Foram selecionados 30 pacientes, com idade entre 32 e 60 anos, e com diagnóstico compatível com periodontite crônica generalizada (Annals of Periodontology, 1999)3, sendo respeitados ainda os seguintes critérios de inclusão:
- boas condições de saúde geral;
- história médica negativa para problemas sistêmicos;
- história negativa de antibioticoterapia nos últimos seis meses antecessores ao estudo;
- história negativa de antiinflamatórios esteróides ou não-esteróides nos últimos três meses antecessores ao estudo, ou durante o mesmo;
- história negativa de gestação ou uso de contraceptivos hormonais; - não serem fumantes;
- presença de quatro sítios periodontais com profundidades de sondagem entre 3 e 5mm e quatro sítios com profundidades entre 6 e 10mm, com sangramento à sondagem e pouco cálculo subgengival.
Os pacientes confirmaram sua aceitação para participar do estudo mediante a assinatura de um termo de consentimento, previamente aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Odontologia de Araraquara, UNESP (Anexo 1).
Após a seleção dos pacientes, foram realizadas moldagens das arcadas dentais em alginato. Essas moldagens foram então vazadas em gesso-pedra e, sobre esses modelos, foram confeccionados guias, utilizando placas de
polipropileno de 1,0mm de espessura, prensadas em aparelho à vácuo (Bio-Art Equipamentos Odontológicos, São Paulo/SP – Brasil). O uso dessas guias teve por objetivo padronizar o posicionamento da sonda durante a realização do exame clínico.
Para tanto, o local indicado como ponto de inserção foi desgastado com brocas tronco-cônicas de haste longa para uso em baixa rotação, formando assim uma canaleta que permitia a inserção da sonda sempre no
mesmo lugar
(figura 1).
Figura 1 – Sondagem clínica sendo realizada com a placa de polipropileno em posição.
Todos os exames foram realizados por um único examinador, previamente calibrado.
Inicialmente foi estimado o índice de placa (Silness e Löe, 1964)37 e depois removida a placa supragengival, para evitar qualquer interferência da mesma durante a realização da coleta do fluido crevicular.
A.1 - Coleta do fluido crevicular
Para a realização da coleta do fluido crevicular para o exame microbiológico, os sítios foram isolados com rolos de algodão ou gaze estéril e, gentilmente secos com jato de ar. Cones de papel absorventes estéreis (nº20- 30, Diadent Absorbent paper points, Burnaby/B.C. - CAN) foram então introduzidos no sulco gengival, em direção apical (figura 2), até que uma leve resistência fosse sentida, permanecendo então no local por 30 segundos.
Figura 2 – Colocação do cone de papel absorvente para coleta do fluido crevicular.
Após sua remoção, os cones de papel absorventes foram colocados em tubos eppendorfs contendo 500 µL de solução salina tamponada (PBS) (pH 7.0) e congeladas.
O exame imunológico para a análise da presença de prostaglandina E2 e interleucina-1β foi realizado após o término do exame microbiológico, aguardando-se um período de aproximadamente 10 minutos, para evitar qualquer interferência da primeira coleta na obtenção das novas amostras. A metodologia empregada para essa nova coleta foi a mesma anteriormente citada sendo, para o exame imunológico, utilizado como meio de transporte uma solução à base de PBS, associada a um coquetel de inibidores de protease, para a manutenção da viabilidade das substâncias (Anexo 2 – fórmula e modo de preparo), proposto por Johnson et al. (1997)19.
A.2 - Exame clínico
Após a coleta do fluido foram determinados: o índice gengival (Löe, 1967)28; as medidas das profundidades de sondagem; do nível de inserção clínica e o sangramento à sondagem, utilizando sonda periodontal milimetrada do tipo Williams (Hu-Friedy Manufacturing Company, Inc., Chicago/IL - USA), de secção circular. As medidas foram anotadas em ficha própria (modelo em Anexo 3).
A verificação das profundidades de sondagem foi realizada considerando a porção mais apical sondável da bolsa periodontal e a margem gengival livre.
A recessão gengival foi mensurada pela distância entre a junção cemento/esmalte e a margem gengival livre
O sangramento à sondagem foi determinado pela presença (+) ou ausência (-) de sangramento observada durante 30 segundos, após a primeira inserção da sonda na bolsa periodontal.
