EPITOPOS ALERGÊNICOS DE ALBUMINAS 2S PRESENTES EM
TORTA DE MAMONA (Ricinus communis L.).
NATALIA DEUS DE OLIVEIRA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ. FEVEREIRO - 2009.
ii
EPITOPOS ALERGÊNICOS DE ALBUMINAS 2S PRESENTES EM
TORTA DE MAMONA (Ricinus communis L.).
NATALIA DEUS DE OLIVEIRA
Tese apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia.
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ. FEVEREIRO - 2009.
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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Química e
Função de Proteínas e Peptídeos (LQFPP), no Centro de Biociências e
Biotecnologia (CBB) da Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro – UENF, sob a orientação da Professora Olga Lima
Tavares Machado.
Financiamentos:
- FAPERJ (Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa
do Estado do Rio de Janeiro).
- CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior)
- CNPq (Conselho Nacional de desenvolvimento Científico e
tecnológico)
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EPITOPOS ALERGÊNICOS DE ALBUMINAS 2S PRESENTES EM
TORTA DE MAMONA (Ricinus communis L.).
NATALIA DEUS DE OLIVEIRA
Tese apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia.
Aprovada em 16 de fevereiro de 2009. Comissão examinadora:
Drª Marílvia Dansa de Alencar Petretski (UENF)
Dr. Renato Augusto DaMatta (UENF)
Dr. Maurício Afonso Verícimo (UFF)
Dr.ª Olga Lima Tavares Machado (UENF) (Orientadora)
v
Dedico este trabalho, a todos que acreditaram que era possível iniciar mais esta etapa de minha vida.
vi
A Deus, por estar sempre presente em todos os momentos de minha vida. A minha orientadora Olga, pela dedicação ao conhecimento, pelo zelo com seus alunos, pela companhia e força nas dificuldades e, principalmente, nas vitórias.
A revisora deste trabalho, professora Dr.ª Michelle Muzitano, pela atenção e carinho dispensados, pela dedicação e profissionalismo dedicados a esta revisão.
Aos membros da banca, Dr.ª Marílvia Dansa de Alencar Petretski, Dr. Renato Augusto DaMatta e Dr. Maurício Afonso Verícimo, pela atenção e profissionalismo já dispensados.
A minha família, em especial meu pai Adão, que mesmo longe se faz presente no meu dia-a-dia através dos ensinamentos plantados em minha vida.
Ao meu amigo e noivo Hélio Neto, pela companhia, compreensão, sabedoria e paciência. Enfim, pela sua presença em minha vida.
Aos amigos do laboratório, a outros amigos da UENF, aos amigos do CEFET Campos e a minha amiga de sempre Adriana Pacheco, pelo companheirismo, pelas conversas e pela alegria nos encontros.
A família Crespo e a família Pepe por compartilhar comigo um pouquinho de suas feições familiares e o aconchego de um lar.
A todos os funcionários do LQFPP e do LBCT pela disponibilidade. Enfim, a todos que contribuíram para o término deste trabalho.
vii
"Se houver um general forte, não haverá soldados fracos."
viii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...x LISTA DE TABELAS...xii LISTA DE ABREVIAÇÕES...xiii RESUMO...xiv ABSTRACT...xv 1- INTRODUÇÃO...1 1.1- Economia da mamona...2 1.2- Semente...3 1.2.1- O óleo...4 1.2.1.1- Biodiesel...5 1.2.2- A torta...91.3- Compostos tóxicos e alergênicos...10
1.3.1- Ricina...10
1.3.2- Alérgeno de mamona – Albumina 2S...12
1.4- Hipersensibilidade...16
1.4.1 - Imunoglobulina do tipo E (IgE)...19
1.4.2 - Receptor FcЄRI...21
1.4.3 – Mastócito...22
1.4.4 – Epitopo...24
1.4.5- Alergia desencadeada por albumina 2S...26
1.5- Processos de destoxificação e desalergenização da torta de mamona...27
2- OBJETIVO...32
3- MATERIAIS E MÉTODOS...33
3.1 - Obtenção do “pool” de albuminas 2S de sementes de mamona...33
3.2 - Obtenção de soro anti-albumina 2S...33 3.3 - Tratamento químico do “pool” de albuminas 2S e da torta de mamona.34
ix
3.4.1 – Obtenção dos mastócitos de rato...35
3.4.2 – Ensaios de desgranulação...36
3.4.2.1 - Avaliação do percentual de desgranulação por microscopia óptica...36
3.4.2.2 – Quantificação de histamina...37
3.4.3 - Obtenção das células RBL-2H3...39
3.4.3.1- Quantificação de liberação da enzima β-hexosaminidase...39
3.5 - Análise estatística...40
4- RESULTADOS...41
4.1- Avaliação da atividade alergênica...41
4.1.1- Morfologia celular - Microscopia óptica...41
4.1.2- Quantificação da desgranulação de mastócitos...42
4.1.3- Quantificação de histamina...45
4.1.4- Quantificação de liberação da enzima β-hexosaminidase...53
5- DISCUSSÃO...56
6- CONCLUSÃO...62
x
Figura 1: Partes da mamona, folhas, flor e fruto...1
Figura 2: Fluxograma do processo de extração do óleo da semente de mamona...4
Figura 3: Estrutura secundária da ricina...11
Figura 4: Esquema do processamento do precursor das isoformas Ric c 3 e Ric c 1...14
Figura 5: Histórico das albuminas 2S de Ricinus communis L...15
Figura 6: Estrutura Primária do precursor das Albuminas 2S...16
Figura 7: Esquema da deflagração da alergia na presença do alérgeno...19
Figura 8: Estrutura do receptor FcЄRI...21
Figura 9: Ativação celular do mastócito mediada pelo receptor FcЄRI...24
Figura 10: Estudo dos epitopos presentes nas albuminas 2S de mamona...25
Figura 11: Fluxograma do tratamento proposto para desativar epitopos alergênicos de albumina 2S de mamona utilizando diferentes compostos de cálcio...34
Figura 12: Produto obtido a partir da reação química entre o-phthaldialdeido (OPA), β-mercaptoetanol e a histamina proveniente dos grânulos liberados pelos mastócitos do lavado peritoneal do rato...38
xi
após exposição à albumina 2S na presença de soros como fonte de IgE específica...42
Figura 15: Desgranulação de mastócitos do lavado peritoneal de rato (experimento
controle)...43
Figura 16: Desgranulação de mastócitos do lavado peritoneal de rato frente as
amostras de albumina 2S tratadas...44
Figura 17: Desgranulação de mastócitos do lavado peritoneal de rato frente as
amostras de torta de mamona tratadas...45
Figura 18: Padronização do método de dosagem de histamina...47
Figura 19: Perfil cromatográfico da histamina liberada pelos mastócitos de rato...49
Figura 20: Sobreposição dos perfis cromatográficos da histamina liberada das
amostras de células incubadas com albumina 2S nativa e albumina 2S tratada com hidróxido de cálcio a 4%, após cromatografia de troca catiônica...50
Figura 21: Sobreposição dos perfis cromatográficos da histamina liberada das
amostras de células incubadas com torta nativa e torta tratada com hidróxido de cálcio a 4%, após cromatografia de troca catiônica...52
Figura 22: Determinação da atividade biológica de albumina 2S de mamona pelo
ensaio de desgranulação com as células RBL-2H3...54
Figura 23: Esquema da interação eletrostática entre o cálcio e as carboxilas dos
ácidos glutâmicos (epitopo) presentes na estrutura da albumina 2S de mamona ....59
xii
Tabela I: Principais oleaginosas cultivadas no Brasil para a produção de
biodiesel...8
Tabela II: Porcentagem de desgranulação dos mastócitos e quantificação da
histamina liberada de seus grânulos após incubação com o “pool” de albumina 2S nativa e, com a albumina 2S após o tratamento com hidróxido de cálcio a 4%...51
Tabela III: Porcentagem de desgranulação dos mastócitos e quantificação da
