Análise dos dados fenotípicos ...37

Análises e determinação de QTLs ...39

Resultados...40

Análises dos traços fenotípicos...40

Mapa de Ligação SSR ...41

Análise de QTL para o conteúdo de DIMBOA ...43

Análise de QTL para o conteúdo de ácidos benzoxazinoides TOTAIS...43

Análise de QTL para os conteúdos de MBOA e HBOA ...43

Modelo de locus múltiplo (MLM) ...44

Mapeamento da população 2...45

Discussão e Conclusões gerais...46

Perspectivas...53

LISTA DE ABREVIATURAS

CIM – Composite interval mapping cM – centimorgan

HR – resposta hipersensível HSP –heat shock protein

LOD - log10 da proporção da taxa de probabilidade MLM – modelo de locus múltiplo

PAGE – gel de eletroforese em poliacrilamida PCR – reação de polimerase em cadeia

PMF (peptide mass fingerprinting) – impressão digital da proteína QTL – Loci de tcaracterísticas quantitativas

SAR – resistência sistêmica adquirida

INTRODUÇÃO GERAL:

Os estudos de análise e sequenciamento de genomas, iniciado nos anos 90, desenvolveram-se rapidamente e atualmente encontram-se disponíveis as seqüências de genes de organismos inteiros, como plantas, animais e até mesmo o genoma humano. Porém, com esta abordagem, não é possível conhecer muito da função dos genes (Hirano et al., 2004). Esta rápida e crescente disponibilização de dados genômicos despertou grande interesse científico e a busca pelo conhecimento das funções destes genes e seu modo de atuação. Em paralelo a esta disponibilização de dados genômicos, foram desenvolvidas outras técnicas para o estudo de análise dos transcritos de RNAm (análise de transcriptomas) e mais tarde de análise do conjunto de proteínas expressas (análise de proteomas) (Cánovas et al., 2004)

O proteoma de um organismo reflete o conjunto de proteínas expressas por este organismo em determinada situação e, ao contrário do genoma, não é estático e pode se modificar dependendo das condições a que este organismo está exposto. Desta forma, o proteoma reflete a expressão das moléculas que influenciam mais diretamente a bioquímica e o funcionamento celular. Ao estudo da estrutura, função e o controle dos sistemas biológicos pela análise das várias propriedades das proteínas é que chamamos proteômica ou análise de proteomas. A análise proteômica inclui também os estudos da seqüência (identidade), abundância, atividade e estrutura das proteínas expressas por uma célula, assim como as modificações, interações e translocações sofridas pelas proteínas (Williams & Hochstrasser, 1997).

Embora o conceito de proteoma seja relativamente novo, este estudo se utiliza de técnicas de separação de proteínas já desenvolvidas a bastante tempo como a eletroforese bidimensional (O´Farrel, 1975). Nesta técnica, as proteínas são separadas primeiramente pelo pI (1a dimensão) e depois pela massa molecular em um gel de SDS-PAGE (2a dimensão), o que permite a visualização de centenas de proteínas. O desenvolvimento e melhoramento desta técnica, juntamente com o surgimento de técnicas

modernas de identificação de proteínas por espectrometria de massas na última década (Yates, 1998), foi o que possibilitou o avanço no estudo de proteínas em larga escala e do surgimento do conceito de análise de proteomas (Tyers & Mann, 2003). Os estudos de análise de proteoma vêm complementar os dados de análise de transcriptomas e sequenciamento de genomas, auxiliando na compreensão das redes de funcionamento e regulação celular, representando a ponte de ligação entre o genótipo e o fenótipo de um organismo (Patterson & Aebersold, 2003).

Análise de proteomas vegetais

O recente término do primeiro sequenciamento do genoma de uma planta, a Arabidopsis thaliana (Arabidopsis Genome Initiative, 2000), reforçou o interesse na identificação sistemática dos produtos gênicos vegetais. A disponibilização destas informações genéticas e o progresso tecnológico no estudo de proteínas, através da implementação de métodos rápidos e acurados para a identificação e análise do padrão de proteínas como a espectrometria de massas e a eletroforese bidimensional, fizeram com que a análise proteômica se tornasse uma poderosa ferramenta para estudos sobre a fisiologia e a genética de plantas (Rossignol, 2001, Holtorf et al., 2002).

Apesar de a análise de proteomas vegetais representar um desafio maior do que o estudo de proteomas de outros organismos, devido à dificuldades na preparação das amostras, esta abordagem tem sido amplamente utilizada e com sucesso para o estudo global (proteoma total) de plantas (Koller et al., 2002), como também para estudos específicos de tecidos (Bahrman et al., 2004; Porubleva et al., 2001; Méchin et al., 2004), organelas (Millar et al., 2005; Lonosky et al., 2004), interações simbióticas (Panter et al., 2000) e interações planta-patógeno (Smolka et al., 2003; Campo et al., 2004; Jones et al., 2004).

Mecanismos de defesa vegetal

As plantas possuem a habilidade de sobreviver aos diferentes tipos de stress a que está exposta pela natureza. Uma das formas mais severas de stress é a infecção por patógenos como fungos, bactérias e vírus, uma vez que as plantas não apresentam células especializadas e um sistema imune como o dos animais. Porém, os vegetais desenvolveram ao longo do processo evolutivo, mecanismos que os permitem sobreviver e se proteger das infecções e ataques por patógenos (Peumans & Van Damme, 1995; Maleck & Dietrich, 1999; Valueva & Mosolov, 2004).

Basicamente, os mecanismos de defesa em plantas podem ser divididos em mecanismos passivos e ativos. O sistema de defesa passivo é baseado em adaptações morfológicas e bioquímicas, como a existência da parede celular vegetal, o tegumento de sementes e a produção de compostos tóxicos como alcalóides que funcionam como toxinas e até mesmo como sinalizadores para o disparo da resposta ativa (Peumans e Van Damme, 1995). A resposta de defesa ativa é caracterizada por uma interação dita incompatível entre patógeno e planta, em que a célula vegetal reconhece moléculas ou elicitores produzidos pelo patógeno e então dispara uma série de respostas que evolvem a produção de moléculas sinalizadoras, compostos secundários e proteínas (Thomma et al., 2001).

Uma das formas mais eficientes de reação de resistência imediata é a Resposta Hipersensível (HR). Esta reação é caracterizada por uma morte celular rápida das células próximas ao sítio de infecção, causando uma necrose do tecido infectado e com isso também a morte do patógeno, contendo assim o espalhamento da infecção (Balagué et al., 2003; Richberg et al., 1998). Durante esta reação, ocorre a expressão de proteínas de defesa, além de eventos de modificação fisiológicas e bioquímicas como acúmulo de fitoalexinas, mudanças no fluxo de íons através da membrana, produção de espécies reativas de oxigênio. São estes produtos que terminam por gerar a morte rápida das células na imediata vizinhança do sítio de infecção (Kombrink & Somssich, 1995; Hammond-Kosack & Jones, 1996).

Esta resposta de defesa é bastante comum e geralmente é induzida em plantas resistentes em resposta a todos os grupos conhecidos de patógenos vegetais, como vírus, bactérias, fungos e nematódeos (Bowles, 1990; Linthorst, 1991, Maleck & Dietrich, 1999).