Os pacientes foram submetidos então a uma raspagem supragengival em todos os dentes, e receberam ainda instruções de higiene oral, e foram acompanhados por um período de trinta dias, sendo realizadas durante esse período consultas semanais para motivação, orientação e monitoramento dos pacientes na reeducação dos procedimentos apropriados para o controle diário da placa bacteriana, de forma individualizada.
Ao final do período experimental foram repetidos novamente os exames clínico, microbiológico e imunológico, respeitando-se a mesma seqüência realizada no início do experimento.
B - Análise microbiológica
Para análise microbiológica foi utilizada a reação de polimerase em cadeia (PCR), pela qual identificou-se a presença das bactérias: Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia e Prevotella nigrescens.
Essa técnica baseia-se em reações enzimáticas cíclicas de desnaturação pelo calor, hibridização dos oligonucleotídeos e síntese enzimática de DNA, resultando na amplificação exponencial da seqüência do DNA
desejado, permitindo a identificação de seqüências de genes específicos, tais como genes de espécies bacterianas (Slots et al., 1995)38.
B.1 – Seleção e síntese dos oligonucleotídeos
Os pares de oligonucleotídeos (5’ - 3’), ou seja, os primers específicos para cada bactéria foram sintetizados pela Life Tecnologies do Brasil Ltda., São Paulo - SP, seguindo as seqüências propostas por Cesco (1999)6:
Porphyromonas gingivalis (593 pb) 5´AAT CGT AAC GGG CGA CAC AC 3´ 5´ GGG TTG CTC CTT CAT CAC AC 3´
Actinobacillus actinomycetemcomitans (557 pb) 5´ AAA CCC ATC TCT GAG TTC TTC TTC 3´ 5´ ATG CCA ACT TGA CGT TAA AT 3´ Bacteroides forsythus (641 pb)
5´ GCG TAT GTA ACC TGC CCG CA 3´ 5´ TGC TTC AGT GTC AGT TAT ACC T 3´ Prevotella intermedia (575 pb)
5´ TTT GTT GGG GAG TAA AGC GGG 3´ 5´ TAC ACA TCT CTG TAT CCT GCG T 3´ Prevotella nigrescens (1100 pb)
5´ TTA TGT TAC CCG TTA TGA TGG AAG 3´ 5´ ATG GCG AAA TAG GAA TGA AAG TTA 3´
Os oligonucleotídeos foram dissolvidos em uma solução de T.E. (10mM Tris HCL – pH 7,6; 1mM EDTA – pH 8,0), em volume calculado para a concentração de 25µM.
B.2 – Reação de PCR
A reação de PCR foi realizada seguindo a metodologia proposta por Cesco (1999)6.
As amostras contidas nos tubos de eppendorf foram descongeladas a temperatura ambiente, submetidas ao vortex por um minuto e, na seqüência, as pontas foram removidas com auxílio de uma pinça clínica estéril, comprimindo-as entre a tampa e o tubo. As amostras foram submetidas a banho de fervura por 10 minutos para a extração do DNA bacteriano, sendo posteriormente centrifugadas a 10000rpm – 10 minutos, utilizando-se 300µL do sobrenadante final, para aumentar a concentração das mesmas.
Para a reação de PCR foram utilizados tubos de eppendorfs específicos (Fisher Scientific), onde foram previamente preparados 45µL de uma mistura de reagentes contendo 31µL de água deionizada bi-destilada, 2,5µL de solução tampão (Invitrogen Life Technology, São Paulo/SP, Brasil), 2,7µL de cloreto de magnésio (Life Technology, São Paulo/SP, Brasil), 0,4µL de DNTp (Life Technology, São Paulo/SP, Brasil), 4,0µL do primeiro oligonucleotídeo de uma bactéria específica (25µM de concentração), 4,0µL do segundo oligonucleotídeo da mesma bactéria (25µM de concentração) e 0,4µL de Taq DNA polymerase (Life Technology, São Paulo/SP, Brasil). Os tubos com
as amostras foram submetidos ao vortex por dez segundos para a homogeneização da solução e, em seguida, foi obtida uma alíquota de 5,0µL da amostra que foi adicionada à mistura de reagentes e submetida ao aparelho termociclador (Gene Amp PCR System 2400, Perkin Elmer, Minster/Oh, USA) seguindo a seguinte programação: desnaturação a 95ºC por dois minutos, desnaturação a 95ºC por trinta segundos, fase de annealing dos oligonucleotídeos a 65ºC por um minuto e fase de extensão a 72ºC por um minuto, finalizando a reação a 72ºC por dois minutos. Esta seqüência foi seguida por trinta e seis ciclos.