histamina liberada de seus grânulos após incubação com a torta de mamona nativa e, com a torta de mamona após o tratamento com hidróxido de cálcio a 4%...53
xiii CB-1A Castor Bean Allergen
D-MEM Meio Eagle Modificado por Dubelcco’s DIC Differential Interference Contrast
DNP dinitrofenol
DTH Hipersensibilidade do tipo tardio EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético
HEPES Ácido N-2-Hidroxietilpiperazina-N'-2'-Etanossulfônico HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
IgA Imunoglobulina A IgD Imunoglobulina D IgE Imunoglobulina E IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M IL-10 Interleucina 10 IL-4 Interleucina 4 IL-5 Interleucina 5
MHC Complexo de Histocompatibilidade Principal OPA o-phthaldialdeido
Ric c 1 Alérgeno 1 de Ricinus communis Ric c 3 Alérgeno 3 de Ricinus communis
RBL-2H3 Rat Basophilic Leukemia Cells- Clone 2H3 TNP 2,4,6-trinitrofenol
TFA Ácido Trifluoracético
xiv
Ricinus communis L. é uma planta da família Euphorbiaceae, conhecida no Brasil
como mamona, tendo grande importância econômica devido ao óleo extraído de sua semente que pode ser utilizado para a síntese de biodiesel. Após a extração do óleo, obtém-se a torta que possui alto teor protéico, porém, não pode obtém-ser utilizada para consumo animal por possuir proteínas tóxicas (ricina) e alergênicas (albumina 2S). O reconhecimento de epitopos de albuminas 2S através de IgEs ligadas na superfície dos mastócitos promove a desgranulação destas células, enquadrando-se como hipersensibilidade do tipo I. O presente estudo tem por objetivo realizar tratamento químico com albumina 2S purificada e com a torta bruta de mamona, visando desativar os epitopos alergênicos. O método químico utilizado consistiu de tratamento com compostos de cálcio adicionados às amostras de albumina 2S e torta de mamona, em tratamentos separados. As amostras foram incubadas com uma solução de hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio ou óxido de cálcio, a 4 e a 8% na proporção de 1:1 (v/v), durante 12 horas, a temperatura ambiente. O ensaio biológico, empregado a fim de avaliar a atividade alergênica destas amostras, consistiu da quantificação da desgranulação dos mastócitos do lavado peritoneal de ratos e da histamina liberada dessas células. Ensaios de desgranulação utilizando células RBL-2H3 foram utilizados como outra metodologia empregada para confirmar a desativação dos epitopos das amostras após o tratamento proposto. Verificou-se neste trabalho que os tratamentos utilizando os compostos de cálcio apresentaram similaridades para modificar o alérgeno de mamona, mostrando-se eficazes. Este fato foi avaliado pela redução da alergenicidade por quantificação da desgranulação de mastócitos (redução de 70% para aproximadamente 30%, valor observado no controle negativo) e por dosagem de histamina. Os resultados obtidos neste trabalho utilizando estes compostos contribuem para a obtenção de um produto mais seguro para manipulação dos trabalhadores e com possibilidade de expansão da aplicabilidade econômica, por exemplo, na alimentação animal. Por fim, de acordo com os dados descritos sobre a existência de reação cruzada entre alérgenos de mamona e alérgenos de outras fontes, os tratamentos propostos neste trabalho poderiam também ser utilizados para modificar outras proteínas alergênicas.
xv
Ricinus communis L. is a plant of the Euphorbiaceae family, known in Brazil as
mamona. It has a great economical importance due to the extracted oil of its seeds that is used for the synthesis of biodiesel. After oil extraction, a castor cake that contains high protein level is obtained, however, it can not be used for animal consumption due to toxic proteins (ricin) and allergenic (2S albumin). The recognition of epitopes of 2S albumin through the reaction between IgEs connected on the surface of the mast cells promotes the degranulation of these, which is defined as type I hypersensitivity. The present study has the objective to carry out chemical treatments with purified 2S albumin and the crude castor cake for to deactivate the allergenic epitopes. The chemical method used consisted of treatments with compounds of calcium added to 2S albumin samples and castor cake, in treatments separate. The samples were incubated with a solution of calcium hydroxide, calcium carbonate or calcium oxide, 4 and 8% in the ratio of 1:1 (v/v), during 12 hours, at the room temperature. The biological assay, used to assess the allergenic activity of these samples, consisted of the quantification of mast cells degranulation of peritoneal fluid of rats and of histamin released from these cells. Degranulation assay using the cells RBL-2H3 were used as another method to confirm the deactivation of the epitope deactivation of the samples after treatment. The treatments using compounds of calcium verified in this work showed similarities to modify the allergen of castor bean and all they are effectives. This was valued by reducing the allergenicity by quantification of mast cells degranulation (reduction of 70% to approximately 30% value observed in the negative control) and histamine determination. The results obtained in this work using these compounds contribute to get of a safer product for manipulation of the workers and with the possibility of expanding the economical applicability, for example, in animal feed. Finally, according to the data described about the existence of cross-reactivity between castor bean allergens and allergens from others sources, the treatments proposed in this work could also be used to modify other allergenic proteins.
1- INTRODUÇÃO
A mamoneira (Ricinus communis L. – Figura 1) é uma oleaginosa conhecida desde a Antiguidade por suas propriedades medicinais e como azeite para iluminação (SANTOS et al., 2007; AZEVEDO & LIMA, 2001). É um vegetal pertencente à família Euphorbiaceae e sua origem não é muito bem esclarecida, devido a alguns autores divergirem, em sendo ora asiática, ora africana, e até mesmo, como planta nativa da América. Sementes e outros objetos encontrados nos túmulos comprovam que a mamona já era utilizada pelos egípcios há pelo menos 4000 anos (FELIX et al., 2008; SANTOS et al., 2007; FORNAZIERE JÚNIOR, 1986).
Figura 1: Partes da mamona, folhas, flor
e fruto. Disponível em:
http://www.vivercidades.org.br/publique22 2/media/florianas_mamona.jpg. Acesso em: 10/01/2009.
No Brasil a mamona é conhecida como carrapateira, rícino ou palma cristi. Este vegetal cresce adequadamente em regiões que apresentam temperatura temperada ou tropical, sendo uma espécie tolerante à seca e exigente em calor e luminosidade, encontrada em diversas partes do mundo. Admite-se que essa euforbiácea é conhecida no país desde a era colonial quando sua cultura foi
introduzida durante a colonização portuguesa, devido à vinda dos escravos africanos, onde nesta época, o óleo extraído de suas sementes era utilizado para lubrificar eixos de carroças (SANTOS et al., 2007; AZEVEDO & LIMA, 2001). Atualmente ela está disseminada por quase todo o território nacional, sobretudo no nordeste, cujas condições climáticas são as mais adequadas ao seu desenvolvimento (não deixando, porém, de existir em todo o país) (FORNAZIERE JÚNIOR, 1986).