A resposta hipersensível é um primeiro contato com o patógeno, que termina por gerar um outro tipo de resposta conhecida com Resposta Sistêmica Adquirida (SAR). Na década de 60, Ross (1961) demonstrou que plantas de tabaco, após serem infectadas pelo vírus do mosaico do tabaco (TMV), mostraram uma resistência aumentada em tecidos distantes do ponto de infecção. Este espalhamento de resistência pelos tecidos da plantas é que foi chamado de resposta sistêmica adquirida (SAR). Atualmente já se sabe que a SAR pode ser ativada em diferentes espécies de plantas por patógenos que causam necrose como parte de uma HR ou mesmo como sintoma da doença (Durrant & Dong, 2004). A resistência conferida é duradoura, algumas vezes perdurando por toda a vida da planta e também é efetiva contra uma grande variedade de patógenos, incluindo vírus, bactérias, fungos e oomicetos (Ryals et al., 1996; Schenk et al. 2000; Shah & Klessig, 1999). A nível molecular, a SAR se caracteriza pelo aumento na expressão de um grande número de proteínas relacionados a patogenicidade (Pathogenesis-related proteins – PR proteins). Estas proteínas apresentam atividade antimicrobiana (Van Loon & Van Srtien, 1999) e ainda não se conhece a função de todas elas, mas acredita-se que a SAR é resultado de um efeito conjunto de várias proteínas PR cuja expressão é disparada pelo aumento de ácido salicílico (Sticher et al., 1997; Durrant & Dong, 2004).

As vias de sinalização que disparam estas respostas de defesa em plantas são diferenciadas dependendo de qual fator está sendo responsável pelo seu início. E, em realidade, as respostas de defesa induzidas por patógenos parecem resultar de uma complexa rede de sinalização integrada que ainda não é totalmente conhecida (Maleck & Dietrich, 1999). Muitas questões permanecem desconhecidas e se torna necessário ainda determinar exatamente quais fatores (proteínas, compostos secundários e moléculas sinalizadoras) fazem parte destas respostas de defesa, quais deles estão

interagindo e fazem parte da mesma via de sinalização e em quais condições as diferentes vias de sinalização são ativadas.

A proteômica no estudo de interação planta-patógeno e respostas de defesa vegetal

A aplicação da proteômica para o estudo das interações planta-patógeno é de grande interesse científico e biotecnológico pois, embora exista uma crescente quantidade de dados em literatura descrevendo genes envolvidos no processo de interação planta-patógeno e resposta vegetal, muito poucos dados se referem as modificações a nível de proteoma associadas a estas interações (Canovas et al., 2004).

Alguns trabalhos de análise proteômica focalizam mais o estudo dos fatores protéicos produzidos pelo patógeno para estabelecer a infecção na planta hospedeira, como o trabalho desenvolvido por Smolka et al. (2003), onde foram identificadas as principais proteínas expressas pela bactéria Xyllela fastidiosa durante o processo de infecção de plantas de citrus. Outros trabalhos visam ao estudo das respostas das plantas às infecções pelos patógenos. Neste tipo de abordagem, alguns estudos recentes utilizando a análise proteômica tem apresentado dados novos e significativos para o entendimento do processo de sinalização que dispara a resposta de defesa em plantas (Rakwal & Komatsu, 2000; Lecourieux-Quaked et al, 2000).

Outros estudos concentram uma atenção maior às respostas específicas da planta a determinado patógeno, como o trabalho realizado por Rep et al (2002), em que, através de uma análise comparativa, são mostradas as modificações ao nível de proteoma que ocorrem em células de xilema de tomate infectadas pelo fungo Fusarium oxysporum. Neste estudo não só foi confirmado o aumento da expressão de proteínas PR (Pathogenese Related) de defesa vegetal, como também foi identificada uma nova isoforma da proteína PR-5 expressa em resposta a infecção pelo fungo. Outro estudo utilizando também uma abordagem proteômica mais específica, mostra a identificação de proteínas diferencialmente expressas em embriões de milho em resposta o fungo Fusarium verticilllioide, através

do uso de técnicas de eletroforese bidimensional e espectrometria de massas. Neste estudo, foram identificadas várias classes de proteínas que foram induzidas durante a infecção pelo patógenos, dentre elas proteínas de defesa vegetal (PR), enzimas com atividade de proteção celular (catalases, superóxido desmutases, glutationa transferases) e também enzimas envolvidas nos processos de síntese , enovelamento e estabilização de proteínas (Campo et al., 2004). Todos estes estudos vêm contribuir de forma significativa para uma melhor compreensão dos fatores que atuam nas vias de sinalização e disparo da resposta de defesa vegetal, contribuindo também com informações que podem levar ao desenvolvimento de novos produtos e técnicas de controle de pragas e doenças, principalmente em culturas economicamente importantes como o milho.

Análise Genética de proteomas vegetais

A análise de proteomas tem sido utilizada também para obter estudos das bases genéticas e moleculares de variações quantitativas (Consoli & Damerval, 2001, Damerval et al., 1986, Consoli et al., 2002, Thiellement et al., 2002). Assim como as técnicas de DNA fingerprinting (RAPD e AFLP), o gel de eletroforese bidimensional permite a visualização de muitos marcadores genéticos em um único experimento (Zivy & de Vienne, 2000). Assim, quando comparamos os perfis de proteínas de duas linhagens da mesma planta podemos observar “shifts” (pequenas diferenças de posição) em alguns spots de proteína, ou seja, dois “spots”, cada um pertencendo a uma linhagem, localizados muito próximos no gel bidimensional. Estes “shifts” de proteínas entre dois spots caracterizam proteínas expressas por alelos diferentes do mesmo gene, como foi comprovado por Touzet et al. (1995). Desta forma, surgiu o conceito de que estas centenas de “spots” de proteínas seriam de fato marcadores fisiológicos e genéticos e que poderiam estar sendo utilizados em estudos da variabilidade genética em plantas e também para a determinação das distâncias e relações filogenéticas entre linhagens, espécies e gêneros de um mesmo organismo. Além disso, os genes que codificam para estas proteínas podem ser mapeados e, os mapas genéticos usualmente construídos com marcadores de seqüências de

nucleotídeos como RAPDs, RFLPs, SSRs, podem ser complementados com estas seqüências de genes expressos (Thiellement, et al., 1999). Uma outra abordagem interessante que surgiu em torno deste tema, é a que considera a concentração de proteínas no gel bidimensional como uma característica quantitativa passível de ser estudada e mapeada pelo método de “Quantitative trait loci – QTL” (loci de características quantitativas), possibilitando a localização do locus que controla a abundância da proteína em questão, juntamente com a estratégia de identificação de “proteínas candidato” envolvidas na determinação do fenótipo estudado (Burstin et al., 1994; de Vienne et al., 1999). Damerval et al. (1994) foram os primeiros a investigar os determinantes genéticos da variação quantitativa de proteínas separadas por eletroforese bidimensional, usando a estratégia de estudo desta variação para caracterização de QTL (Quantitative trait loci). A partir daí vários estudos foram realizados analisando a genética da variação de proteomas e transcriptomas para a caracterização de QTL em plantas submetidas estresse hídrico (de Vienne et al, 1999), para analisar a diferenciação genética entre populações de trigo (Picard et al, 1997), para a construção de mapas de seqüências expressas em milho (Causse et al., 1996) entre outros.

O Modelo Biológico: Milho

O milho é uma planta do grupo das Angiospermas, pertencente à classe monocotiledônea, ordem Graminales, família Gramineae, gênero/espécie Zea mays. É uma planta de caule grosso, com um a três metros de altura, folhas largas, planas e pontiagudas. O milho é chamado de monóico, porque possui as flores dos dois sexos na mesma planta, os estigmas das espigas femininas são muito compridos, parecendo fios de cabelos.Os grãos ficam um do lado do outro, assim cobrindo a espiga (Figura 2) (Joly, 1966).

A) B)

Figura 2: Fotos demonstrativas de uma plantação de milho (A) e de espigas de milho (B).