B.3 - Eletroforese
A presença do DNA amplificado foi observada em eletroforese em gel de agarose a 1%. Os géis de agarose a 1% foram preparados com agarose ultrapura (Gibco BRL – Life Technology, São Paulo/SP, Brasil) em solução tamponante TBE 1X (tampão tris-borato-EDTA – pH 8,5).
Para a corrida eletroforética, 22µL da solução após a reação de PCR foram acrescidos de 2,5µL de solução corante de azul de bromofenol e homogeneizados para sua colocação nas canaletas do gel, acondicionado em uma cuba para corrida eletroforética horizontal (Cuba Horizon 11.14 – Life Technologies, São Paulo/SP, Brasil), conectada a uma fonte de energia (Eletrophoresis Power Supply -Model 250 - Gibco Brl - Life Technologies) (figura 3).
Figura 3 – Cuba de eletroforese com gel de agarose e canaletas preenchidas com as amostras coradas com solução de azul de bromofenol.
Para submersão do gel foi utilizada solução tamponante TBE 1X (tampão Tris-borato-EDTA). As corridas foram submetidas a uma corrente contínua de 72 volts por duas horas.
Após o término de cada corrida, o gel era corado com brometo de etídio (1µg/mL) durante quinze minutos, ao abrigo da luz, e as bandas presentes no gel (figura 4) foram observadas imediatamente com o auxílio de um transiluminador de luz ultravioleta (Ultra-Lum – Lab. Trade do Brasil Ltda. São Paulo/SP, Brasil) e fotografadas a seguir, com o auxílio de uma máquina digital (Kodak Digital Science, DC 40, Eastman Kodak Company, Rochester/NY, USA), diretamente sobre o transluminador de luz ultravioleta. Os resultados foram anotados em ficha específica (modelo em Anexo 4).
Figura 4 – Resultado das reações de PCR com oligonucleotídeo para Bacteroides forsythus, demonstrando reações positivas para solução com DNA de B. forsythus a 1/1000 (1), para algumas amostras (2 a 17) e reação negativa para água (18).
C - Análise imunológica
C.1 - Prostaglandina E2
Um kit enzimático (figura 5) para imunoensaio (Cayman Chemical Company, Ann Arbor/MI, USA) foi utilizado para medir a quantidade de PGE2 presente nas amostras de fluido crevicular. Este ensaio está baseado na competição entre a PGE2 da amostra (ou do padrão) e o traçador, para um número limitado de anti-soro anti-PGE2 de coelho nos sítios de ligação. A
641 pb
10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9
absorbância é proporcional à quantidade de traçador ligada ao orifício da placa, sendo inversamente proporcional à quantidade de PGE2 livre.
Figura 5 – Apresentação do kit enzimático.
O teste foi realizado seguindo-se as instruções do fabricante. Em resumo, cada orifício de uma microimunoplaca foi coberto com anticorpo monoclonal de ratos anticoelho e depois bloqueado com BSA, 50µL das oito diluições seriadas dos padrões formados por uma solução de prostaglandina que apresentava concentração inicial de 10 ng/mL foram colocados, em duplicata, nas duas primeiras fileiras da placa. Foram adicionados então, 50µL das amostras de fluido, previamente agitadas por um minuto, e 50µL do traçador (prostaglandina E2 conjugada a acetilcolinesterase). Para finalizar,
foram adicionados 50µL do anticorpo monoclonal (anti-soro de coelho anti- PGE2).
