4.1- AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ALERGÊNICA:
4.1.1- Morfologia celular - Microscopia óptica:
A atividade alergênica foi investigada por ensaios de ativação dos mastócitos e, a desgranulação foi desencadeada por albumina 2S e, posteriormente, avaliada por visualização e contagem das células íntegras e desgranuladas no microscópio óptico e/ou por quantificação da histamina liberada. As figuras 14 (A, B e C) mostram mastócitos sem qualquer tratamento para ativação e as figuras 14 (D e E e F) ilustram mastócitos sensibilizados por soro de albuminas 2S de R. communis L. e na presença do alérgeno.
Para verificar as mudanças morfológicas sofridas pelas células ao serem incubadas com albumina 2S de mamona, as mesmas foram observadas e monitoradas durante diferentes tempos de incubação (0, 15, 30, 45, 55 e 60 minutos).
As células obtidas da cavidade peritoneal do rato foram mantidas inicialmente na presença de DMEM e, posteriormente, expostas ao “pool” de albumina 2S de mamona. Nestes ensaios utilizou-se como fonte de IgE específica o “pool” anti-albumina 2S produzidos em ratos (RA/Thor) que foram imunizados contra anti-albumina 2S de mamona.
Transcorrido o tempo de cada amostra, as células foram coradas por azul de toluidina e observadas através do microscópio óptico acoplado a uma filmadora para a captura das imagens. Os mastócitos demonstrados na figura 14 abaixo, fotos (A), (B) e (C) foram utilizados como padrões de células íntegras e, os mastócitos das fotos (D), (E) e (F) foram utilizados como exemplos de células desgranuladas.
Figura 14: Mastócitos do lavado peritoneal de rato corados por azul de toluidina,
após exposição à albumina 2S na presença de soros como fonte de IgE específica. Mastócitos sem ativação: A) tempo 0; B) após 30 minutos; C) após 60 minutos; Mastócitos ativados: D) tempo 0; E) após 30 minutos; F) após 60 minutos; Aumento de 400X.
Após contagem dos mastócitos íntegros e desgranulados, observamos que a fração enriquecida com os mastócitos (controle negativo) apresentou cerca de 30% de desgranulação, tanto na ausência, como na presença de soro total, indicando que este percentual de desgranulação é inerente ao processo empregado para o isolamento dos mastócitos ou reflete as condições fisiológicas do animal. Valores similares foram encontrados quando albumina 2S foi incubada com os mastócitos na ausência de soro total. No entanto, quando os mastócitos foram sensibilizados com o soro total e a albumina 2S de mamona foi adicionada, observamos uma desgranulação de cerca de 70% das células.
Em todos os ensaios de desgranulação, após a visualização e contagem das células no microscópio óptico, uma alíquota foi retirada para quantificação de histamina.
4.1.2- Quantificação da desgranulação de mastócitos:
Antes de iniciarmos os tratamentos propriamente ditos com as amostras de albumina 2S e torta de mamona tratadas, primeiramente avaliamos o percentual de desgranulação promovido pelos compostos propostos para o tratamento químico. Nesse sentido, os compostos de cálcio, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio e óxido de cálcio, nas concentrações de 4 e de 8%, foram incubados com os mastócitos provenientes do lavado peritoneal de rato. A figura 15 apresenta os resultados obtidos após estas incubações. Podemos observar que esses compostos
A B C
na presença ou na ausência de IgE específica anti-albumina 2S são incapazes de ativar as células ao nível do controle positivo (albumina 2S + IgE específica) e desencadear uma resposta celular. A desgranulação das células frente aos compostos de cálcio foi de, aproximadamente, 40%. Esta etapa foi fundamental para podermos afirmar que o tratamento químico proposto e, conseqüentemente, o produto obtido não interfere biologicamente nos mastócitos de rato utilizados nos ensaios in vitro.
Figura 15: Desgranulação de mastócitos do lavado
peritoneal de rato (experimento controle). (1): Células-controle não estimuladas; (2): Albumina 2S + soro anti-albumina 2S; (3): Ca(OH)2 4%; (4): Ca(OH)2 8%; (5): CaCO3 4%; (6): CaCO3 8%; (7) CaO 4%; (8): CaO 8% (n=3, média ± D.P.; * P<0,001 em comparação com o controle positivo, pelo one way ANOVA, teste de comparação múltipla de Tukey).
