3.1 - OBTENÇÃO DO “POOL” DE ALBUMINAS 2S DE SEMENTES DE MAMONA:
As albuminas 2S foram extraídas de sementes de Ricinus communis L. cultivar IAC-226 segundo a metodologia descrita por Thorpe et al. (1988), com adaptações propostas por Machado e colaboradores em 2003. Cerca de 140 gramas de sementes foram descascadas e, após a retirada das casacas, a massa livre do tegumento foi registrada. Esta massa foi macerada com grau e pistilo e, posteriormente embebida em hexano (300 mL) visando a extração do óleo. Esta suspensão foi mantida sob agitação, à temperatura ambiente, durante 18 horas. Após a agitação, a amostra foi centrifugada a 2250 x g por 30 minutos e, os lipídeos que formaram uma camada na superfície do líquido puderam ser removidos. Essa metodologia foi repetida por duas vezes. Após a extração do óleo, as proteínas foram solubilizadas em tampão fosfato de sódio 0,2 M (pH 7,0) na proporção de 1:4 e, os resíduos insolúveis foram eliminados por centrifugação a 30.000 x g durante 15 minutos a 4°C. As proteínas do sobrenadante foram precipitadas com sulfato de amônio a 90% de saturação durante 18 horas sob agitação. Após a precipitação, a amostra foi centrifugada a 15.000 x g durante 15 minutos e o precipitado, contendo as proteínas, foi recolhido e o sobrenadante descartado. O material recolhido foi fervido durante 15 minutos, em banho-maria, visando flocular a ricina e, subseqüentemente, submetido a uma nova centrifugação e, o sobrenadante recolhido. Para separar a albumina 2S das outras proteínas presentes na amostra, a mesma foi submetida a filtração em gel utilizando resina Sephadex-G-50 previamente equilibrada em TFA (ácido trifluoracético) 0,1%. A amostra foi eluída com TFA 0,1% sob um fluxo de 1,0 mL/min e, frações de 1 mL foram coletadas e detectadas a 280 nm. As frações correspondentes as albuminas 2S, foram acumuladas, liofilizadas e guardadas a 4 ºC, em pequenas alíquotas.
3.2 - OBTENÇÃO DE SORO ANTI-ALBUMINA 2S:
O soro policlonal de rato anti-albumina 2S de mamona foi produzido na Universidade Federal Fluminense, em colaboração com o Dr. Maurício Afonso Verícimo. Para tanto, 10 ratos RA/Thor foram imunizados por injeção intraperitoneal
de 0.5 mL de salina contendo 0.01 mg do “pool” de albumina 2S e 5.0 mg de hidróxido de alumínio. Um mês, após a 1ª imunização, os animais receberam uma dose reforço de antígeno. Neste caso, a mesma quantidade do antígeno foi misturada com 2.5 mg de hidróxido de alumínio. Os animais foram anestesiados e sangrados, por punção cardíaca, 7 dias após o reforço, volumes de soro iguais de cada animal foram recolhidos, reunidos e guardados em alíquotas de 0.1 mL. Essas alíquotas representam o “pool” de IgE anti-albumina 2S.
3.3 - TRATAMENTO QUÍMICO DO “POOL” DE ALBUMINAS 2S E DA TORTA DE MAMONA:
O tratamento químico consistiu da adição de 100 µL de diferentes soluções de compostos de cálcio (hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio ou óxido de cálcio) nas concentrações de 4 e de 8% a 100 µL de “pool” de albumina 2S (1mg/mL). O meio reacional (200 µL) foi deixado sob agitação por 12 horas, a temperatura ambiente, figura 11.
Figura 11: Fluxograma do tratamento proposto para desativar epitopos
alergênicos de albumina 2S de mamona utilizando diferentes compostos de cálcio.
A torta de mamona utilizada nos experimentos foi cedida pela EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuária) e o tratamento químico com a torta de mamona também consistiu da adição de 100 µL de diferentes soluções de
Ca(OH)2 CaCO3 CaO
Alb 2S Torta 4% 8% 4% 8% 4% 8% Caracterização Biológica Amostras Tratadas
compostos de cálcio (hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio ou óxido de cálcio) nas concentrações de 4 e de 8% a 100 µL de amostra de torta de mamona (0,3 g/mL). O meio reacional (200 µL) foi mantido sob agitação por 12 horas, a temperatura ambiente.