A placa foi encubada por um período de 18 horas a 4ºC, e depois os orifícios foram esvaziados e a mesma foi lavada cinco vezes com um tampão apropriado (tampão de lavagem, fornecido pelo kit). 200µL do reagente Ellman’s, que é enzimaticamente convertido em uma coloração amarela pela acetilcolinesterase, foram dispensados nos orifícios e a placa foi encubada por 90 minutos, em ambiente escuro, sendo efetuadas as leituras em um Espectrofotômetro UV/Visívlel de microplacas (Multiskar Ascent – Labsystems Uniscience, Vantaa/Finlândia), utilizando filtro de 405nm (figura 6).
Figura 6 – Espectrofotômetro UV/Visívlel de microplacas.
A absorbância foi convertida na concentração de PGE2 por amostra, de acordo com a curva padrão, e os resultados finais foram expressos pela concentração de PGE2 presente no fluido crevicular (ng/mL).
C.2 – Interleucina 1β
Para a realização do exame, foi utilizado um kit enzimático para imunoensaio (Cayman Chemical Company, Ann Arbor/MI, USA) específico para medir a quantidade de IL-1β presente nas amostras de fluido crevicular, seguindo as orientações do fabricante.
A metodologia deste kit é semelhante à do anterior porém, nesse caso, a concentração da citocina nas amostras é diretamente proporcional à intensidade de coloração resultante da aplicação do reagente Ellman’s (figura 7).
Figura 7 – Resultado final do kit, com a coloração amarela proporcionada pelo reagente Ellman’s, indicando a presença de IL-1β nas amostras.
Antes do preparo da placa, foram adicionados 25µL de soro não específico de rato em todas as amostras e também nos padrões. Os padrões foram utilizados em duplicata, sendo formados por uma diluição seriada de uma solução de interleucina com concentração de 5ng/mL. Inicialmente a placa foi
lavada com tampão de lavagem sendo colocados nas duas primeiras fileiras 100µL dos padrões e nas fileiras seguintes 100µL das amostras. Foram adicionados então 100µL do conjugado (acetilcolinesterase), em todos os orifícios, e a placa foi coberta com filme plástico e encubada por 18 horas.
Ao final do período de encubação a solução presente nos orifícios foi desprezada e a placa lavada cinco vezes com o tampão de lavagem. 200µL do reagente Ellman’s foram dispensados nos orifícios, a placa foi coberta e encubada em ambiente escuro por 30 minutos quando foram realizadas as leituras no espectrofotômetro.
Os resultados finais foram expressos em nanogramas por mililitros.
D. Análise estatística
Os dados experimentais foram submetidos à análise estatística, utilizando o programa de computador Graph Pad Prism 2.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego/CA, USA) sendo empregado o teste t de Student pareado para comparar as medidas iniciais e finais, com nível de significância a 5%.
Os parâmetros clínicos índice de placa e índice gengival foram dicotomizados para a realização da análise estatística, sendo considerados como 0 (zero) os valores correspondentes aos índices 0 e 1 e 1(um) os valores correspondentes aos índices 2 e 3.
A – Dados obtidos
A distribuição inicial dos 240 sítios analisados era de 145 (60,4%) localizados em dentes uni ou birradiculares e 95 (39,6%) em dentes multirradiculares. Dentre esses, 223 (92,9%) sítios estavam localizados na região interproximal e 17 (7,1%) nas faces livres dos dentes.
Os valores originais obtidos experimentalmente nas avaliações dos fatores de variação: índice de placa, índice gengival, profundidade de sondagem, nível de inserção clínica, sangramento à sondagem, exame microbiológico e imunológico estão dispostos no apêndice (Anexo 4).
Inicialmente, todos os sítios examinados apresentavam sinais clínicos de inflamação e sangramento à sondagem, sendo 120 sítios em bolsas com profundidade de sondagem de 3 a 5mm e 120 em bolsas de 6 a 10mm. Dos 240 sítios avaliados, 94 (39,17%) não apresentaram sangramento à sondagem durante a segunda avaliação. Para melhor demonstração dos efeitos do tratamento, foram analisados separadamente os resultados dos sítios que ainda apresentavam sangramento no segundo exame, dos que não o apresentavam, sendo os grupos divididos ainda entre bolsas de 3 a 5mm e bolsas de 6 a 10mm.