A origem da planta do milho é ainda bastante controversa. Durante muito tempo pensou-se que o seu provável antecessor era o Teosinto, como ainda sustem algumas autoridades. Mas, vários estudos demonstraram que o teosinto é o resultado da híbridação do milho e o tripsacum aparecendo provavelmente depois de se cultivar o milho. A utilização do milho como alimento é bastatnte antiga. Existem provas concludentes, descobertas por arqueólogos paleobotânicos, de que no vale de Tehuacán, no sul de México já se cultivava milho aproximadamente a 4.600 anos. Nos tempos precolombinos a sua extensão ia desde o Chile até ao Canadá Oriental. Já existiam muitas variedades principais e até mereciam respeito religioso de vários povos primitivos. Com o descobrimento da América foi introduzido nos países mediterrâneos donde se difundiu rapidamente e, atualmente, este cereal é cultivado em todos os continentes e sua produção mundial compete com a de trigo pelo título

de grão mais produzido no mundo (em www.delariva.com). O milho traz em sua composição vitaminas A e do complexo B, proteínas, gorduras, carboidratos, cálcio, ferro, fósforo e amido. As cascas dos grãos são ricas em fibras (Paiva et al., 1997).

O maior produtor de milho no mundo são os Estados Unidos, respondendo por metade do milho anualmente produzido. No Brasil, a cultura de milho ocupa extensas áreas, entre as principais regiões produtoras estão o norte do Paraná, o Triângulo Mineiro, o oeste de São Paulo e o Vale do Taquari, no Rio Grande do Sul (Tsunechiro, 2000). O Brasil é o terceiro maior produtor mundial, com uma safra na faixa de 35 milhões de toneladas na média dos três últimos anos. Entretanto, sua importante indústria de aves e suínos o torna um dos maiores consumidores do mundo, impedindo inclusive a participação nas exportações mundiais.

A cultura do milho está se transformando em lavoura de ponta, com várias regiões produtoras alcançando produtividade altíssima e com expansão de área em regiões que podem ser intensivamente mecanizáveis, como o cerrado. O uso crescente de sementes melhoradas continuará sendo um dos grandes impulsos do aumento de produção (www.mre.gov.br).

No Brasil, muitas doenças são relatadas em milho (Pinto et al., 1997; Pereira, 1997), sendo que nas regiões sul e sudeste as mais freqüentes estão relacionadas com a germinação de sementes, podridões do colmo e da espiga e doenças foliares causadas por fungos (Casa et al., 2000). A semente de milho durante a germinação pode ser atacada por fungos do solo ou por aqueles associados à semente. Como resultado pode haver o apodrecimento da semente ou a morte da plântula, determinando emergência desuniforme e baixa população de plantas emersas. Os danos causados nesta fase da cultura são refletidos no rendimento de grãos pela produção de plantas por unidade de área. Em decorrência do ataque dos fungos de solo e/ou dos presentes nas sementes, as plântulas infectadas e

sobreviventes, à medida que prosseguem seu desenvolvimento, podem apresentar sintomas no seu sistema radicular (Casa et al, 2002).

O Fungo Puccinia polysora

Nos últimos anos, a importância dos patógenos que infectam a cultura do milho tem aumentado, o que constitui um dos principais entraves para o contínuo aumento na produtividade da cultura, principalmente em semeaduras mais tardias. No Brasil, há pelo menos 20 patógenos que ocorrem na cultura e que podem causar prejuízos expressivos (EMBRAPA, 1997). Entretanto, a ferrugem polissora, é uma das que merecem maior destaque por ser a mais destrutiva dentre as ferrugens do milho, pois pode causar rápida necrose e a morte precoce da planta infectada (Scott et al., 1984).

A ferrugem polissora é causada pelo fungo Puccinia polysora e é encontrada principalmente nas regiões Sudeste e Centro-Oeste do Brasil (Reis & Casa, 1996; Agroceres, 1996; Silva & Menten, 1997). Os sintomas causados pelo P. polysora se assemelham aos sintomas causados pelo Puccinia sorghi (causador da ferrugem comum do milho), porém com diferenças marcantes, inclusive na agressividade da infecção. Esta doença caracteriza-se pelo surgimento de pústulas em toda a parte aérea da planta e nas folhas. As pústulas são densamente distribuídas pela superfície superior, são de cor canela, pequenas, circulares a ovais (De León, 1994). Os uredosporos do fungo são amarelo avermelhados, ovais a irregulares e relativamente grandes (20-29 x 29-40 µm) (Figura 3), enquanto os uredosporos de P. sorghi são mais escuros e globosos e as pústulas são mais alongadas e amplamente distribuídas.

A) B)

Figura 3: Foto demonstrativa de uma folha de milho infectada com o fungo P. polysora (A) mostrando as pústulas ovais na cor de ferrugem e em (B), a microscopia dos uredosporos do fungo.

O fungo P. polysora acomete principalmente folhas jovens, em estágios iniciais de crescimento, comprometendo seu crescimento e produção de grãos. Segundo Casela et al. (2002), a capacidade das plantas resistirem a infecção por P. polysora logo nos primeiros estágios de desenvolvimento é crucial para a sobrevivência da planta e boa produção de grãos. Porém quando a infecção ocorre em estágios mais tardios a doença não se mostra muito efetiva e já não influencia muito na produção, uma vez que os grãos já estão formados (Andrade et al., 2000).

Esta doença adquiriu grande importância nesta década, pois ela pode disseminar-se amplamente em grandes áreas de monocultura com milho suscetível, levando à infecção precoce e maior severidade

principalmente das culturas mais novas próximas às mais velhas (Fernandes & Oliveira, 1997). No Brasil, a incidência da ferrugem polissora vem adquirindo caráter epidêmico no sudoeste de Goiás, Triângulo Mineiro, Noroeste de São Paulo, oeste e norte do Paraná e Mato Grosso do Sul, locais onde a produção de milho só tem sido possível com a utilização de cultivares resistentes (EMBRAPA, 1997). Estes cultivares mais resistentes, são obtidos atualmente, por métodos de melhoramento genético clássico. Este método, porém, tem sido contestado devido à dificuldade de se identificar os fatores de resistência nessas plantas, devido à variabilidade desenvolvida ano a ano e a contaminação por aflatoxinas (Pinho et al., 2001). Alguns estudos de mapeamento e clonagem de genes envolvidos com a resistência de milho a fungos de ferrugem já foram realizados (Che et al., 2003; Keiper et al., 2003), mas os componentes moleculares de resistência a estes fungos ainda permanecem desconhecidos. Por isso é de fundamental importância o desenvolvimento de estudos mais detalhados para o conhecimento dos fatores moleculares de resistência do milho para obtermos um controle mais efetivo desta praga.

Capítulo I:

ANÁLISE PROTEÔMICA COMPARATIVA DAS PLANTAS DE MILHO (Zea

mays) GENÓTIPOS RESISTENTE E SUSCETÍVEL AO FUNGO Puccinia

polysora

MATERIAL E MÉTODOS

Material biológico

Foram utilizadas sementes de milho (Zea mays) IAC 21 e IAC 112, sendo o IAC 21 um híbrido que apresenta maior resistência ao fungo Puccinia polysora, causador da ferrugem polissora, e o IAC 112 um híbrido de milho pipoca que apresenta maior susceptibilidade à infecção por este patógeno. Estes híbridos foram desenvolvidos pelos pesquisadores do Instituto Agronômico de Campinas (Brasil) e as sementes destes híbridos nos foram gentilmente cedidas pela Dra, Maria Elisa A. G. Z. Paterniani do Centro de Plantas Graníferas do IAC.

Métodos

Extração das proteínas de sementes

Para a obtenção do extrato bruto de proteínas, as sementes foram primeiramente trituradas em moinho até a obtenção uma farinha fina. As proteínas totais foram então extraídas da farinha de semente com tampão fosfato 0,1 M, pH 7,6, segundo o método de Silva et al. (2001). O extrato bruto foi então dialisado, liofilizado e estocado a 4º C até o momento de uso.