1.1 - ECONOMIA DA MAMONA:
Segundo o Banco de Desenvolvimento de Minas Gerais S. A., da mamona se aproveita tudo, já que as folhas servem de alimento para uma espécie do bicho da seda e a haste, além de celulose própria para a fabricação de papel, fornece matéria-prima para a produção de tecidos grosseiros. Além dessas aplicações, as hastes e as folhas podem ser utilizadas na melhoria das características físicas e biológicas do solo, e a folha ainda serve para aumentar a secreção láctea das vacas (AZEVEDO & LIMA, 2001).
A mamona é cultivada em várias partes do mundo; da industrialização de sua semente obtém-se o óleo e a torta, sendo o primeiro, o principal produto, e o segundo, um produto com capacidade de restaurar terras esgotadas (SANTOS et
al., 2007; AZEVEDO & LIMA, 2001). O óleo é extensivamente utilizado para fins
medicinais e industriais, podendo ser empregado em rotas de síntese de muitos produtos, como cosméticos, lubrificantes, polímeros, etc (CHIERICE & NETO, 2007; ANANDAN et al., 2005). Comparações entre temperatura e quantidade de óleo têm demonstrado que o teor de óleo das sementes é proporcional à soma do calor recebido pela planta em todo o seu ciclo vegetativo. Portanto, embora se adapte em regiões subtropicais, se não houver bastante calor, a planta reduz a qualidade do óleo e, conseqüentemente, a produtividade das sementes (FORNAZIERI JÚNIOR, 1986).
A mamona apresenta grande potencial para ser cultivada em amplas áreas do território brasileiro, em razão de apresentar expressiva resistência à seca, exigência em calor e luminosidade e, se adaptar perfeitamente ao clima semi-árido (CARTAXO
et al., 2004). A mamona pode ser considerada uma das oleaginosas tropicais mais
adversas, à multiplicidade de aplicações industriais e medicinais de seu óleo (óleo de rícino) e de seus produtos e, ao valor de sua torta (farelo restante das sementes após a extração do óleo) utilizada como fertilizante (FORNAZIERI JÚNIOR, 1986).
No mercado mundial, no período compreendido entre 1978 e 2004, a Índia, a China e o Brasil se mantiveram como principais produtores de mamona em baga (semente descascada) (SANTOS et al., 2007). Na América do Sul, o Paraguai é o produtor tradicional de mamona, com produção variável entre 10.000 e 25.000 toneladas anuais de mamona em baga (SAVY FILHO, 1999). No Brasil, a partir da safra de 2001/2002, graças ao grande interesse mundial pelas fontes renováveis de energia para substituição gradual das fontes minerais originárias do petróleo, tornou-se evidente um programa nacional de estruturação da produção de mamona nos estados do semi-árido brasileiro (BANDEIRA et al., 2004). No país, a produção em escala comercial e tradicional da mamona no semi-árido é concentrada no estado da Bahia, onde na safra de 2004/2005, foram colhidos 182.459 mil hectares com produção estimada de 132.324 mil toneladas (SANTOS et al., 2007).
Com relação à produção mundial de biodiesel de mamona, no período compreendido entre 2002 a 2003, 1,3 milhões de toneladas foram sintetizadas, sendo deste total, aproximadamente 0.51 milhões de toneladas somente pela Índia (BARNWAL & SHARMA, 2005). No Brasil, as indústrias de extração do óleo de mamona em atividade estão instaladas na Bahia, em Minas Gerais, no Mato Grosso e em São Paulo e, a capacidade destas empresas é suficiente para processar 440 mil toneladas/ano de mamona em baga, gerando, num período de 200 dias/ano, o equivalente a 198 mil toneladas de óleo (SANTOS et al., 2007).
1.2 - SEMENTE:
A semente da mamoneira é muito variável, envolvendo cor, forma, tamanho, peso, proporção do tegumento, presença ou ausência de carúncula e, maior ou menor aderência do tegumento ao endosperma (FERNANDES, 2008). A composição química das sementes de mamona varia com o cultivar e com a região de cultivo, sendo que cerca de 90% do total de óleos presentes na semente representam o ácido graxo ricinoléico (C17H32OHCOOH) que é extraído da semente
ou da baga por meio de máquinas apropriadas. A extração do óleo da semente ou da baga é realizada por meio de máquinas apropriadas em que o método utilizado
para se extrair o óleo pode ser por prensagem, a frio ou a quente, ou extração por solvente, observe a Figura 2.
Figura 2: Fluxograma do processo de extração do óleo da
semente de mamona (adaptado de FREIRE et al., 2007).
O óleo da mamona possui a capacidade de ser solúvel em álcool devido aos três grupos hidroxílicos e à posição da dupla ligação na cadeia, o que o torna eficaz para ser eficaz para a produção de biodiesel. Segundo dados da Embrapa de 2001 obtêm-se de cada 100 Kg de mamona em bagas, 45 Kg de óleo e 50 Kg de farelo e torta (SANTOS et al., 2007). Alguns compostos, também encontrados nas sementes da mamona, impedem a ampla aplicação de produtos originados de seu processamento, como por exemplo, a proteína ricina (toxoalbumina) e o alcalóide ricinina, que são produtos tóxicos, e uma fração alergênica que se trata de um conjunto de glicoproteínas denominado CB-1A - Castor-bean allergen (BEWLEY & BLACK, 1994).
1.2.1 - O óleo:
O óleo extraído das sementes de mamona abriga moléculas com propriedades bastante flexíveis e estrutura, de certa forma incomum entre os ácidos graxos existentes nos óleos vegetais. Segundo Vieira e colaboradores (1998) essas características conferem, ao óleo da mamona, grande versatilidade química dentro do ramo industrial, permitindo sua utilização em mais de 400 processos industriais.
A maior parte do óleo extraído da mamona é usada na fabricação de tintas, vernizes, cosméticos e sabões. É utilizado também na produção de plásticos e de fibras sintéticas, sendo essas últimas, antitóxicas e antialérgicas. Salienta-se
Semente Pré-limpeza Aquecimento Extração por prensagem Óleo Extração por solvente Óleo Torta Farelo
também que este óleo, devidamente processado, é um excelente lubrificante, sendo ideal para motores de alta rotação, como foguetes espaciais e, os sistemas de freios dos automóveis. O óleo desta oleaginosa pode ser utilizado na fabricação de corantes, anilinas, desinfetantes, germicidas, óleos lubrificantes de baixa temperatura, colas e aderentes, base para fungicidas, inseticidas, tintas de impressão, vernizes, nylon e matéria-plástica. Outro uso deste óleo é na biomedicina, na elaboração de próteses e implantes, substituindo o silicone, como ocorre em cirurgias ósseas, de mama e de próstata (SANTOS et al., 2007; OGUNNIY, 2006; MENEGHETTIA et al., 2006; AZEVEDO & LIMA, 2001).