A desgranulação dos mastócitos ao serem incubados com as amostras de albumina 2S e torta de mamona tratadas com os compostos de cálcio como descrito no item 3.3, também foi avaliada. Para tanto, as células obtidas do lavado peritoneal de rato foram submetidas a incubação com as amostras tratadas na presença de soro anti-albumina 2S de mamona. A Figura 16 abaixo evidencia a atividade alergênica das amostras de albumina 2S após os tratamentos com os compostos de cálcio. Pode-se observar que todos os tratamentos, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio ou óxido de cálcio, nas duas concentrações, promoveram a redução da alergenicidade das amostras de albumina 2S. Esta redução, demonstrada pelos ensaios de desgranulação de mastócitos de rato, mostrou-se significativa, apresentando-se próxima aos valores observados no controle negativo.
1 2 3 4 5 6 7 8 0 10 20 30 40 50 60 70 Amostras * * * * * * P o rc en ta g em d e d es g ra n u la çã o ( % )
Figura 16: Desgranulação de mastócitos do lavado peritoneal de rato
frente as amostras de albumina 2S tratadas, na presença do soro anti-albumina 2S. (Ct -) controle negativo: células não-estimuladas; (Ct +) controle positivo: células + albumina 2S sem tratamento; (A) Albumina 2S tratada com Ca(OH)2 a 4 ou 8%; (B) Albumina 2S tratada com CaCO3 a 4 ou 8%; (C) Albumina 2S tratada com CaO a 4 ou 8%; (n=3, média ± D.P.; * P<0,001 em comparação com o controle positivo, pelo one way ANOVA, teste de comparação múltipla de Tukey).
A figura 17 evidencia a atividade alergênica das amostras de torta de mamona após os tratamentos com os compostos de cálcio. Pode-se observar que todos os tratamentos, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio ou óxido de cálcio, nas duas concentrações, promoveram a redução da alergenicidade das amostras de torta de mamona, assim como observado nas amostras do alérgeno isolado (dado mostrado anteriormente – Figura 16). Esta redução, demonstrada pelos ensaios de desgranulação de mastócitos de rato, também se mostrou significativa, apresentando-se próxima aos valores observados no controle negativo.
Ct - Ct + 4% 8% 0 10 20 30 40 50 60 70 Ca(OH)2 (A) P o rc en ta g em d e d es g ra n u la çã o ( % ) * * Ct - Ct + 4% 8% 0 10 20 30 40 50 60 70 CaCO3 (B) P o rc en ta g em d e d es g ra n u la çã o ( % ) * * Ct - Ct + 4% 8% 0 10 20 30 40 50 60 70 CaO (C) P o rc en ta g em d e d es g ra n u la çã o ( % ) * *
Figura 17: Desgranulação de mastócitos do lavado peritoneal de rato frente
as amostras de torta de mamona tratadas, na presença do soro anti-albumina 2S. (Ct -) controle negativo: células não-estimuladas; (Ct +) controle positivo: células + albumina 2S sem tratamento; (T.N.) Torta Nativa: células + torta de mamona sem tratamento; (A) Torta de mamona tratada com Ca(OH)2 a 4 ou 8%; (B) Torta de mamona tratada com CaCO3 a 4 ou 8%; (C) Torta de mamona tratada com CaO a 4 ou 8%; (n=3, média ± D.P.; * P<0,001 em comparação com o controle positivo, pelo one way ANOVA, teste de comparação múltipla de Tukey).
4.1.3- Quantificação de histamina:
Para dosagem de histamina, empregamos inicialmente um processo de cromatografia de troca catiônica, em que o material foi fixado em uma coluna Shim-pack – amino – Na+ da Shimadzu, normalmente utilizada para a separação de componentes de fluídos fisiológicos. O material ligado foi eluído por dois tampões (Tampão citrato - ácido perclórico pH 3,2 e citrato - ácido bórico, pH 10,0) e posteriormente por NaOH 0,2M. A histamina foi eluída com cerca de 5 minutos de lavagem com este último eluente. Este processo durava cerca de 150 minutos e, baseado nesta observação, aperfeiçoamos os processos cromatográficos, ajustando a cromatografia para um método isocrático, de 10 minutos. Neste processo cromatográfico, foi utilizado somente o hidróxido de sódio (NaOH 0,2 M), num fluxo de 0,6 mL por minuto como eluente. Esta nova condição permitiu que os vários
Ct - Ct + T. N. 4% 8% 0 10 20 30 40 50 60 70 Ca(OH)2 (A) * * P o rc en ta g em d e d es g ra n u la çã o ( % ) Ct - Ct + T. N. 4% 8% 0 10 20 30 40 50 60 70 CaCO3 (B) * * P o rc en ta g em d e d es g ra n u lç ão ( % ) Ct - Ct + T. N. 4% 8% 0 10 20 30 40 50 60 70 CaO (C) P o rc en ta g em d e d es g ra n u la çã o ( % ) * *
componentes do meio DMEM utilizado nos ensaios de desgranulação fossem eluídos logo no início do processo, separando-se da histamina.