3.4 - CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA – AVALIAÇÃO DA ALERGENICIDADE:
Para analisar as propriedades alergênicas das amostras empregamos ensaio de desgranulação de mastócitos obtidos de lavado peritoneal de rato, o qual foi avaliado por análise da morfologia celular por microscopia óptica e pela dosagem de histamina liberada das mesmas. Como avaliação complementar, utilizamos ensaios de desgranulação utilizando células RBL-2H3 por meio de quantificação da enzima lisossomal β-hexosaminidase.
3.4.1 – Obtenção dos mastócitos de rato:
Ratos da linhagem Wistar (não imunizados), de aproximadamente 250 g cada foram empregados como fonte de mastócitos. Três ratos foram sacrificados, um de cada vez, por asfixia em CO2 e, posteriormente submetidos a uma incisão na cavidade peritoneal, de aproximadamente 5 cm. Nesta abertura, foram inseridos 20 mL de meio de cultura DMEM (meio mínimo essencial de Eagle modificado por Dulbecco) contendo 12 U.I./ mL de heparina para realizar a lavagem. O conteúdo recolhido do primeiro rato foi utilizado para realizar a lavagem do segundo e assim sucessivamente, objetivando enriquecer o conteúdo do lavado com mastócitos. O lavado obtido dos animais foi retirado da cavidade peritoneal com o auxílio de uma pipeta Pasteur e armazenado em tubo cônico tipo Falcon.
O conteúdo final recolhido do peritôneo dos ratos, aproximadamente 15 mL, foi transferido para uma placa de Petri, permanecendo por 30 minutos em estufa à 37°C, visando separar os mastócitos dos macrófagos. Após esse período de tempo, 2/3 do meio de cultura foi retirado cuidadosamente da superfície da placa com auxílio da pipeta Pasteur e descartado. O líquido remanescente (cerca de 4 - 5 mL) contendo os mastócitos foi transferido para um tubo cônico tipo Falcon e essa suspensão final de células, dividida em alíquotas de 100 µL, para posterior sensibilização.
3.4.2 – Ensaios de desgranulação:
Avaliamos a ativação dos mastócitos mediada ou não por imunoglobulinas. As alíquotas de 100 µL da preparação enriquecida em mastócitos foram submetidas ao tratamento com 1 µL de soro total anti-albumina 2S e com 10 µL da amostra a ser testada (10 µg/mL). A mistura foi incubada por 1 hora a 37 oC. Nos controles de ativação inespecífica, o soro foi omitido do ensaio. Para a avaliação da desgranulação, uma alíquota de 10 µL foi utilizada para a contagem de mastócitos por microscopia óptica, o remanescente foi reservado para a dosagem de histamina.
Para a detecção do percentual de desgranulação em todos os testes realizados, o “pool” de IgE anti-albumina 2S obtido após imunização de ratos RA/Thor foi diluído a uma proporção de 1:100 na suspensão de células. As amostras foram preparadas para que se tivesse 1 µg/mL na mesma solução. Esta mistura foi incubada por 1 hora na estufa de cultura de células a 37o C.
A desgranulação dos mastócitos foi avaliada por microscopia óptica e pela quantificação da histamina liberada.
3.4.2.1 - Avaliação do percentual de desgranulação por microscopia óptica:
A suspensão de células contendo os mastócitos (10 µL), após os diversos tipos de incubação, foram misturadas e incubadas durante 15 minutos com 10 µL de solução aquosa contendo 0,1% de azul de toluidina, 10% de formaldeído e 1% de ácido acético, pH 2,8 para evidenciar a desgranulação. A contagem diferencial dos mastócitos, íntegros e desgranulados, foi realizada em câmara de Neubauer, nos quatro quadrantes, sendo visualizados em microscopia de contraste de interferência diferencial de Normarski (DIC) utilizando o microscópio óptico Zeiss Axioplan.