Alguns pesquisadores admitem que o óleo de mamona seja o melhor óleo vegetal para a produção de biodiesel, por ser o único solúvel em álcool e não necessitar de calor, reduzindo o gasto de energia para sua transformação em combustível (BELTRÃO & LIMA, 2007; OGUNNIY, 2006; MENEGHETTIA et al., 2006; PARENTE, 2004). Uma série de estudos vem sendo realizados para tornar viável o uso da mamona para a produção de biodiesel, que é um combustível renovável, biodegradável, não corrosivo e ambientalmente correto, sucedâneo ao óleo diesel mineral (FORNAZIERI JÚNIOR, 1986). Segundo estudos internacionais, o Brasil, país que possui excelentes condições climáticas, com temperatura quente e úmida e com precipitações pluviais regulares, tem potencialmente a capacidade de abastecer o mercado com biodiesel, substituindo 60% do consumo mundial de óleo diesel de petróleo. Neste contexto, sabe-se que a proporção de fabricação de biodiesel é de 1.000 kg de óleo vegetal produzem 1.000 litros de biodiesel, sendo que, 1.000 kg de sementes de mamona produzem 470 kg de óleo vegetal (PARENTE, 2004).
1.2.1.1- Biodiesel:
A denominação de biodiesel para o novo combustível, composto basicamente de um éster monoalquílico e com rendimento térmico equivalente ao diesel de petróleo, foi usada pela primeira vez em 1988 por pesquisadores chineses (KNOTHE, 2001). O Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel (PNPB) define biodiesel como um combustível obtido de uma mistura de diesel fóssil e ésteres alcalinos de óleos vegetais ou gordura animal. Tecnicamente, biodiesel é um éster álcali de ácidos graxos, feito por transesterificação catiônica de óleos ou
gorduras, de plantas ou animais, com pequenas cadeias de álcoois tais como, o metanol ou etanol (NASS, 2007).
O biodiesel substitui, total ou parcialmente, o óleo diesel de petróleo em motores e pode ser usado puro ou misturado ao diesel em diversas proporções. A mistura de 2% de biodiesel ao diesel de petróleo é chamada de B2 e assim sucessivamente, até o biodiesel puro, denominado B100 (Disponível em http://www.biodiesel.gov.br/. Acesso em 10/01/09).
Levando em consideração o meio ambiente, biodiesel é considerado “carbono neutro” porque todo o dióxido de carbono liberado durante o consumo tem sido seqüestrado para a atmosfera para o crescimento da safra das oleaginosas. Estudos têm demonstrado que o consumo de biodiesel tem emitido menos poluente quando comparado ao diesel (BARNWAL & SHARMA, 2005). Embora o interesse em óleos vegetais como matéria-prima para combustíveis não seja recente, seu uso em motores esbarrava na elevada viscosidade e na necessidade de manutenção intensiva provocada pelo alto índice de resíduos de sua combustão. A solução para tais limitações foi idealizada por Chavanne, cientista belga que, em 1937, misturou álcool aos óleos vegetais e patenteou o processo de transesterificação (KNOTHE, 2001).
Muitos países estão buscando alternativas ao diesel derivado do petróleo por causa do aumento do preço de petróleo, sua escassez e a preocupação mundial com o meio ambiente (NASS et al., 2007). A União Européia é atualmente a líder global na produção de biodiesel e o uso, com a Alemanha e França contabiliza 88% da produção mundial, acompanhados pelos Estados Unidos, que produz 8% da produção mundial. Nos Estados Unidos, a produção de biodiesel tem aumentado de 1.9 milhões de litros em 1999 para 284 milhões de litros em meados de 2007. No Brasil, o progresso com relação ao biodiesel ocorreu em 2002, quando o ministro da ciência e da tecnologia iniciou o Programa brasileiro para desenvolvimento tecnológico do Biodiesel (ProBiodiesel). O Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel (PNPB) foi estabilizado (implantado) dois anos após, em dezembro de 2004 e, em 2005, a primeira planta de processamento de biodiesel foi estabelecida no estado de Minas Gerais, usando a mamona como fonte de óleo vegetal. O PNPB apresenta-se como um programa interministerial do Governo Federal que tem por objetivo a implementação de forma sustentável, tanto técnica, como
economicamente, a produção e uso do Biodiesel, com enfoque na inclusão social e no desenvolvimento regional, via geração de emprego e renda (NASS et al., 2007).
O Brasil é o maior produtor de combustível de origem vegetal, além do combustível 100% a base de álcool, adiciona-se 25% de álcool à gasolina comercialmente vendida (CARVALHO, 1988). Quando o país começou o programa de estudo e desenvolvimento de combustíveis alternativos e renováveis em 1930, ele iniciou como pioneiro na pesquisa em biodiesel e, em 1980, a Universidade Federal do Ceará obteve a primeira patente brasileira para o processamento do biodiesel. O uso de espécies de plantas oleaginosas para a produção do biodiesel no Brasil foi primeiramente proposto em 1975, coincidindo com o início do Pró-álcool. A iniciativa do biodiesel resultou no programa intitulado Pró-óleo, ou produção de óleos vegetais para propósito energético. O objetivo do Pró-óleo foi gerar excedentes de óleos vegetais para a produção de biodiesel competitivo com o petróleo. A meta inicial do Pró-óleo foi desenvolver um combustível baseado numa mistura de 30% de óleo vegetal com o óleo diesel, com a eventual substituição do diesel de petróleo por biodiesel. Porém, o Pró-Óleo não recebeu suporte financeiro suficiente para crescer e desenvolver-se, sendo descontinuado no ano de 1980 (NASS, 2007).
O país atualmente tem em vista a necessidade de mudança para alcançar a meta estabelecida em janeiro de 2005 pelo Programa Nacional de Produção e Uso do Biodesel - PNPB (Lei #11.097/2005), e introduzir na matriz energética brasileira o uso obrigatório de pelo menos 2% (B2) de biodiesel até 2008 e de 5% (B5) até 2013. O PNPB tem por diretrizes implantar um programa sustentável, promovendo inclusão social, garantir preços competitivos, qualidade e suprimento e, por fim, produzir o biodiesel a partir de diferentes fontes oleaginosas e, em regiões diversas. A Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (ANP) está avaliando várias solicitações para o financiamento do biodiesel, e com a abertura das novas fábricas de biodiesel propostas, a capacidade de produção do país será suficiente para alcançar a meta de 2008. Entretanto, um maior aumento no processamento será necessário para alcançar o requerimento legal de 5% de biodiesel para 2013 (BELTRÃO & LIMA, 2007; NASS et al., 2007). Em fevereiro de 2009, o governo brasileiro confirma a adição de 4% de biodiesel ao diesel para julho de 2009 e de 5% em 2010 (Disponível em: http://www.biodieselbr.com/noticias/bio/governo-confirma-b4-julho-b5-2010-27-02-09.htm. Acesso em 04/03/09).
Várias matérias-primas e várias tecnologias têm sido usadas para produção do biodiesel, contudo, para que sejam lucrativos, os biocombustíveis necessitam fornecer um ganho de energia em rede, ser ambientalmente correto, ter um custo competitivo, e ser produzido em quantidades suficientes, sem redução do suprimento alimentício. A agricultura brasileira é facilitada pelo clima quente, precipitação regular, muita energia solar, aproximadamente 13% da água potável do planeta e, muitos hectares de terras férteis cultiváveis. Como mostrado na tabela I, várias espécies de oleaginosas têm sido cogitadas como fontes para a produção do biodiesel e outras ainda estão sob investigação com potenciais matérias-primas para a produção de biodiesel, dentre elas o pinhão manso, cupuaçu, milho, murumu, etc. As matérias-primas para a produção de biodiesel no Brasil variam grandemente entre as regiões onde, a soja, o girassol, o algodão, a mamona, e a canola são crescidas no sul, sudeste, e regiões centrais; a palma africana, o babaçu, a soja e a mamona são encontrados nas regiões nordeste e norte (NASS et al., 2007).