B.1 – Exame clínico
Os parâmetros clínicos avaliados (índice de placa, índice gengival, profundidade de sondagem e sangramento à sondagem) apresentaram diferença estatisticamente significante, entre os exames inicial e final, nos sítios que não apresentaram sangramento no final do período experimental, como demonstra a tabela 1.
Tabela 1: Médias iniciais e finais de bolsas rasas e profundas, do índice de placa, índice gengival, profundidade de sondagem e nível de inserção clínica das amostras que não apresentaram sangramento no segundo exame.
Inicial Final
Parâmetros clínicos Bolsas N Média N Média P 3-5mm 120 2,06 60 1,60 <0,0001* Índice de placa 6-10mm 120 1,97 34 1,46 <0,0001* 3-5mm 120 2,18 60 1,28 <0,0001* Índice gengival 6-10mm 120 2,11 34 1,17 <0,0001* 3-5mm 120 5,55 60 4,85 Profundidade de sondagem 6-10mm 120 8,08 34 6,46 <0,0001* 3-5mm 120 -0,5 11 -1,08 0,1319 Nível de inserção clínica 6-10mm 120 -1,28 6 -1,57 0,5761 * p< 0,05, valor estatisticamente significante
Para melhor observação das alterações decorrentes do tratamento, os resultados expostos na tabela 1 estão representados em gráfico (Figura 1).
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Médias 3-5mm 6- 10mm 3-5mm 6- 10mm 3-5mm 6- 10mm 3-5mm 6- 10mm índice de placa índice gengival sondagem n. inserção Parâmetros clínicos inicial final
Figura 1 – Médias iniciais e finais dos parâmetros clínicos analisados dos 94 sítios que não apresentaram sangramento no segundo exame, de acordo com a profundidade de sondagem.
Nos 94 sítios que não apresentaram sangramento após a realização do controle de placa supragengival, 34 eram correspondentes a bolsas com profundidade de sondagem inicial entre 6 e 10mm. Ao final do tratamento, 16 dessas 34 bolsas apresentavam profundidade entre 3 e 5mm (Anexo 4-c), indicando uma redução na porcentagem de bolsas profundas de 47,0%.
demonstraram diferença estatisticamente significante, quando somente os sítios que apresentavam sangramento após o período de 30 dias foram avaliados. As medidas da profundidade de sondagem e do nível de inserção clínica apresentaram diferença significativa somente nos sítios entre 6 e 10mm. Os dados obtidos estão apresentados na tabela 2 e figura 2.
Tabela 2 – Médias dos valores inicias e finais do índice de placa, índice gengival, profundidade de sondagem e nível de inserção clínica dos 146 sítios que permaneceram com sangramento no final do experimento (de acordo com a profundidade de sondagem).
Inicial Final
Parâmetros clínicos Bolsas N Média N Média P 3-5mm 120 2,16 60 1,80 0,0017* Índice de placa 6-10mm 120 2,16 86 1,75 <0,0001* 3-5mm 120 2,22 60 1,36 <0,0001* Índice gengival 6-10mm 120 2,16 86 1,43 <0,0001* 3-5mm 120 5,82 60 5,70 0,4171 Profundidade de sondagem 6-10mm 120 7,98 86 7,21 <0,0001* 3-5mm 120 -1,06 16 -1,35 0,2064 Nível de inserção clínica 6-10mm 120 -1,04 21 -1,41 0,0423* * p< 0,05, valor estatisticamente significante
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Média
3-5mm
6-
10mm
3-5mm
6-
10mm
3-5mm
6-
10mm
3-5mm
6-
10mm
índice de
placa
índice
gengival
sondagem
n.
inserção
Parâmetros clínicos
inicial
final
Figura 2 – Médias dos valores iniciais e finais dos índices clínicos avaliados nos 146 sítios que continuaram sangrando após o tratamento, divididos de acordo com a profundidade de sondagem inicial.