Fracionamento das proteínas totais de sementes

Para a otimização da separação das proteínas nos géis de eletroforese e conseqüente aumento da resolução e visualização das diferenças de expressão entre os dois genótipos, o extrato total de proteínas das sementes dos dois genótipos foi fracionado por cromatografia em coluna de afinidade e por cromatografia de exclusão molecular. A cromatografia de exclusão molecular foi realizada em coluna SUPERDEX 200 acoplada ao sistema FPLC, com fluxo constante de 0,3 ml/min de tampão AMBIC 0,2 M. A cromatografia de afinidade foi realizada em coluna Con-A, equilibrada com tampão

CTBS ( Tris-HCl 20mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5mM, pH 7,5). As proteínas retidas foram eluídas com solução NaCl 0,15 M/ glicose 0,2 M.

Dosagem de proteínas

As proteínas totais de sementes foram dosadas e sua concentração determinada pelo método Bradford seguindo o protocolo descrito em Bradford, 1976.

Eletroforese PAGE nativo, desnaturante e Tricina

As análises das proteínas por SDS-PAGE foram realizadas segundo descrito por Laemmli (1970). O PAGE Nativo foi realizado seguindo o protocolo descrito por Laemmli, porém retirando o SDS do tampão de corrida e do gel. As proteínas de baixo peso molecular foram analisadas por gel de tricina segundo descrito por Schagger & Jagow (1987). Todos os géis foram montados no sistema Mini-Protean II da Bio-Rad.

Eletroforese Bidimensional

A eletroforese bidimensional foi realizada segundo descrito por Smolka et al (2003). Para a primeira dimensão do gel (isoeletrofocalização) utilizamos sistema Multiphor II, com tiras de gel com gradiente de pH 3-10 não linear e anfólitos e marcadores de pI da Amersham Biosciences. As tiras de gel foram rehidratadas com 350 µL de amostra contendo aproximadamente 500 µg de proteína dissolvida em tampão contendo 7M uréia, 2M de tiouréia, 4 % CHAPS, 40 mM Tris pH 8,0 e 2 % de anfólitos.

A segunda dimensão do gel foi realizada em gel de SDS-PAGE 12,5 %. A tira da primeira dimensão do gel foi aplicada no topo do SDS-PAGE e a corrida foi realizada a 30mA constante até que o corante chegasse ao final das placas do gel.

Geração dos peptídeos trípticos e análise por Espectrometria de massas

Os “spots” de proteínas diferencialmente expressas na variedade resistente (IAC 21), foram cortados do gel, lavados com acetonitrila 100% e secos a vácuo. Depois foram digeridos por 16 hs a 37° C com solução de tripsina 10 µg/µL. Após a digestão, as amostras foram centrifugadas e o sobrenadante coletado. O gel restante foi lavado 3 vezes em solução 50% acetonitrila / 50% ácido fórmico para a retirada completa das proteínas. As amostras foram secas a vácuo e então purificadas por zip-tip, sendo misturadas a 2 µL de matriz α-cyano-4-ácido hidroxicinâmico (concentração 1mg de matriz para 50 µL de acetonitrila 60% + acido trifluoroacético). As amostras foram aplicadas nas placas e analisadas por espectrometria de massas por MALDI-TOF no espectrômetro Voyager DE PRO da PerSeptive Biosystems.

Análise dos dados spectrométricos

Os espectros de massas dos peptídeos obtidos por MALDI-TOF foram analisados e a identificação dos peptídios por peptide mass fingerprinting foi feita utilizando o programa MS-FIT (http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtm13.2/msfit.htm) e os bancos de dados mais recentemente atualizados do NCBI e Swiss-PROT.

Análise da expressão gênica – Northern blot

As sementes dos genótipos IAC 21(maior resitência) e IAC112(menor resistência) foram coletadas 12, 17 e 22 dias após a polinização (DAP), congeladas e trituradas em nitrogênio líquido. O RNA total foi extraído usando método do cloreto de lítio (Manning, 1991) com algumas modificações. O RNA foi quantificado por espectrofotometria utilizando GeneQuant (Amersham Biosciences) e 12 µg do RNA de cada genótipo foram separados em gel de agarose usando tampão desnaturante MOPS. O RNA foi transferido para uma membrana HybondTM-N+ (Amersham Biosciences) usando tampão de

transferência SSC 10x. As sondas específicas foram obtidas através da digestão com as enzimas Eco RI e Bam HI dos clones de cDNA MZCCL10164H09.g (Lipoxigenase), MZCCL10080D09.g (HSP70) e

MZCCL20024E07.g (Vicilina) do MAIZEST (Ferreira et al, http://www.maizest.unicamp.br). As

membranas foram pré hibridizadas por 4 horas com uma solução de 50 % de formamida, 5x SSC, 5x Denhardt’s (0,1 % PVP, 0,1 % ficoll, 0,1 % BSA), 50 mM de fosfato de sódio pH 6,8, 1% SDS e 100 µg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado. A sonda desnaturada foi adicionada e a

hibridização realizada por 12 horas a 42° C em solução de 50% de formamida, 5x SSC, 20 mM de fosfato de sódio pH 6,8, 1% SDS e 5% de sulfato de dextran. As membranas foram então lavadas por duas vezes (20 minutos cada) a temperatura ambiente com solução contendo 0,2x SSC e 0,1% SDS e depois mais duas vezes a 65° C com a mesma solução. As membranas foram expostas a filmes de raio-X (Kodak MGraio-X/Plus) a -70° C. Os filmes foram então processados no aparelho Macrotec Mraio-X-2.

RESULTADOS

Perfil de expressão das proteínas de sementes

O perfil de expressão de proteínas dos extratos totais das sementes de milho dos dois genótipos, foi primeiramente analisado e comparado por SDS-PAGE e PAGE. Em ambas as análises não puderam ser identificadas diferenças significativas entre os perfis de proteínas dos dois genótipos, devido à grande quantidade de proteínas presentes nos dois extratos. O PAGE Nativo (Figura 4), porém nos indicou que a maioria das proteínas de sementes de milho apresentam caráter básico assim como ocorre nas sementes de outras gramíneas (Guo et al., 1998).

Figura 4: Gel Nativo mostrando a separação por carga das proteínas do extrato bruto de IAC 112 e IAC 21. O sinal de (+) no topo do gel indica o pólo negativo onde ficam retidas as proteínas que apresentam caráter básico. O sinal de (-) na parte de baixo do gel indica o pólo positivo onde se encontram as proteínas que apresentam caráter ácido.

Uma vez que o extrato bruto das sementes apresentou uma grande quantidade de proteínas que não sofreram boa separação por SDS-PAGE inicial (dado não mostrado) e pelo gel nativo, antes de realizar os experimentos de separação em gel de tricina, SDS-PAGE e eletroforese bidimensional, o extrato bruto de proteínas das duas sementes foi fracionado usando dois diferentes métodos de cromatografia: Cromatografia de gel filtração e cromatografia de afinidade em coluna Con-A. Estes fracionamentos foram realizados com o intuito de melhorar a separação das proteínas em gel e melhor visualização e caracterização das diferenças de expressão.

A cromatografia de afinidade em coluna Con-A resultou em duas frações de proteínas (Figura 5) que foram analisadas primeiramente por SDS-PAGE. A análise comparativa das duas frações mostrou 5 bandas de proteínas apresentando maior expressão no genótipo resistente (figura 7A e figura 7B). Estas bandas diferenciais foram excisadas dos géis e analisadas por espectrometria de massas. A segunda fração foi também analisada por eletroforese bidimensional (figura 6) onde foi verificada uma dificuldade na separação das proteínas do genótipo suscetível resultando numa diferença no perfil de proteínas entre os dois genótipos dificultando a correta análise dos genótipos por esta estratégia. Desta forma todas as outras análises foram conduzidas utilizando-se SDS-PAGE e Tricina-PAGE.