Tabela I: Principais oleaginosas cultivadas no Brasil para a produção de biodiesel. Cultivo Fonte botânica do óleo Teor de óleo (%)
Palma africana (Elaeis guineensis) Semente 22.0
Avocado (Persea americana) Fruto 7.0–35.0
Babaçu (Attalea speciosa) Semente 66.0
Mamona (Ricinus communis) Grão 45.0–48.0
Coco (Cocos nucifera) Fruto 55.0–60.0
Canola (Brassica spp.) Grão 40.0–48.0
Algodão (Gossypium hirsutum) Grão 15.0
Amendoim (Arachis hypogaea) Grão 40.0–43.0
Soja (Glycine max) Grão 18.0
Girassol (Helianthus annuus) Grão 38.0–48.0
Fonte: MAPA (2006b); Cadernos NAE (2005).
Com relação ao melhor cultivar de mamona para ser empregado para produção de biodiesel, levando-se em consideração fatores como teor de óleo, níveis de ricina e de alérgenos nas sementes de mamona, os estudos realizados por Fernandes em 2008, objetivou verificar estes fatores em quatro cultivares de mamona amplamente utilizada para o plantio no Brasil, e em cinco linhagens utilizadas como intermediários na obtenção de novas cultivares pelo programa de
melhoramento desta oleaginosa no país. Observou-se neste estudo que as sementes dos cultivares IAC-226, BRS Nordestina e a linhagem SM Pernambucana são as mais apropriadas para o cultivo, com teor de óleo superior a 45%, níveis de ricina inferiores a 2% e concentrações de albumina 2S inferiores a 1,1%.
1.2.2 - A torta:
De acordo com Severino (2005), a torta é o principal produto da cadeia produtiva da mamona, produzida a partir da extração do óleo das sementes na proporção aproximada de 1,2 toneladas para cada tonelada de óleo extraída, ou seja, corresponde a 55% de peso das sementes, valor que pode variar de acordo com o teor de óleo da semente e do processo industrial de extração do óleo.
De acordo com Horton e Williams apud Chierice e Neto (2007) a torta da mamona é uma massa orgânica que fica retida nos filtros após a extração do óleo por prensagem; as características típicas deste produto, obtido em processos de prensagem a quente, apresentam após terem sido retiradas as toxinas e os alérgenos, dentre vários constituintes, 43% de proteínas, 35% de fibras, 10% de umidade, 8% de cinzas, 2% de óleo, 1% de fósforo, 0,5% de cálcio e 0,5% de magnésio.
Na Índia, o principal país produtor de mamona, cerca de 85% da torta são utilizados como fertilizante orgânico (KONNUR & SUBBARAO, 2004) por ser excelente fonte de nitrogênio e apresentar propriedades inseticidas e nematicidas (DIRECTORATE OF OILSEEDS RESEARCH, 2004); além disso, a torta pode ser usada como matéria-prima para a produção de aminoácidos, plásticos, em especial os biodegradáveis, colas e outros produtos (CHIERICE & NETO, 2007).
O principal uso da torta residual da extração do óleo de mamoneira é como adubo orgânico, que se constitui em um excelente fertilizante. A adição de torta de mamona no solo, com dosagens variando de acordo com a cultura e o tipo de solo e da riqueza ou não de nutrientes, além de suprir as necessidades nutricionais das plantas, aumenta o pH do solo, eleva o conteúdo de carbono e promove a melhoria geral na parte física do solo. A utilização da torta no solo, além de reduzir os nematóides e elevar o poder tampão e a capacidade de troca de cátions do solo, tem propriedade de reduzir a densidade aparente do ambiente em todos os tipos de solos, o que interfere positivamente no crescimento e no desenvolvimento radicular,
devido a melhor porosidade do solo, com rápida renovação adequada do oxigênio (FORNAZIERI JÚNIOR, 1986).
As indústrias processadoras da semente preferem comercializar a torta somente como fertilizante orgânico do solo, devido aos altos custos com os processos de desintoxicação, destacando seu uso na lavoura canavieira, desde as gerações passadas. Antes do conhecimento dos processos de desintoxicação, a utilização da torta se limitava à adubação do solo, entretanto, os avanços científicos neste ramo, poderão contribuir para aumentar sua utilização como ração animal (AZEVEDO & LIMA, 2001). A torta pode obter maior valor comercial se utilizada como alimento animal, mas esse emprego não tem sido possível até o momento, em virtude da presença de fatores tóxicos e alergênicos em sua composição e da inexistência de tecnologia industrial viável para seu processamento (FREIRE et al., 2007).
Apesar de apresentar um alto teor de proteínas dentre elas 60% são globulinas (solúveis somente em soluções salinas), 20% glutelinas (solúveis em ácidos e álcalis diluídos), 16% são albuminas (solúveis em água e tampões diluídos em pH neutro) e 4% são proteases (SILVA JR. et al., 1996), não se recomenda o uso da torta para ração animal, pois é tóxica devido à presença da proteína ricina (toxoalbumina), do alcalóide ricinina e do complexo alergênico, denominado de CB-1A (Castor-bean allergen) que é uma mistura de proteínas de baixo peso molecular e polissacarídeos. Atualmente sabe-se que o complexo alergênico CB-1A representa cerca de 12,5% do peso da torta, como determinado pelo teste de precipitação de antígenos diluídos. Este complexo é formado por cerca de 20 isoformas de proteínas com massa molecular entre 10 e 14 kDa, sendo pertencentes à classe das albuminas 2S. Duas isoformas alergênicas, Ric c1 e Ric c3 já se encontram seqüenciadas e com características biológicas bem determinadas (FELIX et al., 2008; SILVA JR. et al., 1996).
1.3 – COMPOSTOS TÓXICOS E ALERGÊNICOS DA MAMONA:
1.3.1 - Ricina:
A ricina é uma proteína encontrada exclusivamente no endosperma das sementes de mamona, não sendo detectada em outras partes da planta, como raízes, folhas ou caules. Representa de 1,5 a 2% do peso total da semente
(ANADAN et al., 2005; COOK et al., 2006). Ela é a principal responsável pela toxidez da torta de mamona e, está entre as proteínas de maior toxidez conhecida pelo homem (MOSHKIN, 1986).
Trata-se de uma proteína heterodimérica, Figura 3, com massa molecular de aproximadamente 65 KDa. Consiste de uma cadeia A (RTA), que exibe atividade catalítica, unida por uma única ponte dissulfeto a uma cadeia B (RTB), que possui propriedades lectina, sendo capaz de ligar-se à superfície de glicoproteínas contendo resíduos de galactose e N-acetil-galactosamina (BRANDT et al., 2005). A ricina é uma potente toxina que mata as células eucarióticas por inibir a síntese protéica. Assim, ela é uma proteína da classe de toxinas conhecidas como proteínas inativadoras de ribossomos, RIPs (COOK et al., 2006).
Figura 3: Estrutura secundária da ricina
(BRANDT et al., 2005).
