Material Biológico
Foram coletados tecidos foliares jovens (primórdios foliares) de plantas de milho de duas populações F2. Estes tecidos foram coletados de plantas com idade de 40 dias. A população 1 foi derivada de um cruzamento entre as linhagens de alta (Ci31A) e baixa (Ci21E) produção de DIMBOA. A população 2 é resultado do cruzamento entre as linhagens Ci31A (alta produção de DIMBOA) e C103 (baixa produção DIMBOA). Os tecidos coletados foram liofilizados por 4 dias e então triturados. Foram analisados 183 indivíduos da população 1 e 164 indivíduos da população 2.
Métodos
Extração de DNA
O tecido foliar triturado (150 mg) de cada indivíduo, foi transferido para um tubo de 5 mL e foi adicionado 3 mL do tampão CTAB (0,1 M Tris pH 7,5; 0,01 M EDTA pH 8,0; 0,7 m NaCl; 1% w/v CTAB; 1% v/v β-mercaptoethanol) em cada tubo. As amostras foram misturadas em vórtex e depois incubadas por 1 h a 65 °C com agitação leve. Após o período de incubação, as amostras foram resfriadas a temperature ambiente e 1,5 mL de clorofórmio/octanol (24:1) foi adicionado às amostras. Estas foram misturadas no vortex e centrifugadas por 10 min a 2000g. A fase aquosa foi coletada em outro tubo contendo 1,5 mL de clorofórmio octanol, misturadas em vórtex e então centrifugadas por 10 min a 2000 x g. A fase aquosa foi novamente coletada em outro tubo contendo 20 µL de RNAse (10 mg/mL) e incubada por 30 min a 37°C. Após a incubação, foram adicionados 2 mL de isopropanol às amostras e misturados gentilmente para precipitar o DNA. O DNA foi coletado com um anzol de vidro e transferido para um tubo de microcentrífuga contendo 500 µL do tampão TE e misturado até dissolver completamente no tampão. Às amostras foram então adicionados 250 µL de fenol pH 8,0 e o
mesmo volume de clorofórmio, que foram depois misturadas em vórtex e centrifugadas por 3 min a 16,000 x g. A fase aquosa foi coletada em outro tubo contendo 500 µL de clorofórmio, misturada em vórtex e centrifugada por 3 min a 16,000 x g. A fase aquosa foi novamente coletada em novo tubo contendo 50 µL de NaOAc 3 M pH 5.0 e 1 mL of etanol 100%. As amostras foram misturadas, centrifugadas por 3 min at 16,000 x g e o precipitado resultante foi lavado uma vez com 500 µL of etanol 70%. Após estar completamente seco, o precipitado foi resuspendido em 250 µL de tampão TE e as amostras foram estocadas a 4°C.
Quantificação do DNA
A quantificação do DNA foi feita medindo-se a taxa de absorbância das amostras a 260 e 280 nm usando o aparelho Microquant (Biotek).
Genotipagem por SSR
O DNA genômico foi usado para as reações de amplificação por PCR com marcadores de SSR selecionados em gel de agarose por análise dos parentais e da população F1. A seleção dos melhores marcadores para as duas populações em estudo foi feita também por eletroforese capilar automatizada no aparelho ABI 3100(Applied Biosystems).
Condições de PCR
O DNA genômico (20 ng) de cada indivíduo foi colocado em diferentes poços de placas de 96 poços. Uma mistura contendo 5x PCR Mix (Promega), 10 ρM do oligonucleotídeo reverso, 10 ρM do oligonucleotídeo direto, mais água qsp, foi adicionada a cada poço até um volume final de 15 µL. As reações de amplificação foram feitas em aparelhos termocicladores PTC-225 Peltier (MJ Research), segundo o programa: 94 °C por 1 min, 65 °C por 1 min, -1°C por ciclo, 72 °C 1 min, repete 9 vezes
desde o passo 1, 94 °C por 1 min, 55 °C por 1 min, 72 °C 1:30 min, repete 34 vezes desde o passo 5, 10°C por tempo indefinido.
Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de amplificação por PCR foram analisados por eletroforese em gem de agarose SFR (Super Fine Resolution - AMRESCO) 4 %. Todos os géis foram pré-corados com 15 µL de brometo de etídeo (10 mg/mL) e as corridas realizadas a 127 V.
Eletroforese capilar automatizada
A reação de PCR foi realizada usando oligonucleotídeos marcados com fluorescência (6FAM, HEX ou NED) e as condições de reação foram as mesmas já descritas para os oligonucleotídeos não marcados. Após a amplificação, os produtos da reação foram diluídos 40 vezes, O DNA foi então precipitado e depois aplicado no analisador genético ABI 3100 (Applied Biosystems). Três diferentes produtos, com marcações diferentes (um de cada fluorescência, 6FAM, HEX, and NED) foram combinados para a corrida. Os dados da corrida foram analisados usando o software Genotyper (Applied Biosystems).
Análise dos dados fenotípicos
As análises para a detecção e quantificação dos ácidos hidroxâmicos foram feitas por cromatografia gasosa. Aproximadamente 0,5 g do tecido vegetal triturado foi transferido para cápsulas de Teflon de 4 mL (Alltech Associates, Deerfield, IL), foram lavados com etil acetato e secos. Foi adicionado 30 g de 4-chlorobenzoicocomo padrão interno e a extração do tecido foi feita adicionando 2 ml de uma solução de ácido hidroclorídrico 1 mM. A mistura foi colocada em banho de gelo e depois sonicada. O extrato foi centrifugado a 4000 rpm por 5 min, o sobrenadante foi coletado, lavado três
vezes com etil acetato, e depois filtrado em membranas Whatman número 1. Os extratos foram secos, foi adicionado 200 mL de BSTFA (Alltech Associates, Deerfield, IL) e os extratos foram novamente secos a 65 oC por 30 min.
A cromatografia gasosa dos extratos foi realizada em coluna AT-1 metil silicone (Alltech Associates, Deerfield, IL) 30 m /0.25 mm, com filme de 25 mm. A temperatura do injetor foi de 200 oC, a temperatura do detector foi de 250 oC. A área de retenção do pico foi determinada usando padrões do software Chrom Perfect versão 3.54 (Justice Innovations, Mountainview, CA). A determinação da concentração de ácidos hidroxâmicos foi feita através de comparação da área do padrão interno de concentração conhecida dos picos de interesse.
Identificação química. Um padrão de DIMBOA foi fornecido por J. A. Klun (USDA-ARS, Beltsville, MD). E o padrão de MBOA (6-methoxy-2-benzoxazolinone) foi comprado da Lancaster synthesis (Windham, NH). Os extratos e os padrôes sintéticos foram analisados por cromatografia gasosa-espectrometria de massas (GC-MS) no cromatógrafo Hewlett-Packard 6890 em interface com o sistema de espectrometria de massas ChemStation Hewlett-Packard 5971 (Agilent, Palo Alto, CA). O espectro de massas obtido dos picos dos extratos foi comparado com o banco de dados do National Institute of Standards and Technology mass spectra database. As identificações foram realizadas com base nas comparações dos espectros de massas e dos tempos de retenção entre as amostras e os padrões sintéticos. A identificação do composto HMBOA foi baseada somente nos tempos de retenção e espectros de massas, pois não tínhamos padrões disponíveis.
Mapa de ligação
O mapa genético de ligação foi determinado pelo software MAPMAKER/EXP 3.0 (Lander et
Análises e determinação de QTLs
As análises de QTL para MBOA, HBOA, DIMBOA e benzoxazinoides totais foi realizada pelo software QTL Cartographer v. 1.13g [44]. Foi usado o método de composite interval mapping (CIM) (Jansen & Stam, 1994; Zeng, 1994), o módulo Zmapqtl do programa foi empregado para detectar os QTLs e estimar seus efeitos. Para a determinação dos QTLs, foi feita a varredura do genoma em intervalos de cada 3 cM (centimorgans), com tamanho de janela de 10 cM. Uma série de 1000 permutações (Doerge & Churchill, 1996) foi feita para determinar os níveis de significância do experimento com P = 0.05 de LOD (log10 da proporção da taxa de probabilidade). Os efeitos dominantes e aditivos para os QTLs identificadas foram também estimados pelo módulo Zmapqtl. Os modelos de locus múltiplo baseados no Tipo III foram construídos no programa SAS GLM usando os marcadores mais próximos das QTLs identificadas por CIM. O melhor modelo foi determinado como aquele que melhor explica a maior fração de variância fenotípica e no qual cada loci ou suas interações permanecem com nível de significância P < 0.05.