A) B)

Figura 5: Gráficos resultantes da Cromatografia de Afinidade em coluna Con-A do extrato bruto de proteínas de sementes de IAC 21 (A) e IAC 112 (B).

Figura 6: Eletroforese bidimensional mostrando o conjunto das proteínas do 2o Pico resultante da cromatografia de afinidade em coluna ConA, de IAC 21 (A) e de IAC 112 (B).

A)

B)

Figura 7: Gel eletroforese em SDS PAGE mostrando a separação das proteínas do 1o Pico (A) e do 2o Pico (B) resultantes da cromatografia de afinidade de IAC 112 e IAC 21. As setas indicam as proteínas diferencialmente expressas no genótipo resistente, selecionadas para a análise por spectrometria de massas.

A cromatografia de gel filtração das duas amostras de proteínas, genótipo resistente (figura 8A) e genótipo suscetível (figura 8B), resultaram em quatro picos de proteínas. Os dois primeiros picos, representando as proteínas de maior massa molecular, foram submetidos à eletroforese por SDS-PAGE (figura 9). A análise comparativa do primeiro pico de proteínas (fig. 9A) mostrou uma banda de proteína de aproximadamente 90 kDa, expressa unicamente no genótipo resistente. Esta banda de proteína, denominada 21Ex7, foi cortada do gel e posteriormente submetida a digestão com tripsina para geração da impressão digital da proteína por espectrometria de massas e identificação desta em

banco de dados. A análise do segundo pico de proteínas proveniente da gel filtração, (fig. 9B) mostrou a expressão diferencial de seis bandas de proteínas no genótipo resistente. Estas bandas foram cortadas do gel para posterior identificação. As frações 3 e 4 (proteínas de pequeno tamanho molecular) provenientes da gel filtração foram separadas por gel de tricina, mas não foram identificadas diferenças significativas entre os dois genótipos.

A) B)

Abs280 nm Abs280nm

FRAÇÕES FRAÇÕES

Figura 8: Cromatogramas resultantes das análises do extrato bruto de proteínas de IAC 21 (A) e IAC 112 (B) por gel filtração.

A) B)

Figura 9: Eletroforese em gel de SDS PAGE mostrando a separação das proteínas do 1o Pico (A) e do 2o Pico (B) resultantes da cromatografia de gel filtração de IAC 112 e IAC 21. As setas nos géis indicam as proteínas diferencialmente expressas no genótipo resistente e que foram selecionadas para a análise por spectrometria de massas.

Identificação das proteínas diferenciais por Espectrometria de massas MALDI-TOF

As proteínas diferencialmente expressas, cortadas dos géis de eletroforese, foram digeridas com tripsina para gerar a impressão digital de peptídeos. As massas dos peptídeos foram determinadas por espectrometria de massas por MALDI-TOF. Os espectros de massas resultantes foram calibrados e a lista de massas dos picos foi utilizada para a pesquisa no banco de dados NCBI da identidade das proteínas. As buscas foram feitas através do programa MS-FIT (UCSF; http://prospector.ucsf.edu/) [27]. Foi possível identificar cinco proteínas (tabela 1) sendo que três foram identificadas como proteínas de defesa vegetal. As bandas 21Ex1, 21Ex2 and 21Ex3 (fig. 6) foram identificadas como uma proteína Heat shock 70 kDa, uma Vicilin-like de 66 kDa e uma proteína precursora de globulina 2 de 49 kDa, respectivamente. A banda 21ex7 (fig. 5) foi identificada como sendo uma lipoxigenase de milho de 96 kDa. A banda 21Af1 (fig. 7) foi identificada como uma enolase de 48 kDa. As outras seis proteínas diferencialmente expressas, não puderam ser identificadas pois a lista de massas resultantes não era compatível com nenhuma proteína de existente no banco de dados de milho.

Tabela 1: Lista das proteínas identificadas por espectrometria de massas MALDI-TOF. Os spots correspondentes estão indicados nos géis de eletroforese figuras 6B, 6A e 8A respectivamente, de acordo com a ordem apresentada na tabela.

Spot Nome da proteína/Espécie Massa

(kDa)/pI

Número

de acesso.

Matches Cobertura Score

21Ex1 Heat shock / Zea mays 70.6/5.2 123593 8/28 17% 2.794e+004 21Ex2 Vicilin like / Zea mays 66.1/6.2 542182 6/64 17% 3.043e+04 21Ex3 Precursor de Globulina-2 /

Zea mays

49.9/6.2 100876 6/34 14% 2235

21Ex7 Lipoxigenase/ Zea mays 96.4/5.7 12620877 29/75 29% 1.269e+010

21Af1 Enolase 1/ Zea mays 48.0/5.2 119355 5/72 17% 469

Análise da Expressão Gênica

Para avaliar a expressão gênica das proteínas de defesa identificadas (Lipoxigenase, Vicilina e da proteína Heat shock), procedemos a uma análise por northern blot (figura 10). O RNA total das sementes resistente e suscetível foi coletado 7, 12, 17 e 22 dias após a polinização (DAP) e hibridizado com sondas específicas para os genes que codificam as proteínas selecionadas. Os três genes mostraram estar sendo mais expressos pela variedade resistente. Também foi analisado o período de expressão destes genes durante a formação da semente. O gene relativo a lipoxigenase mostrou maior expressão nos estágios iniciais de formação da semente, até 12 dias após a polinização. Depois deste tempo a expressão de RNAm decresce bastante até 24 dias após a polinização. O gene que codifica a Vicilina mostrou uma expressão tardia e muito forte no genótipo resistente, porém sendo muito baixa sua expressão no genótipo suscetível. Este gene mostrou um início de expressão apenas 17 dias após a polinização, atingindo maior expressão 22 dias após a polinização. O gene relativo à proteína Heat

shock mostrou expressão durante todo o período de formação da semente, aumentando durante o período e apresentando expressão maior na fase final de formação, 22 dias após a polinização. Porém, no genótipo de maior resistência, esta expressão se mostrou alta durante toda a formação da semente, enquanto no genótipo mais suscetível, a expressão é bastante baixa nos estágios iniciais, sendo maior na fase final de formação da semente.

A) B)

Figura 10: Análise da expressão gênica por northern blot do gene que expressa a Lipoxigenase (1A), Vicilina (2A) e a Heat shock (3A), durante os estágios de formação da semente. Os tempos de coleta e extração do RNA (12,17 e 22 dias após a polinização) estão indicados no topo dos géis. Foram aplicados 12 µg do RNA de cada genótipo em gel de agarose. Na parte inferior dos géis está representado o RNA ribossomal, demonstrando que foram aplicadas quantidades iguais de RNA em todos os poços e que a diferença de expressão é devida realmente à diferença entre os tempos de coleta e entre os genótipos. Em B está indicado as concentrações das amostras em cada tempo de coleta das diferentes amostras, sendo Lipoxigenase (1B), Vicilina (2B) e a Heat shock (3B).

Capítulo II:

Mapeamento de QTLs para a identificação dos genes

reguladores que controlam a síntese de DIMBOA em milho

INTRODUÇÃO

A análise de loci de características quantitativas (Quantitative trait loci analysis - QTL) tem demonstrado ser uma poderosa ferramenta para o estudo de características agronômicas complexas em plantas, mostrando uma precisão muito maior do era possível anteriormente na análise genética destas características (Paterson, 1998). A abordagem de mapeamento de QTLs tem permitido a descrição do número, efeito genético e posição cromossômica de genes determinantes de algumas características agronômicas importantes (Bushman et al., 2002; Jampatong et al., 2002; de Vienne et al, 1999; Vigouroux et al., 2002).