A padronização do método de dosagem de histamina mostrou-se linear para concentrações entre 1pmol e 125 pmols de histamina. Estes experimentos de padronização foram realizados em co-participação com FELIX, no nosso grupo de pesquisa, no ano de 2007. A Figura 18A mostra a sobreposição dos cromatogramas de histamina na concentração de 12,5 pmols com a histamina na concentração de 125 pmols preparados em 20 µL de DMEM. A Figura 18B mostra uma ampliação da sobreposição destes cromatogramas. Podemos observar que há uma boa resolução entre os componentes do DMEM e a histamina. A Figura 18C mostra a sobreposição dos cromatogramas de histamina a 1 pmol com a histamina na concentração de 12,5 pmols. A sobreposição realizada na Figura 18C demonstra que há uma boa resolução do método, mesmo em quantidades pequenas de histamina.
Figura 18: Padronização do método de dosagem de histamina. (A) Sobreposição do perfil
cromatográfico da histamina 12,5 pmols com histamina 125 pmols. A linha azul delimita o DMEM; (B) Ampliação da sobreposição do perfil cromatográfico da histamina 12,5 pmols com histamina 125 pmols; (C) Sobreposição do perfil cromatográfico da histamina 1 pmol com histamina 12,5 pmols (FELIX, 2007).
Após a padronização do método, verificando sua sensibilidade, iniciamos os procedimentos para avaliar o percentual de liberação de histamina das células obtidas do lavado peritoneal de rato. Nesta etapa, foi necessário, inicialmente, ajustarmos uma metodologia para romper os mastócitos a fim de liberar completamente o conteúdo de histamina contido nos seus grânulos. Deste modo, tempos gradativos de exposição ao ultrassom (10 a 60 segundos) foram empregados, sendo observado que 30 segundos foi a condição mais adequada para liberação total de histamina.
Como controle do processo de sonicação, uma solução contendo 125 pmol de histamina padrão por mL de DMEM foi submetida ao processo de sonicação por 30 segundos. Uma alíquota de 10 µL desta solução, após a sonicação, foi submetida ao processo cromatográfico e, foi observado que o processo da sonicação não foi destrutivo para histamina neste período de tempo.
Após as devidas padronizações para a quantificação da histamina, os ensaios de desgranulação utilizando mastócitos de rato foram conduzidos. As células foram observadas por microscopia óptica e 20µL do sobrenadante foi fracionado por cromatografia de troca catiônica para quantificação da histamina liberada. O volume remanescente foi sonicado, por 30 segundos, e uma alíquota de 20µL foi, novamente, submetida ao fracionamento cromatográfico para quantificação da histamina total.
A Figura 19A mostra a sobreposição dos cromatogramas referente a histamina liberada das células dos lavado de rato obtidos após a incubação dos mastócitos com albumina 2S na ausência de soro total e quando, os mesmos, foram sensibilizados na presença do soro total anti-albumina 2S e também, na presença do alérgeno (albuminas 2S). No experimento conduzido com albumina 2S de mamona em presença de IgE específica, podemos observar a liberação de histamina correspondente a desgranulação de mastócitos.
A Figura 19B mostra a sobreposição dos cromatogramas obtidos para a quantificação de histamina liberada no ensaio de desgranulação com os mastócitos de rato para histamina total (suspensão de células após sonicação). Neste experimento, as células foram ativadas com albumina 2S de mamona em presença de IgE específica.
Figura 19: Perfil cromatográfico da histamina liberada pelos mastócitos de rato.
(A) Incubação das células com albumina 2S na presença de IgE específica (rosa) e na presença de albumina 2S sem o soro (preto). (B) Incubação das células com albumina 2S na presença de IgE específica antes (rosa) e, após a sonicação (histamina total) (preto) (FELIX, 2007).
A Figura 20 apresenta a sobreposição dos perfis cromatográficos das amostras de albumina 2S de mamona nativa e após o tratamento com hidróxido de cálcio a 4%. Podemos observar que este tratamento com o Ca(OH)2 foi eficiente ao modificar os epitopos alergênicos presentes na amostra de albumina 2S e, deste modo, reduzir a alergenicidade desta amostra. Nesta figura podemos verificar que o nível de histamina liberada dos grânulos das células quando incubadas com
A
albumina 2S submetida ao tratamento com o hidróxido de cálcio foi menor quando comparado ao de histamina liberada dos grânulos celulares após incubação com albumina 2S nativa. A dosagem de histamina confirma os resultados provenientes do ensaio de desgranulação dos mastócitos de rato.