B.2 – Exame microbiológico
A distribuição e a porcentagem dos cinco microrganismos analisados pelo exame de PCR, e encontrados nos 94 sítios que não apresentaram sangramento na avaliação final encontra-se representada na tabela 3.
teste de PCR, nos sítios que apresentaram sangramento ao final do tratamento, em 60 sítios com profundidade de sondagem entre 3 e 5mm e em 86 sítios com profundidade entre 6 e 10mm. Inicial Final Microrganismo Bolsas N % N % p 3-5mm 27 45,0 13 21,6 0,0022* B. forsythus 6-10mm 33 38,3 26 30,2 0,2251 3-5mm 18 30,0 11 18,3 0,1089 P. gingivalis 6-10mm 25 29,0 12 13,9 0,0115* 3-5mm 8 13,3 1 1,6 0,0183* P. nigrescens 6-10mm 11 12,8 4 4,6 0,0187* 3-5mm 6 10,0 2 3,3 0,1590 P. intermedia 6-10mm 8 9,3 3 3,5 0,0583 3-5mm 2 3,3 3 5,0 0,2592 A. actinomycetemcomitans 6-10mm 2 2,3 5 5,8 0,5682
* p< 0,05, valor estatisticamente significante
O número, e a porcentagem dos microrganismos encontrado nos 94 sítios que não apresentaram sangramento no final do tratamento encontra-se na tabela 4.
de sondagem entre 3 e 5mm e nos 34 sítios com profundidade entre 6 e 10mm. Inicial Final Microrganismo Bolsas N % N % p 3-5mm 15 25,0 9 15,0 0,1348 B. forsythus 6-10mm 13 38,2 5 14,7 0,0185* 3-5mm 15 25,0 4 6,6 0,0037* P. gingivalis 6-10mm 10 29,4 7 20,6 0,3246 3-5mm 9 15,0 3 5,0 0,0130* P. nigrescens 6-10mm 6 17,6 2 5,9 0,0575 3-5mm 4 6,6 5 8,3 0,7088 P. intermedia 6-10mm 5 14,7 3 8,8 0,4877 3-5mm 1 1,6 4 6,6 0,1819 A. actinomycetemcomitans 6-10mm 2 5,9 2 5,9 1,0000
* p< 0,05, valor estatisticamente significante
As figuras 3 e 4 apresentam, respectivamente, a distribuição inicial e final dos microrganismos, dos sítios que ainda apresentaram sangramento à sondagem durante o segundo exame e dos que não apresentavam sangramento.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Porcentagem 3-5mm 6-10mm 3-5mm 6-10mm 3-5mm 6-10mm 3-5mm 6-10mm 3-5mm 6-10mm Bf Pg Pn Pi A. a Microrganismo Inicial Final
Figura 3 – Distribuição inicial e final dos microrganismos encontrados nos 60 sítios entre 3 e 5mm e nos 86 sítios entre 6 e 10mm que apresentaram sangramento no segundo exame.
0 5 10 15 20 25 30 Porcentagem 3-5mm 6-10mm 3-5mm 6-10mm 3-5mm 6-10mm 3-5mm 6-10mm 3-5mm 6-10mm Bf Pg Pn Pi A. a Microrganismo Inicial Final
Figura 4 – Distribuição dos microrganismos encontrados nos 60 sítios entre 3 e 5mm e nos 34 sítios entre 6 e 10mm que não apresentaram sangramento à sondagem durante o segundo exame, analisados pelo teste de PCR.
B.3 – Exame imunológico
Os valores das citocinas analisadas foram calculados tomando como base uma curva padrão, sendo colocada de um lado as densidades óticas e, do outro, as concentrações das mesmas.
significativa entre os valores iniciais e finais dos sítios com e sem sangramento e das bolsas com profundidades de sondagem entre 3 e 5mm e entre 6 e 10mm, quando a concentração de interleucina-1β foi analisada, como demonstram a tabela e a figura 5.
Tabela 5 – Média dos valores iniciais e finais da interleucina-1β dos sítios entre 3 e 5mm e dos sítios entre 6 e 10mm, que apresentavam ou não sangramento após o tratamento.
Inicial Final
Interleucina 1β Bolsas Média DP Média DP P
3-5mm 56,44 55,11 0,8867 Sítios sangrantes 6-10mm 80,75 83,61 0,7732 3-5mm 62,17 55,96 0,5409 Sítios não sangrantes 6-10mm 72,78 64,43 0,4609 * p< 0,05, valor estatisticamente significante
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90