Loci de características quantitativas e mapeamento de QTLs

Uma característica quantitativa é definida como uma característica com distribuição contínua. A avaliação destas características é geralmente obtida por métodos de medidas ao invés de métodos de contagem. As características quantitativas são geralmente controladas por vários genes, cada gene tendo um pequeno efeito na determinação da característica (Liu, 1998).

Alguns mecanismos de resistência de plantas a doenças são geneticamente simples e tem sido bastante estudados por métodos genéticos tradicionais (Hulbert & Michelmore, 1985; Jorgensen & Moserman, 1972). Mas, muitas formas de resistência são consideradas como característica quantitativa complexa, onde vários genes respondem por esta resistência. Neste tipo de característica de resistência, como em qualquer outra característica quantitativa, os genes interagem entre si e também com o meio ambiente e esse conjunto de interações é que irá determinar a característica fenotípica. Estes genes apresentam padrão de herança complexa, de forma que estas características não podem ser totalmente entendidas por experimentos de genética qualitativa (Doerge, 2002). Para o estudo destes tipos de características complexas, onde a variação é baseada na interação cumulativa entre os alelos positivos

e negativos dos genes, o mapeamento de QTLs tem se mostrado uma abordagem bastante eficaz (Geiger & Geun, 1989; Frey et al., 1997).

Um locus de característica quantitativa se refere a um locus genético identificado através de análises estatísticas da característica complexa em estudo como, por exemplo, a resistência de plantas a doenças. A estratégia de mapeamento de QTLs se baseia na construção de mapas genéticos e no estudo das relações entre a característica estudada e os marcadores moleculares presentes no mapa. Estes marcadores representam sítios de heterozigose para algum tipo de variação silenciosa de DNA e podem ser usados nas análises de mapeamento assim como alelos de heterozigotos convencional. Funcionam como sítios e pontos de referência para a localização da QTL no cromossomo (Liu, 1998).

Uma associação significativa (determinada por análises estatísticas) entre a característica de interesse e os marcadores moleculares pode evidenciar, nas proximidades destes marcadores, um locus que estaria determinando essa característica de resistência quantitativa (Liu, 1998). Em resumo, um QTL é uma região do genoma responsável pela variação de uma característica quantitativa de interesse (Doerge, 2002). Desta forma, com o mapeamento de QTLs, é possível localizar os genes que estão determinando esta característica, descrever e entender as regras para: a resistência de loci específicos, a resistência parcial raça-específica e interações entre os genes de resistência, desenvolvimento vegetal e também interação destes genes com meio ambiente (Young, 1996).

A estratégia de mapeamento de QTLs tem sido amplamente utilizada para o estudo de diferentes características complexas, em especial aquelas determinantes de fenótipos agronômicos interessantes economicamente como o peso de grãos (Stuber, 1995), resistência a doenças e insetos (Ramalingam et al, 2002; Byrne et al., 1996), para o estudo da via metabólica de formação de flavonóides em milho (McMullen, et al., 1998)

DIMBOA e sua relação com a resistência em plantas

Os metabólitos secundários são importantes componentes que participam do mecanismo de defesa em plantas e funcionam como pesticidas naturais.Os ácidos hidroxâmicos cíclicos DIBOA (2,4- dihydroxy-2H- 1,4-benzoxazin-3(4H)-one) e DIMBOA (2,4-dihydroxy-7-methoxy-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-one) desempenham um papel importante como agentes químicos de defesa em cereais contra fungos, bactérias patogênicas e insetos predadores (Frey et al., 1997; Sicker et al., 2000). Nas plantas intactas, estes ácidos benzoxazinoides existem predominantemente como 2-β-O-D-glicosídeos, a sua forma estável. Estes glicosídeos são praticamente inativos biologicamente, mas em situação de injúria de tecidos, eles são enzimaticamente convertidos a agliconas, sua forma ativa, através da ação de β -glicosidases (Argandona et al., 1981; Massardo et al., 1994; Hashimoto & Shudo, 1993; Macías et al., 2005).

O composto DIMBOA é um dos bezoxazinoides agliconas mais estudados (Long et al., 1975; Corcuera et al., 1978; Niemeyer, 1988; Larsen & Christensen, 2000; Oikawa et al., 2002; Gierl & Frey, 2001). Este é o ácido benzoxazinoide de principal ocorrência em milho e trigo e sua via de biossíntese (Figura 11) ocorre a partir de uma ramificação da via do triptofano. O idol é o último intermediário comum entre as duas vias (Figura 12) (Melanson et al., 1997). O DIMBOA é tóxico para uma grande variedade de insetos, bactérias e fungos (Glenn et al., 2002), Agrobacterium tumefaciens (Sahi et al., 1990), contra as brocas de milho européia e asiática (Campos et al., 1989; Barry et al., 1994) contra o western corn rootworm (Xie et al., 1990) e contra insetos afídeos (Escobar et al., 1999; Bravo et al., 2004). O DIMBOA age contra estes patógenos e insetos, inibindo proteases e enzimas oxidativas (Niemeyer, 1988). Além disso, já foi demonstrado que o composto DIMBOA e outros benzoxazinoide aglyconas são aleloquímicos bastante fortes (Barnes & Putnam, 1987; Perez, 1990; Bravo &Lazo, 1996), e possuem atividade mutagênica (Hashimodo & Shudo, 1993). Estes dados mostram claramente

que o composto DIMBOA e os benzoxazinoide aglyconas similares são de grande importância para a agricultura como compostos de defesa químicos.

Figura 12: Via de formação de DIMBOA e triptofano, mostrando a ramificação e a formação das duas vias em separado a partir do Indol.

Os genes responsáveis pela codificação das enzimas da via de síntese do DIMBOA a partir de indol já foram clonados, caracterizados e, através de mapeamento, foi mostrado que estes genes se encontram posicionados no cromossomo quatro de milho (Melanson et al., 1997). Apesar disso, nada se sabe a respeito dos fatores de transcrição que regulam a via de síntese deste composto. Neste trabalho nós utilizamos a estratégia de mapeamento de QTL/ genes candidates, para procurar os loci candidatos para estes fatores de transcrição. Nosso primeiro objetivo foi identificar o QTL mais significativa em uma população de milho originada de um cruzamento entre linhagens com alta e baixa produção de DIMBOA e comparar sua (s) posição (ões) com as dos genes estruturais para analisar o quanto de variação genética poderia ser atribuída aos genes codificadores destas enzimas. Os QTLs mais

significativos que não estivessem ligadas aos genes estruturais seriam consideradas loci candidatos para os fatores de transcrição e regulação das enzimas desta via.

MATERIAL E MÉTODOS:

Material Biológico

Foram coletados tecidos foliares jovens (primórdios foliares) de plantas de milho de duas populações F2. Estes tecidos foram coletados de plantas com idade de 40 dias. A população 1 foi derivada de um cruzamento entre as linhagens de alta (Ci31A) e baixa (Ci21E) produção de DIMBOA. A população 2 é resultado do cruzamento entre as linhagens Ci31A (alta produção de DIMBOA) e C103 (baixa produção DIMBOA). Os tecidos coletados foram liofilizados por 4 dias e então triturados. Foram analisados 183 indivíduos da população 1 e 164 indivíduos da população 2.