Figura 20: Sobreposição dos perfis cromatográficos da histamina
liberada das amostras de células incubadas com albumina 2S nativa e albumina 2S tratada com hidróxido de cálcio a 4%, após cromatografia de troca catiônica. Seta indica tempo de retenção da histamina.
Para a determinação do percentual de histamina liberada, associou-se os valores quantificados pelo método cromatográfico, com o número de células empregadas em cada ensaio, correlacionando esses valores com o total de histamina liberada após o processo de sonicação (Tabela II). Podemos observar que durante o processo de isolamento dos mastócitos ocorre cerca de 30% de desgranulação, o que implica na detecção de 2% de histamina. Quando as células são sensibilizadas com albuminas 2S na presença de IgE específica, a desgranulação foi superior a 60% e o percentual de liberação de histamina é maior que 50%. A histamina liberada dos grânulos dos mastócitos quando os mesmos foram incubados com a albumina 2S tratada com hidróxido de cálcio a 4% na presença de IgE específica encontrou-se, após detecção e quantificação, valores próximos aos níveis observados no controle negativo. Este resultado ratifica os dados obtidos nos ensaios de desgranulação, utilizando amostras de albumina 2S
Legenda:
__ Alb 2S tratada __ Alb 2S nativa
tratada com hidróxido de cálcio a 4%, já que a desgranulação resulta na liberação de mediadores, dentre eles a histamina (Figura 16A).
Tabela II: Porcentagem de desgranulação dos mastócitos e quantificação da histamina
liberada de seus grânulos após incubação com o “pool” de albumina 2S nativa e, com a albumina 2S após o tratamento com hidróxido de cálcio a 4%.
Amostra Desgranulação dos mastócitos (%) Histamina detectada (pmol) Histamina Sonicada (pmol) Histamina liberada (%) Controle negativo 33 0,2 10,6 2
Albumina 2S nativa sem soro
34 0,3 9,4 3
Albumina 2S nativa + soro (controle positivo)
61 1,5 2,7 56
Albumina 2S tratada + soro 40 0,4 5,6 7
A Figura 21 apresenta a sobreposição dos perfis cromatográficos das amostras de torta de mamona nativa e após o tratamento com hidróxido de cálcio a 4%. Podemos observar que este tratamento foi eficiente ao modificar os epitopos alergênicos presentes na amostra de torta e, deste modo, reduzir a sua alergenicidade. Nesta figura podemos verificar que o nível de histamina liberada dos grânulos das células quando incubadas com torta de mamona submetida ao tratamento com o hidróxido de cálcio foi significantemente menor quando comparado ao de histamina liberada dos grânulos celulares após incubação com torta nativa. A dosagem de histamina confirma os resultados provenientes do ensaio de desgranulação dos mastócitos de rato.
Figura 21: Sobreposição dos perfis cromatográficos da histamina
liberada das amostras de células incubadas com torta nativa e torta tratada com hidróxido de cálcio a 4%, após cromatografia de troca catiônica. A seta indica tempo de retenção da histamina.
Assim como realizado para os experimentos utilizando albumina 2S, os ensaios para determinação do percentual de histamina liberada dos mastócitos utilizando a incubação com a torta de mamona também foram submetidos a uma associação entre os valores quantificados pelo método cromatográfico e o número de células empregadas em cada ensaio, correlacionando esses valores com o total de histamina liberada após o processo de sonicação (Tabela III). Quando as células foram incubadas com concentrações elevadas da torta de mamona nativa ou tratada (1 mg/mL), 100 vezes acima da concentração utilizada para o alérgeno isolado, não foi possível observar de forma quantitativa a desgranulação dos mastócitos devido a presença de resíduos da torta que mascaravam a contagem. No entanto, podemos observar que o tratamento da torta com hidróxido de cálcio a 4% reduziu os níveis de liberação de histamina em cerca de 20%, ratificando os resultados obtidos nos ensaios de desgranulação utilizando amostras de torta de mamona tratada com hidróxido de cálcio a 4% (Figura 17A).
Legenda __ Torta nativa
__ Torta tratada
Tabela III: Porcentagem de desgranulação dos mastócitos e quantificação da histamina
liberada de seus grânulos após incubação com a torta de mamona nativa e, com a torta de mamona após o tratamento com hidróxido de cálcio a 4%. (*N.d.: não determinado em função dos resíduos da torta no meio reacional).