As RIPs podem ser do tipo 1 (monoméricas) e do tipo 2 (diméricas). As RIPs tipo 1 apresentam apenas a cadeia A, que é uma glicosidase que remove um resíduo de adenina do RNA ribossomal 28S. O RNA então depurinado fica susceptível à hidrólise em pH alcalino, e em pH ácido na presença de anilina. A região do RNA ribossômico modificada é essencial para ligação do fator de alongamento, e os ribossomos modificados não podem dar suporte à síntese protéica (OLSNES et al., 1975). No entanto, RIPs tipo 1 não são tóxicas pois não possuem a cadeia B que é necessária para a ligação da toxina a célula alvo e para o
direcionamento intracelular da cadeia A (OLSNES, 2004). Quando estão presentes ambas as cadeias A e B, a toxina é classificada como RIP tipo 2, que é o caso da ricina (COOK et al, 2006).
A cadeia A da ricina é muito eficiente dentro da célula, apenas uma molécula inativa milhares de ribossomos por minuto. Assim, uma molécula pode inativar ribossomos mais rapidamente que a célula pode sintetizar novos ribossomos e, portanto, a mata (OLSNES & KOZLOV, 2001). Os estudos conduzidos por Brito & Tokarnia (1996) demonstram que a dose letal de sementes administradas por sonda intragástrica para coelhos seria de 2g/Kg.
Na área médica, a ricina tem se destacado entre um grupo de proteínas tóxicas que vêm sendo usadas como imunotoxinas, isto é, agentes terapêuticos empregados no tratamento de câncer e doenças auto-imunes (BRANDT et al., 2005; WOO et al., 1998; LORD et al., 1994).
A ricina é o principal empecilho para uso alimentar da torta da mamona para animais (NA et al., 2004). Neste contexto, a destoxicação da torta de mamona diz respeito, principalmente, a eliminação de ricina e, muitos grupos de pesquisa têm trabalhado a fim de alcançar esse objetivo. Anadan e colaboradores em 2005 obtiveram êxito utilizando processos físicos, baseados no calor – fervura, autoclave, forno de ar quente - e químicos baseados em álcalis – NaOH, Ca(OH)2, amônia.
Todos os métodos de destoxicação de torta de mamona para sua aplicação como ração animal devem garantir eficiência, sem gerar efluentes ou resíduos sólidos, não utilizar agentes químicos perigosos ou que causem riscos aos animais, além do mais, a tecnologia empregada deve ser economicamente viável. O uso da torta destoxicada como insumo para ração animal agrega valor a este outro produto obtido a partir do processamento da semente para síntese do biodiesel (Empresa Bombrasil, 2005).
1.3.2 – Alérgeno de mamona - Albumina 2S:
O termo alérgeno é utilizado para identificar substâncias que possuem a capacidade de promover duas ou três propriedades moleculares distintas: i) a propriedade para sensibilizar (isto é, induzir a produção de anticorpos de alta afinidade, particularmente da classe IgE, pelo sistema imune); ii) a propriedade de se ligar aos anticorpos IgE; e ainda, iii) a propriedade para ativar uma reação
alérgica (isto é, desencadear sintomas alérgicos em uma pessoa sensibilizada) (AALBERSE, 2000).
Os alérgenos vegetais em geral, são proteínas de defesa, que permitem a planta resistir aos estresses bióticos e abióticos. Muitos tecidos de plantas, que são consumidos por humanos, contêm milhares destas proteínas alergênicas. Aproximadamente 0.5% da população dos Estados Unidos é afetada por vários estágios da alergia alimentar mediada por imunoglobulina do tipo E (EL-AGAMY, 2007; BREITENEDER & RADAUER, 2004).
Os alérgenos de plantas são classificados dentro de famílias e superfamílias, baseados na estrutura e função. Elas são agrupadas dentro de uma mesma família se possuírem 30% (ou mais) de resíduos idênticos ou ainda se tiverem baixa homologia, mas apresentarem função e estrutura muito similares. Os alérgenos de origem vegetal mais abundante pertencem às superfamílias Cupin e Prolamina, sendo que as albuminas 2S pertencem à família das prolaminas. Existem também outros alérgenos pertencentes aos grupos das “proteínas relacionadas à patogênese” e profilinas (BREITENEDER & RADAUER, 2004). Adicionalmente tornou-se evidente que o nível de exposição e, as propriedades do alérgeno em si são importantes para a determinação do potencial alergênico (BREITENEDER & MILLS, 2005).
A existência da família prolamina é baseada na presença de um esqueleto conservado de oito resíduos de cisteína. Todas as proteínas dessa superfamília são de baixo peso molecular, além de serem ricas em cisteínas e apresentarem estrutura tridimensional semelhante e rica em α-hélice. Nesta família estão incluídas as proteínas transportadoras de lipídeo não específico (nsLTPs), os inibidores de α-amilase e de proteases, a prolamina de cereais e as albuminas 2S (BREITENEDER & RADAUER, 2004).
A família das albuminas 2S é um grupo de proteínas de reserva presente nas dicotiledôneas ou magnoliopsidas, além de serem os principais alérgenos da mamona. Estas proteínas são heterodiméricas e, apresentam massa molecular de 10.000 - 18.000 Da e altos teores de arginina, serina e glutamina. Sabe-se que algumas delas são inibidoras de proteases e outras podem ainda apresentar propriedades alergênicas (MACHADO & SILVA, 1992).
As albuminas 2S são sintetizadas em tempos específicos durante o desenvolvimento da semente e depositadas dentro dos vacúolos (corpúsculos
protéicos) durante o desenvolvimento da semente, para então serem degradadas durante a germinação, dando suporte ao crescimento da semente (AHN & CHEN, 2007; REGENTE & LA CANAL, 2001). Elas são sintetizadas no retículo endoplasmático rugoso, como um precursor protéico de alto peso molecular, Figura 4. Posteriormente este precursor é clivado proteoliticamente, gerando um peptídeo ligante e outros pequenos peptídeos (JOLLIFFE et al., 2004; SHEWRY et al., 1995). A glicosilação dessas proteínas pode ocorrer durante a síntese protéica e os carboidratos incorporados são, em sua maioria, manose e glicosamina (JOLLIFFE
et al., 2004; BEWLEY & BLACK, 1994).
Figura 4: Esquema do processamento do precursor das isoformas Ric c 3 e Ric c 1. A)
Precursor intacto com Peptídeo sinal em bege, pontes de enxofre em amarelo, Ric c 3 e Ric c 1 respectivamente em vermelho (cadeias leves) e em marrom (cadeias pesadas), peptídeos de ligação em azul; B) Perda do peptídeo sinal; C) Perda dos peptídeos de ligação com conseqüente separação das duas isoformas (Gomes da Silva, L).
Acreditava-se que as albuminas 2S fossem inativas metabolicamente, mas atualmente, devido à sua capacidade inibidora de proteinases, às propriedades alergênicas (MACHADO & SILVA, 1992), e à ação antifúngica (AGGIZIO et al., 2003), acredita-se que elas estejam envolvidas em funções de defesa constitutivas da planta (REGENTE & LA CANAL, 2001).
As propriedades alergênicas das albuminas 2S são resistentes à desnaturação térmica e química, podendo, mesmo após os tratamentos de desintoxicação, desencadear alergia por contato bem como por inalação (MACHADO & SILVA, 1992; SILVA JR. et al., 1996).