Métodos

Extração de DNA

O tecido foliar triturado (150 mg) de cada indivíduo, foi transferido para um tubo de 5 mL e foi adicionado 3 mL do tampão CTAB (0,1 M Tris pH 7,5; 0,01 M EDTA pH 8,0; 0,7 m NaCl; 1% w/v CTAB; 1% v/v β-mercaptoethanol) em cada tubo. As amostras foram misturadas em vórtex e depois incubadas por 1 h a 65 °C com agitação leve. Após o período de incubação, as amostras foram resfriadas a temperature ambiente e 1,5 mL de clorofórmio/octanol (24:1) foi adicionado às amostras. Estas foram misturadas no vortex e centrifugadas por 10 min a 2000g. A fase aquosa foi coletada em outro tubo contendo 1,5 mL de clorofórmio octanol, misturadas em vórtex e então centrifugadas por 10 min a 2000 x g. A fase aquosa foi novamente coletada em outro tubo contendo 20 µL de RNAse (10 mg/mL) e incubada por 30 min a 37°C. Após a incubação, foram adicionados 2 mL de isopropanol às amostras e misturados gentilmente para precipitar o DNA. O DNA foi coletado com um anzol de vidro e transferido para um tubo de microcentrífuga contendo 500 µL do tampão TE e misturado até dissolver completamente no tampão. Às amostras foram então adicionados 250 µL de fenol pH 8,0 e o

mesmo volume de clorofórmio, que foram depois misturadas em vórtex e centrifugadas por 3 min a 16,000 x g. A fase aquosa foi coletada em outro tubo contendo 500 µL de clorofórmio, misturada em vórtex e centrifugada por 3 min a 16,000 x g. A fase aquosa foi novamente coletada em novo tubo contendo 50 µL de NaOAc 3 M pH 5.0 e 1 mL of etanol 100%. As amostras foram misturadas, centrifugadas por 3 min at 16,000 x g e o precipitado resultante foi lavado uma vez com 500 µL of etanol 70%. Após estar completamente seco, o precipitado foi resuspendido em 250 µL de tampão TE e as amostras foram estocadas a 4°C.

Quantificação do DNA

A quantificação do DNA foi feita medindo-se a taxa de absorbância das amostras a 260 e 280 nm usando o aparelho Microquant (Biotek).

Genotipagem por SSR

O DNA genômico foi usado para as reações de amplificação por PCR com marcadores de SSR selecionados em gel de agarose por análise dos parentais e da população F1. A seleção dos melhores marcadores para as duas populações em estudo foi feita também por eletroforese capilar automatizada no aparelho ABI 3100(Applied Biosystems).

Condições de PCR

O DNA genômico (20 ng) de cada indivíduo foi colocado em diferentes poços de placas de 96 poços. Uma mistura contendo 5x PCR Mix (Promega), 10 ρM do oligonucleotídeo reverso, 10 ρM do oligonucleotídeo direto, mais água qsp, foi adicionada a cada poço até um volume final de 15 µL. As reações de amplificação foram feitas em aparelhos termocicladores PTC-225 Peltier (MJ Research), segundo o programa: 94 °C por 1 min, 65 °C por 1 min, -1°C por ciclo, 72 °C 1 min, repete 9 vezes

desde o passo 1, 94 °C por 1 min, 55 °C por 1 min, 72 °C 1:30 min, repete 34 vezes desde o passo 5, 10°C por tempo indefinido.

Eletroforese em gel de agarose

Os produtos de amplificação por PCR foram analisados por eletroforese em gem de agarose SFR (Super Fine Resolution - AMRESCO) 4 %. Todos os géis foram pré-corados com 15 µL de brometo de etídeo (10 mg/mL) e as corridas realizadas a 127 V.

Eletroforese capilar automatizada

A reação de PCR foi realizada usando oligonucleotídeos marcados com fluorescência (6FAM, HEX ou NED) e as condições de reação foram as mesmas já descritas para os oligonucleotídeos não marcados. Após a amplificação, os produtos da reação foram diluídos 40 vezes, O DNA foi então precipitado e depois aplicado no analisador genético ABI 3100 (Applied Biosystems). Três diferentes produtos, com marcações diferentes (um de cada fluorescência, 6FAM, HEX, and NED) foram combinados para a corrida. Os dados da corrida foram analisados usando o software Genotyper (Applied Biosystems).

Análise dos dados fenotípicos

As análises para a detecção e quantificação dos ácidos hidroxâmicos foram feitas por cromatografia gasosa. Aproximadamente 0,5 g do tecido vegetal triturado foi transferido para cápsulas de Teflon de 4 mL (Alltech Associates, Deerfield, IL), foram lavados com etil acetato e secos. Foi adicionado 30 g de 4-chlorobenzoicocomo padrão interno e a extração do tecido foi feita adicionando 2 ml de uma solução de ácido hidroclorídrico 1 mM. A mistura foi colocada em banho de gelo e depois sonicada. O extrato foi centrifugado a 4000 rpm por 5 min, o sobrenadante foi coletado, lavado três

vezes com etil acetato, e depois filtrado em membranas Whatman número 1. Os extratos foram secos, foi adicionado 200 mL de BSTFA (Alltech Associates, Deerfield, IL) e os extratos foram novamente secos a 65 oC por 30 min.

A cromatografia gasosa dos extratos foi realizada em coluna AT-1 metil silicone (Alltech Associates, Deerfield, IL) 30 m /0.25 mm, com filme de 25 mm. A temperatura do injetor foi de 200 oC, a temperatura do detector foi de 250 oC. A área de retenção do pico foi determinada usando padrões do software Chrom Perfect versão 3.54 (Justice Innovations, Mountainview, CA). A determinação da concentração de ácidos hidroxâmicos foi feita através de comparação da área do padrão interno de concentração conhecida dos picos de interesse.

Identificação química. Um padrão de DIMBOA foi fornecido por J. A. Klun (USDA-ARS, Beltsville, MD). E o padrão de MBOA (6-methoxy-2-benzoxazolinone) foi comprado da Lancaster synthesis (Windham, NH). Os extratos e os padrôes sintéticos foram analisados por cromatografia gasosa-espectrometria de massas (GC-MS) no cromatógrafo Hewlett-Packard 6890 em interface com o sistema de espectrometria de massas ChemStation Hewlett-Packard 5971 (Agilent, Palo Alto, CA). O espectro de massas obtido dos picos dos extratos foi comparado com o banco de dados do National Institute of Standards and Technology mass spectra database. As identificações foram realizadas com base nas comparações dos espectros de massas e dos tempos de retenção entre as amostras e os padrões sintéticos. A identificação do composto HMBOA foi baseada somente nos tempos de retenção e espectros de massas, pois não tínhamos padrões disponíveis.

Mapa de ligação

O mapa genético de ligação foi determinado pelo software MAPMAKER/EXP 3.0 (Lander et al., 1987; Lincoln et al., 1992).

Análises e determinação de QTLs

As análises de QTL para MBOA, HBOA, DIMBOA e benzoxazinoides totais foi realizada pelo software QTL Cartographer v. 1.13g [44]. Foi usado o método de composite interval mapping (CIM) (Jansen & Stam, 1994; Zeng, 1994), o módulo Zmapqtl do programa foi empregado para detectar os QTLs e estimar seus efeitos. Para a determinação dos QTLs, foi feita a varredura do genoma em intervalos de cada 3 cM (centimorgans), com tamanho de janela de 10 cM. Uma série de 1000 permutações (Doerge & Churchill, 1996) foi feita para determinar os níveis de significância do experimento com P = 0.05 de LOD (log10 da proporção da taxa de probabilidade). Os efeitos dominantes e aditivos para os QTLs identificadas foram também estimados pelo módulo Zmapqtl. Os modelos de locus múltiplo baseados no Tipo III foram construídos no programa SAS GLM usando os marcadores mais próximos das QTLs identificadas por CIM. O melhor modelo foi determinado como aquele que melhor explica a maior fração de variância fenotípica e no qual cada loci ou suas interações permanecem com nível de significância P < 0.05.