Amostra Desgranulação dos mastócitos (%) Histamina detectada (pmol) Histamina Sonicada (pmol) Histamina liberada (%) Controle negativo 33 0,2 10,6 2
Albumina 2S nativa sem soro
33,9 0,3 9,4 3
Torta de mamona nativa + soro (controle positivo)
N.d.* 14,3 16,3 87
Torta de mamona tratada + soro
N.d.* 28,6 44,8 64
Os outros tratamentos propostos com hidróxido de cálcio a 8%, carbonato de cálcio e óxido de cálcio a 4 e a 8%, para a desativação de epitopos alergênicos presentes nas amostras de albumina 2S e de torta de mamona somente foram avaliados biologicamente através de ensaios de desgranulação de mastócitos de rato, como mostrado anteriormente nas Figuras 16 e 17.
4.1.4- Quantificação de liberação da enzima ββββ-hexosaminidase:
A enzima lisossomal β-hexosaminidase foi quantificada a partir das células RBL-2H3, como descrito no item 3.4.3.1. A Figura 22 apresenta os resultados do ensaio de desgranulação utilizando esta linhagem celular. Estes experimentos foram conduzidos e realizados na Universidade de São Paulo - Campus de Ribeirão Preto e, para tanto, as concentrações de albumina 2S (amostra: 10 µg/mL) e de soro específico (soro total anti-albumina 2S: diluição 1:100), foram as mesmas utilizadas nos ensaios de desgranulação com as células do lavado peritoneal de rato, como descrito no item 3.4.2.
Neste experimento, o controle positivo, ou seja, as células quando estimuladas (EST) na presença do antígeno TNP (2,4,6-trinitrofenol) e da molécula de IgE anti-DNP (IgE anti-dinitrofenol), resulta num percentual total de liberação celular da enzima β-hexosaminidase de aproximadamente 30%, Figura 22 (barra 2). Com relação ao alérgeno de mamona, primeiramente, realizamos a comprovação de que ele necessita de moléculas de IgE específica para ativar e desgranular os mastócitos. Desta forma, foram utilizados dois tipos de incubação com
imunoglobulinas do tipo E, uma com IgE não-específica (IgE anti-DNP) e, outra com a IgE específica (IgE anti-albumina 2S) na presença das albuminas 2S de mamona. Como pode ser observado na figura 22 (barra 3), a incubação com a IgE inespecífica não desencadeou a ativação e liberação da enzima comprovando, desta forma, que a albumina 2S de mamona é dependente de moléculas de IgE específica. Outro tipo de incubação realizada neste experimento foi somente a adição da amostra de albumina 2S de mamona as células RBL-2H3 (barra 5), ensaio que não resultou na liberação enzimática.
Quando a amostra de albumina 2S de mamona (Figura 22 - barra 3) foi testada nas concentrações acima descritas e, na presença da molécula de IgE específica, observou-se baixa ativação e desgranulação das células, acontecimento quantificado pela liberação da enzima. Este evento pode ser explicado pela necessidade do teste com a linhagem celular requerer maior concentração de soro total e/ou de albumina 2S para ativar a desgranulação e, ensaios mais detalhados são requeridos.
Figura 22: Determinação da atividade biológica de albumina 2S de mamona pelo ensaio de
desgranulação com as células RBL-2H3. Barra 1: (NE) não estimulado, controle negativo; Barra 2: (EST) estimulado, controle positivo; Barra 3: Albumina 2S + IgE não específica; Barra 4: Albumina 2S + IgE específica; Barra 5: Albumina 2S. (n= 3, média± D.P.)
Os dados obtidos após a incubação das células RBL-2H3 com as amostras de albumina 2S (barras 3, 4 e 5) mostraram-se, através da quantificação de liberação a enzima β-hexosaminidase, não tão significativos quando em relação ao controle positivo, células estimuladas (EST). Estes resultados podem ser explicados pela necessidade de ajustes destes experimentos utilizando o alérgeno de mamona com
0 5 10 15 20 25 30 35
NE EST IgEantiDNP+A2S IgE espc+A2S A2S
% d e lib er a çã o d e b -h ex o sa m in id as e
esta linhagem celular, já que as concentrações utilizadas nestes ensaios foram as mesmas utilizadas para os ensaios de desgranulação com as células do lavado peritoneal de rato anteriormente descritas no item, 3.4.2. Outro fator a ser considerado, é que estes ensaios foram conduzidos na cidade de Ribeirão Preto-SP e, as amostras de albumina 2S e soro anti-albumina 2S foram transportadas da UENF-RJ até o campus da USP daquela cidade. Durante este transporte, o soro pode ter se desnaturado e, desta forma, interferido nos resultados dos experimentos com as células RBL-2H3.