Como controle negativo de sensibilização induzida, mastócitos sem tratamento prévio foram também incubados com o corante nas condições citadas e, observados ao microscópio óptico. A contagem destas células, íntegras e desgranuladas, permitiu uma avaliação do procedimento de obtenção. Cada experimento foi feito em duplicata e, foram empregados mastócitos do mesmo animal. Os gráficos apresentando os resultados dos ensaios de desgranulação foram construídos utilizando o programa GraphPad Prism 4.
O restante do material celular (90 µL) foi utilizado para a determinação da histamina liberada, como descrito no item 3.4.2.2.
Para verificar as mudanças morfológicas sofridas pelas células ao serem incubadas com albumina 2S de mamona ao longo do tempo, os mastócitos do lavado peritoneal de rato expostos ao alérgeno de mamona foram incubados em diferentes tempos, variando de 0 a 1 hora. Transcorrido o tempo de cada amostra, as células foram coradas por azul de toluidina, como descrito anteriormente e, observadas através do microscópio óptico acoplado a uma filmadora para a captura das imagens.
3.4.2.2 – Quantificação de histamina:
Para esta dosagem empregamos um processo de cromatografia de troca catiônica, seguido por derivatização pós-coluna. A histamina presente no meio reagiu com o-phthaldialdeido (OPA), produzindo um composto fluorescente. Vários gradientes de eluição foram testados e o processo utilizado baseou-se na eluição isocrática empregando-se NaOH 0,2M. Uma curva padrão foi feita empregando-se de 1pmol a 1 nmol de histamina fornecida pela r-Biopharm.
Para este ensaio foram utilizados os 90 µL restantes da suspensão de células do lavado peritoneal, pré-incubadas com soro e amostras de albuminas 2S ou torta de mamona submetidas ao tratamento descrito no item 3.4.2.1. Neste caso, a suspensão de células foi sedimentada através de uma centrifugação (4000 g) e por um curto período de tempo (10 minutos). Vinte microlitros do sobrenadante foram aplicados na coluna de troca catiônica para quantificação da histamina liberada, por processos cromatográficos. O restante da amostra (70 µL) foi sonicado por 30 segundos para rompimento da membrana dos mastócitos. Uma alíquota de 20 µL da amostra sonicada também foi analisada por cromatografia para dosagem da histamina total. O processo de sonicação provocava o rompimento de praticamente todas as células e os valores da quantificação de histamina foram tomados como 100%.
Os valores de histamina liberada pela incubação com o soro de cada uma das amostras foram expressos em porcentagem. A construção de uma planilha de valores (programa excel) foi realizada para corrigir os valores de histamina liberada pelo número de células contadas por microscopia óptica.
A histamina foi dosada após separação dos componentes do meio reacional (DMEM) por cromatografia de troca catiônica, empregando um sistema HPLC (High Performance Liquid Chromatography). A eluição da histamina retida foi feita com
NaOH 0,2 M empregando um fluxo de 0,6 mL/min. A histamina foi detectada após associação com OPA, seguindo a reação apresentada na figura 12. A detecção foi feita por derivatização pós-coluna, utilizando o reagente o-phthaldialdeido*. Inicialmente o eluato foi neutralizado com a solução A (Na2CO3, H3BO3; K2SO4) e depois reagia com a solução B (OPA 0,08%). Utilizamos um detector de fluorescência da Shimatzu, modelo RF 535, sendo que, o produto da reação quando excitado a 375 nm, emite no comprimento de onda de 460 nm.
Figura 12: Produto obtido a partir da reação química entre o-phthaldialdeido
(OPA), β-mercaptoetanol e a histamina proveniente dos grânulos liberados pelos mastócitos do lavado peritoneal do rato.
* Preparo de reagente o-phthaldialdeído (OPA): - Solução A:
Preparo de 1L do tampão com a seguinte composição química:
40,7 g de Na2CO3 (0,384M); 13,6 g de H3BO3 (0,216M); 18,8 g de K2SO4
(0,108M)
Os reagentes foram dissolvidos em água até um volume final de 1L. Ficando o pH da solução próximo a 10, sem ajuste necessário.