RESULTADOS:

Análises dos traços fenotípicos

A distribuição da concentração de DIMBOA (Figura 11) e Benzoxazinoides TOTAIS (Figura 12) nas plantas F2 não foi uma distribuição normal, uma vez que ocorreu um grande número de indivíduos mostrando valores baixos de concentração destes dois dados fenotípicos, próximos ao valor apresentado pelo parental de menos concentração de DIMBOA. Apenas um pequeno número de indivíduos apresentou distribuição transgressiva com valores de concentração maiores que o do parental que produz altas concentrações destes dois parâmetros.

B

Figura 11: Taxa de freqüência de distribuição do conteúdo de DIMBOA para os indivíduos F2 da população 1 (Ci21E × Ci31A).

Figura 11: Taxa de freqüência de distribuição do conteúdo de DIMBOA (A) e do conteúdo de Benzoxazinóides totais (B) para os indivíduos F2 da população 1 (Ci21E × Ci31A).

Figura 12: Taxa de freqüência de distribuição do conteúdo de benzoxazinoides totais para os indivíduos F2 da população 1 (Ci21E × Ci31A).

Mapa de Ligação SSR

O mapa molecular de ligação foi construído com 123 marcadores SSR, apresentando um tamanho total de 1432.9 cM e um tamanho médio entre intervalos de 11.3 cM (Figura 13). Houve dois intervalos com tamanho maior que 40 cM, um deles localizado no cromossomo 8 e o outro localizado no cromossomo 9. Exceto por estas duas regiões, as distâncias aproximadas entre os marcadores estão de acordo com o mapa consenso de SSR do banco Maize DGB, www.agron.missouri.edu.

Figura 13: Mapa de ligação construído com 123 marcadores SSR. O número do cromossomo está indicado na parte superior de cada cromossomo. Os quadrados em preto representam os QTLs encontradas. Os números à esquerda dos marcadores indicam as distâncias cumulativas em centimorgans (cM).

Análise de QTL para o conteúdo de DIMBOA

Para a característica de produção de DIMBOA foram identificados por CIM 4 QTLs. Estes QTLs foram localizadas um no cromossomo 1, dois no cromossomo 6 e um no cromossomo 10 (Tabela 2).

O QTL identificado no cromossomo 1 se localiza na bin 1.08, cujo marcador mais próximo é o phi037. No cromossomo 6 foi encontrado um QTL na bin 6.01, próximo ao marcador bngl1867 e outro na bin 6.02 próximo ao marcador umc1595. No cromossomo 10, o QTL identificado se localiza na bin 10.05 próximo ao marcador umc1506. Os valores dos picos de LOD destas QTLs variaram de 12.2 a 18.9 e os valores parciais de R2 ficaram entre 6.1 e 10.6 %. Os modos de ação gênica variaram de aditivos a dominantes (Tabela 2). Os alelos que contribuíram para a maior produção de DIMBOA são provenientes do parental Ci21E para os QTLs identificados no cromossomo 6 e para os QTLs identificados nos cromossomos 1 e 10 os alelos são provenientes do parental Ci31A (Tabela 2).

Análise de QTL para o conteúdo de ácidos benzoxazinoides TOTAIS

Para a característica designada como benzoxazinoides TOTAIS, foram identificados os mesmos 4 QTLs da característica DIMBOA, ou seja, um localizado no cromossomo 1, dois no cromossomo 6 e um no cromossomo 10 (Tabela 2). Os valores dos picos LOD dos QTLs para este dado fenotípico variaram de 12.0 to 16.9 e os valores parciais de R2 ficaram entre 6 e 7.1 %. Os modos de ação gênica ficaram entre aditivo e de dominância (Tabela 2). Os alelos que contribuíram para a produção aumentada de benzoxazinoides TOTAIS também foram provenientes do parental Ci21E para os QTLs do cromossomo 6 e do parental Ci31A para os QTLs dos cromossomos 1 e 10 (Tabela 2).

Tabela 2: Análise de QTL para os conteúdos de DIMBOA e ácidos benzoxazinoides TOTAIS

____________________________________________________________________________ Posição Contribuição Efeito Genético Crom. (cM/bin) marcador LOD parental Aditivo Dominante R2

% % %

Dimboa

Indivíduos F2 da População 1 (Ci21E × Ci31A)

1 97/1.08 phi037 12,2 Ci31A 256,4 613,8 6,1 6 13/6.01 bnlg1867 12,8 Ci21E 546,3 427,0 7,2 6 26/6.02 umc1595 18,9 Ci21E 651,9 611,5 10,6 10 46/10.05 umc1506 13,4 Ci31A 368,4 486,5 6,8

Ácidos Benzoxazinoides TOTAIS

Indivíduos F2 da População 1 (Ci21E × Ci31A)

1 97/1.08 phi037 12.0 Ci31A 244,1 765,0 6,0 6 11/6.01 bnlg1867 12.0 Ci21E 643,8 426,4 6,6 6 26/6.02 umc1595 16.9 Ci21E 760,7 633,9 9,6 10 46/10.05 umc1506 13.9 Ci31A 460,3 574,0 7,1

Modelo de locus múltiplo (MLM)

Os modelos de locus múltiplos foram gerados para as características DIMBOA e ácidos Benzoxazinoides TOTAIS, usando informações dos marcadores da população 1. O MLM para o traço DIMBOA mostrou um valor total de R2 = 38.8 % e inclui duas interações: a primeira entre os marcadores bnlg1350 x umc1112 localizados nas bin 3.08 e bin 7.03, respectivamente. A segunda

interação ocorre entre os marcadores umc1650 x umc2161, localizados nas bin 4.09 e bin 5.03 respectivamente. Uma outra análise de MLM para o traço designado Benzoxazinoides TOTAIS foi gerada e mostrou um valor de R2 = 36.5 %. Os loci de efeito principal foram os mesmo da análise MLM para o traço DIMBOA (Tabela 3).

Tabela 3: Modelo de locus múltiplo para os traços DIMBOA e benzoxazinoides TOTAIS na população F2 (Ci21E × Ci31A)

Dimboa_______________________________Total_____________________________

Marcador____ __Bin_ _____P_________Marcador___ ____Bin_______P______

bnlg1350 3.08 0,08 bnlg1350 3.08 0,08 umc1112 7.03 0,04 umc1112 7.03 0,04 phi037 1.08 0,03 phi037 1.08 0,00 umc1595 6.02 0,00 umc1595 6.02 0,00 umc1650 4.09 0,43 umc1650 4.09 0,60 umc2161 5.03 0,43 umc2161 5.03 0,45 bnlg1350*umc1112 3.08 x 7.03 <,0001 bnlg1350*umc1112 3.08 x 7.03 <,0001 umc1650*umc2161 4.09 x 5.03 0,001 umc1650*umc2161 4.09 x 5.03 0,001 R2_{= 0.388 R}2_{= 0.365} Mapeamento da população 2

Cerca de vinte marcadores SSR de localização próxima às QTLs identificadas na população 1, foram utilizados para mapear estas mesmas QTLs na população 2, resultado do cruzamento entre as linhagens Ci31A (alta produção de DIMBOA) e C103 (baixa produção DIMBOA). Cada marcador SSR foi usado para a amplificação e genotipagem por PCR de 164 indivíduos da população 2. Toda a

genotipagem desta população foi concluída, porém as análises completas de mapeamento e identificação das QTLs nesta população não foram realizadas por falta de dados fenotípicos. Desta forma o mapa de ligação não foi ainda concluído e as análises de QTL desta segunda população ainda não foram finalizadas.