RESULTADOS:
Análises dos traços fenotípicos
A distribuição da concentração de DIMBOA (Figura 11) e Benzoxazinoides TOTAIS (Figura 12) nas plantas F2 não foi uma distribuição normal, uma vez que ocorreu um grande número de indivíduos mostrando valores baixos de concentração destes dois dados fenotípicos, próximos ao valor apresentado pelo parental de menos concentração de DIMBOA. Apenas um pequeno número de indivíduos apresentou distribuição transgressiva com valores de concentração maiores que o do parental que produz altas concentrações destes dois parâmetros.
B
Figura 11: Taxa de freqüência de distribuição do conteúdo de DIMBOA para os indivíduos F2 da população 1 (Ci21E × Ci31A).
Figura 11: Taxa de freqüência de distribuição do conteúdo de DIMBOA (A) e do conteúdo de Benzoxazinóides totais (B) para os indivíduos F2 da população 1 (Ci21E × Ci31A).
Figura 12: Taxa de freqüência de distribuição do conteúdo de benzoxazinoides totais para os indivíduos F2 da população 1 (Ci21E × Ci31A).
Mapa de Ligação SSR
O mapa molecular de ligação foi construído com 123 marcadores SSR, apresentando um tamanho total de 1432.9 cM e um tamanho médio entre intervalos de 11.3 cM (Figura 13). Houve dois intervalos com tamanho maior que 40 cM, um deles localizado no cromossomo 8 e o outro localizado no cromossomo 9. Exceto por estas duas regiões, as distâncias aproximadas entre os marcadores estão de acordo com o mapa consenso de SSR do banco Maize DGB, www.agron.missouri.edu.
Figura 13: Mapa de ligação construído com 123 marcadores SSR. O número do cromossomo está indicado na parte superior de cada cromossomo. Os quadrados em preto representam os QTLs encontradas. Os números à esquerda dos marcadores indicam as distâncias cumulativas em centimorgans (cM).
Análise de QTL para o conteúdo de DIMBOA
Para a característica de produção de DIMBOA foram identificados por CIM 4 QTLs. Estes QTLs foram localizadas um no cromossomo 1, dois no cromossomo 6 e um no cromossomo 10 (Tabela 2).
O QTL identificado no cromossomo 1 se localiza na bin 1.08, cujo marcador mais próximo é o phi037. No cromossomo 6 foi encontrado um QTL na bin 6.01, próximo ao marcador bngl1867 e outro na bin 6.02 próximo ao marcador umc1595. No cromossomo 10, o QTL identificado se localiza na bin 10.05 próximo ao marcador umc1506. Os valores dos picos de LOD destas QTLs variaram de 12.2 a 18.9 e os valores parciais de R2 ficaram entre 6.1 e 10.6 %. Os modos de ação gênica variaram de aditivos a dominantes (Tabela 2). Os alelos que contribuíram para a maior produção de DIMBOA são provenientes do parental Ci21E para os QTLs identificados no cromossomo 6 e para os QTLs identificados nos cromossomos 1 e 10 os alelos são provenientes do parental Ci31A (Tabela 2).
Análise de QTL para o conteúdo de ácidos benzoxazinoides TOTAIS
Para a característica designada como benzoxazinoides TOTAIS, foram identificados os mesmos 4 QTLs da característica DIMBOA, ou seja, um localizado no cromossomo 1, dois no cromossomo 6 e um no cromossomo 10 (Tabela 2). Os valores dos picos LOD dos QTLs para este dado fenotípico variaram de 12.0 to 16.9 e os valores parciais de R2 ficaram entre 6 e 7.1 %. Os modos de ação gênica ficaram entre aditivo e de dominância (Tabela 2). Os alelos que contribuíram para a produção aumentada de benzoxazinoides TOTAIS também foram provenientes do parental Ci21E para os QTLs do cromossomo 6 e do parental Ci31A para os QTLs dos cromossomos 1 e 10 (Tabela 2).