- Solução B – OPA 0,08%:
400 mg de OPA foi dissolvido em 7 mL de etanol e em seguida foi adicionado 1 mL de 2-mercaptoetanol. O volume foi ajustado a 500 mL com a solução A.
CH O CH O + HO-CH2-CH2-SH + OPA β β β β- mercaptoetanol N – CH2 – CH2 C C H S-CH2-CH2-OH
3.4.3 - Obtenção das células RBL-2H3:
As células RBL-2H3 (Rat Basophilic Leukemia Cells- Clone 2H3) foram gentilmente cedidas pela professora Dr.ª Maria Célia Jamur da USP- Ribeirão Preto. Estas células pertencem a uma linhagem celular primeiramente isolada e clonada em 1978 de basófilos de ratos Wistar que foram mantidas como tumor no Laboratory of Immunology do National Institute of Dental Research, nos Estados Unidos da América. Estas células possuem a morfologia característica de fibroblastos, com propriedade de crescimento aderente e expressa o receptor FcЄRI (MORENO, 2003). As células RBL-2H3 (Figura 13) foram cultivadas em meio mínimo essencial de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 15% de soro fetal bovino, 0,434 mg/mL de glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina e 0,25 µg/mL de anfotericina B, como previamente descrito (BASCIANO et al., 1986; PIERINI et al., 1996) e mantidas em atmosfera úmida contendo 5% de CO2 a 37ºC.
As células foram monitoradas com auxílio de um microscópio invertido e, quando confluentes, foram removidas dos frascos de cultivo utilizando-se Tripsina a 0,5% contendo EDTA – 4Na (incubação de 15 minutos a 37 ºC, em atmosfera úmida contendo 5% de CO2). Após a centrifugação a 1000 rpm/ 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em meio de cultura para subcultivos destas células.
Figura 13: Microscopia eletrônica de transmissão de células RBL-2H3. (A) não
estimuladas, (B) após estimulação (MORENO, 2003).
3.4.3.1- Quantificação de liberação da enzima ββββ-hexosaminidase:
Os ensaios de desgranulação utilizando as células RBL-2H3 foram conduzidos e realizados no laboratório de Biologia Celular e Molecular de Mastócitos do Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - Campus de Ribeirão Preto.
Para avaliar a desgranulação das células RBL-2H3, a quantificação de liberação da enzima lisossomal β-hexosaminidase (% de desgranulação), um mediador pré-formado, foi realizada. Um volume de 25 µL do sobrenadante ou 25 µL do solubilizado de células, obtido com tampão Tyrode*, pH 7.3, em Triton 100-X 1%, foi misturado com 25 µL do substrato sintético p-nitrofenol-N-acetil-β-D-glucosamida (NAG; Sigma) preparado em tampão citrato-acetato* 0,1M, pH 4,5. As amostras foram incubadas por 30 minutos a 37ºC e a reação foi parada pela adição de 50 µL de NaCl 0,2M, NaOH 0,2M e glicina 0,2M. A reação da enzima celular com o substrato foi detectada a 405 nm utilizando o leitor de microplacas (MORENO, 2003).
A preparação dos tampões utilizados nos ensaios de quantificação de liberação da enzima β-hexosaminidase das células RBL-2H3 é descrita abaixo:
- Tampão Tyrodes - 3X (100 mL de água): 0,057g de CaCl2 2H2O 0,060g de KCl 0,302g de NaHCO3 2,402g de NaCl 0,013g de NaH2PO4 6,12 uL (4,9M) de MgCl2 0,300g de Sacarose 0,715g de HEPES - Tampão citrato-acetato: 23,5 mL de ácido cítrico (2,44g + 116,0mL de H2O) 26,5 mL de citrato de sódio (3,32g + 112,9 mL de H2O) 3.5- ANÁLISE ESTATÍSTICA:
Os dados obtidos nos ensaios de desgranulação utilizando mastócitos de rato foram analisados estatisticamente pelo one way ANOVA, utilizando o teste de comparação múltipla de Tukey (P<0,001). Esta análise foi realizada pelo programa GraphPad Prism 4.