Historicamente (Figura 5), no ano de 1943, Spies e Coulson isolaram da semente de mamona uma fração protéica de baixo peso molecular, estável ao calor, que foi denominada CB-1A (castor bean allergens). No ano de 1947 a hipersensibilidade desencadeada por mamona foi descrita pela primeira vez e em 1977, Li e colaboradores isolaram e caracterizaram uma proteína das sementes de
Ricinus communis L. de baixo peso molecular com alto “teor” de glutamina que
mostrou propriedades similares àquelas da proteína anteriormente isolada de mamona. Posteriormente, no ano de 1978, Youle e Huang concluíram que CB-1A era a mesma proteína de reserva caracterizada por Li et al. em 1977. Em 1982, Sharief e Li isolaram e sequenciaram uma proteína das sementes de Ricinus
communis L. (Ric c 1), com coeficiente de sedimentação 2S, constituída de duas
subunidades unidas por pontes de enxofre. A menor contendo 34 aminoácidos (Ric c 1 cadeia leve) com massa molecular aparente de 4 kDa e a subunidade maior composta de 61 aminoácidos (Ric c 1 cadeia pesada) com massa molecular de 7 kDa.
Figura 5: Histórico das albuminas 2S de Ricinus communis L. 1943 - Spies e Coulson,
(CB-1A); 1977 - Li e colaboradores, isolaram e caracterizaram uma “outra”; 1978 – Youle e Huang; 1982- Sharief e Li, sequenciaram Ric c1; 1992 – Machado e Silva isolaram e sequenciaram Ric c3 (~11 KDa); Atualmente: ~ 20 isoformas de albuminas 2S já foram isoladas e parcialmente caracterizadas.
No ano de 1992, Machado e Silva isolaram e seqüenciaram um segundo alérgeno da semente de mamona, denominado de Ric c 3, tendo peso molecular em torno de 11 kDa, presente no mesmo precursor de 29 kDa de Ric c 1, como mostrado na Figura 6; este alérgeno teve sua estrutura completamente elucidada no ano de 1996. Desde 2003, muitas outras proteínas alergênicas, pertencentes à classe das albuminas 2S, têm sido identificadas nas sementes de mamona por Machado e colaboradores (FELIX et al., 2008; FREIRE et al., 2007).
1943 1977
1978
1982 1992
CB-1A Ric c1 Ric c3
Figura 6: Estrutura Primária do precursor das Albuminas 2S. Verde = cadeia leve e
cadeia pesada de Ric c 3; Marrom= cadeia leve e cadeia pesada de Ric c 1; Cinza = peptídeos que são eliminados durante o processamento (SILVA JR., 1996).
Muitos alérgenos de sementes pertencem a classe das albuminas 2S e, estes podem também ser encontrados no pólen de plantas como girassol, gergelim, amendoim e castanha; alérgenos semelhantes estão também presentes em algumas fontes animais como peixe e camarão. Tais proteínas possuem estruturas semelhantes o que poderia promover reações cruzadas entre tais alérgenos. Alguns exemplos de alérgenos dessa família são: Ber e1, de castanha do Maranhão (Bertholletia excelsa), Jug r1, de noz (Juglans regia) (BREITENEDER & RADAUER, 2004).
1.4 – HIPERSENSIBILIDADE:
O termo alergia ou hipersensibilidade refere-se a um estado alterado ou anormal do sistema imune no qual, se o antígeno estiver presente e, o estado imunológico humoral (anticorpos) ou celular se encontrar em nível intensificado, pode ocorrer uma reação excessiva que conduzirá a grandes danos aos tecidos. Relembrando que, o organismo que teve uma pré-exposição a um determinado antígeno e, subseqüentemente, tem contato com o mesmo antígeno, a resposta imunológica é reforçada (EL-AGAMY, 2007). As células do organismo previamente sensibilizado, ao entrar em contato com o alérgeno, são atraídas para o local de inoculação do antígeno e, estas, orquestram mecanismos celulares para tentar eliminar e/ou proteger o corpo de maiores danos, contribuindo assim, para exacerbar os sintomas nos indivíduos alérgicos (SICHERER & LEUNG, 2008).
De acordo com a classificação de Coombs e Gell (apud ROITT et al., 2003), quatro tipos de reação de hipersensibilidade são descritas (I, II, III, IV), dentre as quais, as três primeiras dependem da interação do antígeno com o anticorpo humoral e são denominadas reação de tipo “imediato”; e o quarto tipo de reação
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envolve receptores ligados à superfície do linfócito, apresentando maior duração, sendo, por isso, denominada de hipersensibilidade do tipo tardio (EL-AGAMY, 2007; SICHERER & LEUNG, 2008).
O tipo I de hipersensibilidade, ou também conhecida como hipersensibilidade imediata, depende da reação entre um antígeno com o anticorpo específico IgE ligado na superfície dos mastócitos e/ou basófilos através do fragmento Fc, conduzindo a liberação do conteúdo dos grânulos (histamina, leucotrienos e fator de ativação de plaquetas, fatores quimiotáticos de eosinófilos e neutrófilos) (MAINTZ & NOVAK, 2007). As moléculas de IgE específicas se ligam, através do receptor FcЄRI de alta afinidade, na superfície de mastócitos teciduais e basófilos circulantes (primeira sensibilização).
A hipersensibilidade citotóxica envolve a morte de células que possuem o anticorpo ligado a um antígeno de superfície; este tipo de hipersensibilidade é do tipo II e a morte celular se processa pelas células fagocíticas que se ligam através do reconhecimento com IgG ou C3b, ou por lise mediada pelo sistema complemento que é constituído de um conjunto de proteínas presentes no sangue que complementam a ação dos anticorpos (GIERAS et al., 2007).
Outros tipos de anticorpos podem formar complexos imunes na circulação que podem se depositar, principalmente, nos vasos sanguíneos, levando a lesão mediada pela ativação do complemento, atração dos leucócitos e agregação plaquetária, sendo esta reação, admitida como do tipo III de hipersensibilidade (SICHERER & LEUNG, 2008).
Por fim, o tipo IV de hipersensibilidade é caracterizado como sendo celular ou do tipo tardio (DTH) e é baseada na interação do antígeno com células T pré-sensibilizadas. Estas são produzidas no timo e possuem receptores específicos em sua superfície que quando estimuladas pelo contato com o antígeno apresentado por APCs, elas internalizam o mesmo, o processam e posteriormente apresentam-no em associação com moléculas do MHC de classe II à linfócitos CD4+ (ROITT et al.,
2003).
Em processos alérgicos ocorre a tendência ao desenvolvimento de fortes respostas de hipersensibilidade imediata, e neste mecanismo estão envolvidos reações imunes humorais (hipersensibilidade do tipo I) e mediadas por células (hipersensibilidade do tipo IV). Numa reação alérgica, o epitopo ou determinante antigênico, que é a menor porção do antígeno com potencial de gerar a resposta
imune é reconhecido pelas imunoglobulinas do tipo E, desencadeando todo o processo alérgico. Estes epitopos são compostos por resíduos de aminoácidos seqüenciais ao longo da cadeia polipeptídica (epitopo linear ou contínuo) ou por resíduos não-sequenciais oriundos de segmentos linearmente afastados, que após a montagem da conformação da proteína permanecem unidos (epitopo conformacional ou descontínuo) (GIERAS et al., 2007; ALEKSEEVA et al., 2007; SCHEIN et al., 2005; WOLFF et al., 2004). Os epitopos contínuos são mantidos após uma desnaturação, contudo, os epitopos conformacionais são perdidos (ABBAS, 2003).