Tabela 2: Análise de QTL para os conteúdos de DIMBOA e ácidos benzoxazinoides TOTAIS
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Posição Contribuição Efeito Genético
Crom. (cM/bin) marcador LOD parental Aditivo Dominante R2
% % %
Dimboa
Indivíduos F2 da População 1 (Ci21E × Ci31A)
1 97/1.08 phi037 12,2 Ci31A 256,4 613,8 6,1 6 13/6.01 bnlg1867 12,8 Ci21E 546,3 427,0 7,2 6 26/6.02 umc1595 18,9 Ci21E 651,9 611,5 10,6 10 46/10.05 umc1506 13,4 Ci31A 368,4 486,5 6,8
Ácidos Benzoxazinoides TOTAIS
Indivíduos F2 da População 1 (Ci21E × Ci31A)
1 97/1.08 phi037 12.0 Ci31A 244,1 765,0 6,0 6 11/6.01 bnlg1867 12.0 Ci21E 643,8 426,4 6,6 6 26/6.02 umc1595 16.9 Ci21E 760,7 633,9 9,6 10 46/10.05 umc1506 13.9 Ci31A 460,3 574,0 7,1
Modelo de locus múltiplo (MLM)
Os modelos de locus múltiplos foram gerados para as características DIMBOA e ácidos Benzoxazinoides TOTAIS, usando informações dos marcadores da população 1. O MLM para o traço DIMBOA mostrou um valor total de R2 = 38.8 % e inclui duas interações: a primeira entre os marcadores bnlg1350 x umc1112 localizados nas bin 3.08 e bin 7.03, respectivamente. A segunda
interação ocorre entre os marcadores umc1650 x umc2161, localizados nas bin 4.09 e bin 5.03 respectivamente. Uma outra análise de MLM para o traço designado Benzoxazinoides TOTAIS foi gerada e mostrou um valor de R2 = 36.5 %. Os loci de efeito principal foram os mesmo da análise MLM para o traço DIMBOA (Tabela 3).
Tabela 3: Modelo de locus múltiplo para os traços DIMBOA e benzoxazinoides TOTAIS na população F2 (Ci21E × Ci31A)
Dimboa_______________________________Total_____________________________
Marcador____ __Bin_ _____P_________Marcador___ ____Bin_______P______
bnlg1350 3.08 0,08 bnlg1350 3.08 0,08 umc1112 7.03 0,04 umc1112 7.03 0,04 phi037 1.08 0,03 phi037 1.08 0,00 umc1595 6.02 0,00 umc1595 6.02 0,00 umc1650 4.09 0,43 umc1650 4.09 0,60 umc2161 5.03 0,43 umc2161 5.03 0,45 bnlg1350*umc1112 3.08 x 7.03 <,0001 bnlg1350*umc1112 3.08 x 7.03 <,0001 umc1650*umc2161 4.09 x 5.03 0,001 umc1650*umc2161 4.09 x 5.03 0,001 R2= 0.388 R2= 0.365 Mapeamento da população 2
Cerca de vinte marcadores SSR de localização próxima às QTLs identificadas na população 1, foram utilizados para mapear estas mesmas QTLs na população 2, resultado do cruzamento entre as linhagens Ci31A (alta produção de DIMBOA) e C103 (baixa produção DIMBOA). Cada marcador SSR foi usado para a amplificação e genotipagem por PCR de 164 indivíduos da população 2. Toda a
genotipagem desta população foi concluída, porém as análises completas de mapeamento e identificação das QTLs nesta população não foram realizadas por falta de dados fenotípicos. Desta forma o mapa de ligação não foi ainda concluído e as análises de QTL desta segunda população ainda não foram finalizadas.