Sabe-se que as manifestações das respostas alérgicas acontecem de maneira diferente de um organismo para outro, porém, todas estas respostas se iniciam por um processo silencioso, conhecido como sensibilização (LICHTENSTEIN, 1993). A sensibilização de um organismo se inicia com um primeiro contato de um antígeno, normalmente uma proteína, que induz alergia, sendo denominado alérgeno. Esta substância, ao penetrar no organismo por vias aéreas ou por outros tecidos, é encontrada por células apresentadoras de antígenos (APCs), como macrófagos e/ou células dendríticas, que endocitam esta substância estranha que sofre clivagem proteolítica; os fragmentos peptídicos gerados, também conhecidos como ‘epitopos de célula T” são direcionados para a membrana externa da APC pelo complexo de histocompatibilidade principal de classe II (MHC II), na forma de um complexo, peptídeo – MHC de classe II (ALEKSEEVA et al., 2007; LICHTENSTEIN, 1993). Os linfócitos T auxiliares (TH 1 e/ou TH 2) reconhecem esses epitopos expostos e juntamente com os linfócitos B iniciam a resposta imunológica. A ativação de clones de células TH 2, específicas para o antígeno, é essencial para o desenvolvimento de doenças atópicas, pois estas células ativadas pelo contato com APCs produzem quantidades relativamente grandes de citocinas, interleucinas 4 (IL-4) e 5 (IL-5), que podem, dentre outras funções, atuar como sinais para a biossíntese de IgE pelos linfócitos B, que se associam aos receptores FcЄRI que estão ligados na superfície dos mastócitos e basófilos (KAMBAYASHI & KORETZKY, 2007).
Numa subseqüente exposição ao mesmo antígeno, conhecida como segunda sensibilização, expressiva resposta alérgica é observada. Após a interação do alérgeno com o tecido humano, ocorrerá ligação cruzada entre os segmentos específicos do antígeno (epitopo de IgE) e as IgEs anteriormente ligadas aos
receptores FcЄRI nos mastócitos e/ou basófilos, promovendo a ativação de mensageiros intracelulares e posterior liberação de mediadores celulares, como histaminas e prostaglandinas, que por sua vez induzirão mudanças fisiológicas e anatômicas que desencadearão os sintomas alérgicos da hipersensibilidade imediata, conforme o esquema da Figura 7 (KAMBAYASHI & KORETZKY, 2007; ABBAS et al., 2003).
Figura 7: Esquema da deflagração da alergia na presença
do alérgeno. (1) Primeiro contato do antígeno com células apresentadoras de antígenos (APCs) do organismo do indivíduo; (2) Apresentação do peptídeo pata linfócitos T via complexo peptídeo – MHC de classe II; (3) Linfócito T produz citicinas estimulatórias; (4) Linfócito B estimulado produzindo IgEs específicas; (5) e (6) IgEs específicas se ligam, através do receptor FcεRI, a superfície de mastócitos teciduais e basófilos circulantes, respectivamente; (7) Segunda sensibilização do organismo e ligação-cruzada; (8) Liberação do conteúdo dos grânulos celulares (por exemplo histamina).
1.4.1 - Imunoglobulina do tipo E (IgE):
A IgE é uma imunoglobulina dimérica, que possui peso molecular de 188 kDa e que possui nível sérico (média em adulto mg ml-1) de 5 x 10-5 (JANEWAY et al., 2002). É diferente das outras imunoglobulinas porque possui um domínio extra de região constante, uma estrutura diferente para a região da dobradiça e sítios de ligação diferentes para ambos os receptores de alta e baixa afinidade, FcЄRI e FcЄRII, respectivamente (ROITT, 2003).
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O isotipo de imunoglobulina IgE contém a cadeia pesada Є, está presente em baixas concentrações no plasma (1µg/ml) e circula como um anticorpo bivalente. As regiões variáveis (V) da cadeia pesada e leve da IgE são as mesmas que de outras imunoglobulinas. O gene épsilon (Є) codifica as regiões constantes (C) para esta imunoglobulina e a IgE é produzida devido a alteração de isotipo da cadeia pesada que é uma mudança sofrida pelos linfócitos B ativados que começam a expressar outras classes de cadeias pesadas de imunoglobulinas, que não µ para IgM e δ para IgD, e sim cadeias γ para IgG, α para IgA ou Є para IgE (ABBAS, 2003).
A biosíntese de IgE é realizada pelo linfócito B e, esta produção é regulada por diferentes fatores como, a herança biológica, a exposição ao antígeno e as citocinas de células T (ALEKSEEVA et al., 2007).
O anticorpo IgE proporciona o reconhecimento do antígeno para as reações de hipersensibilidade imediata, na qual um antígeno é reconhecido por linfócitos B, que se diferenciam em plasmócitos que sintetizam IgE específicas. Estes anticorpos se ligam na superfície de mastócitos ou basófilos através de receptores FcЄRI de alta afinidade e, com adjacente exposição a este mesmo antígeno, desencadeia-se uma reação por ligação cruzada das moléculas de IgE, com posterior ativação dos mastócitos e, subseqüente liberação de seus mediadores (KAMBAYASHI & KORETZKY, 2007; ABBAS et al., 2003).
Como mencionado anteriormente, esta imunoglobulina é reconhecida somente pelas células que expressam o receptor específico (FcЄRI) de alta afinidade em condições de repouso, como é o caso de mastócitos, nos tecidos, e basófilos na circulação (KAMBAYASHI & KORETZKY, 2007; ALEKSEEVA et al., 2007; GIERAS et al., 2007; RIVERA & GILFILLAN, 2006; SCHEIN et al., 2005). O mastócito e o basófilo são células que possuem a capacidade de liberar substâncias mediadoras que afetam a permeabilidade vascular quando ativados, participando, deste modo, na proteção das superfícies de mucosas contra patógenos (JANEWAY
et al., 2002).
O processo que atrai as células que contém histamina para o local de entrada do alérgeno no organismo, é uma das razões para que os indivíduos alérgicos tornem-se mais sensíveis (ROITT, 2003). Observa-se também, que indivíduos atópicos, ou seja, aqueles pré-dispostos a hipersensibilidade imediata, possuem maiores títulos de IgEs no sangue que os não atópicos, aumentando portanto o
reconhecimento do antígeno pelo organismo e, desencadeando os sintomas da alergia (ALEKSEEVA et al., 2007).
1.4.2 - Receptor FcЄRI:
Os FcЄRI são receptores que se ligam na IgE na superfície dos mastócitos e basófilos, Figura 8. Esses receptores são expressos na superfície de mastócitos e basófilos e se apresentam como um receptor tetramérico composto de uma cadeia α, uma cadeia β e duas cadeias γ que são compartilhados com outros receptores imunes (KAMBAYASHI AND KORETZKY, 2007; RIVERA AND GILFILLAN, 2006).
Figura 8: Estrutura do receptor FcЄRI
compreendido de uma cadeia α que se liga a IgE, uma cadeia β transmenbrana e um homodímero de cadeia γ. Ambas cadeias β e γ contém ITAM. (RIVERA AND GILFILLAN, 2006).
A cadeia α é responsável pela ligação a molécula de IgE e as cadeias β e γ participam na transdução de sinais na célula. Na ligação-cruzada do FcЄRI com complexos de antígenos/IgE, a agregação de múltiplos complexos resulta na transfosforilação de regiões do tipo ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) da cadeia β e γ por Lyn (proteína da família Src – tirosino quinases que não são receptores) que está constitutivamente associada a cadeia β (KAMBAYASHI AND KORETZKY, 2007; RIVERA AND GILFILLAN, 2006).
