4.1 Tipos de estudo e amostra
O presente estudo tem desenho epidemiológico observacional do tipo caso-controle. A amostra deste estudo foi composta por mulheres com idade entre 18 a 50 anos atendidas no Instituto Tropical de Medicina Reprodutiva e Menopausa (INTRO), em Cuiabá/MT, Brasil. A coleta ocorreu no período de 29 de novembro de 2010 a 8 de janeiro de 2013.
Alocaram-se como casos, mulheres com diagnóstico laparoscópico e histopatológico positivo para endometriose e, como controles mulheres inférteis ou férteis submetidas à laparoscopia para diagnóstico ou laqueadura tubária com ausência de lesões endometrióticas.
4.2 Critérios de inclusão e exclusão
Os critérios de inclusão foram mulheres com a idade de 18 a 50 anos, com ou sem diagnóstico laparoscópico de endometriose e que concordaram em assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE (Anexo 1).
Os critérios de exclusão foram mulheres fora da faixa etária padronizada por esta pesquisa e as que se recusaram em assinar o TCLE.
4.3 Tamanho da amostra
A amostra foi constituída por 218mulheres, sendo 121 casos e 97 controles. O cálculo do tamanho amostral foi realizado a partir das frequências alélicas dos respectivos polimorfismos estudados, conforme a literatura com frequências em torno de 15-20%, dependendo da etnia estudada (Rebbeck, 1997; Guo, 2005).
O cálculo do tamanho da amostra foi de comparação de dois grupos independentes, com poder do estudo de 80%. Para tanto foi utilizada a seguinte fórmula (Callegari-Jaques, 2007):
Onde:k = 7,8 = (p1 – p2)
4.4 Coletas de dados epidemiológicos e clínicos
Todas as mulheres incluídas no estudo (casos e controles) foram submetidas a uma entrevista padronizada para coleta de variáveis de interesse do estudo: idade, idade na menarca, duração e regularidade do fluxo menstrual, dispareunia, dismenorréia, dor pélvica crônica, infertilidade, vulvodinia, alterações intestinais (diarréia, constipação, aumento do transito intestinal, sangramento retal, puxo e tenesmo), alterações urinárias cíclicas (disúria, polaciúria, hematúria), fibromialgia, síndrome temporomandibular, cefaleia, enxaqueca, idade do diagnóstico da endometriose, idade no primeiro parto, paridade e número de gestações, história familiar da endometriose, tabagismo, alcoolismo, características alimentares e práticas esportivas.
n ≥ k [p1(1 - p1) + p2 (1 - p2)] 2
As pacientes com endometriose tiveram sua doença classificada durante o procedimento cirúrgico pelos critérios da American Society for Reproductive Medicine (ASRM), revisado em 1996, estádios I – IV.
FIGURA 4. Estadiamento da endometriose proposto pela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (1996).
4.5 Coleta de sangue e processamento das amostras
Todas as mulheres foram submetidas à coleta de amostra de sangue periférico (8 mL), com seringa e dispositivo flexível e transferido para tubo contendo EDTA (VACUPLAST®, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) e estocados em freezer -20°C (CONSUL®), até extração de DNA. Todos os experimentos foram executados no Laboratório de Genética da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Mato Grosso.
4.6 Extração de DNA
A extração de DNA foi realizada utilizando o método salting out descrito por Lahiri e Nurnberg (1991), com modificações (Miller et al., 1998). Em todos os experimentos foram utilizadas micropipetas (EPPENDORF®, Hamburg, DE) calibradas. Para tanto, foram utilizados 4,5 mL de sangue periférico total congelado e a esta quantidade foram adicionadas 7 mL de solução de lise I (10mM Tris-HCl; 0,32M Sacarose; 5mM MgCl2; Triton X-100 0,75%) homogeneizadas por 10 minutos e centrifugadas (SIGMA®, St. Louis, US) por 5 minutos a 7.000 rpm. O sobrenadante foi retirado e este processo foi repetido por mais duas vezes com apenas 3 mL da solução de lise I. Quando este procedimento não foi suficiente para o precipitado de células estar isento de hemoglobina, foi realizado mais uma vez. Após a última centrifugação, o sobrenadante foi retirado e o pelete ressuspendido em 1 mL solução de lise II (10mM Tris; 10mM EDTA; 10mM NaCl; 0,5% SDS) que constituiu a segunda etapa de lise. Em seguida, foi agitado no vórtex (FANEM®, São Paulo, BR), homogeneizado e adicionado 333 µL de solução de precipitação de proteínas (6M NaCl). O material foi novamente agitado no vórtex (FANEM®, São Paulo, BR) e até homogeneização e levado para centrifugação (SIGMA®, St. Louis, US) por 5 minutos a 7.000 rpm. E seguida 1220 µL de sobrenadante foram transferidos para dois tubos estéreis, dos quais foram adicionados 660 µL de isopropanol
100%. O material foi homogeneizado manualmente até que o DNA fosse observado e em seguida centrifugado (SIGMA®, St. Louis, US) por 10 minutos a 13.000 rpm. Descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 500 µL de álcool 70%, agitando-se no vórtex (FANEM®, São Paulo, BR) até o desprendimento do pelete. O material foi centrifugado (SIGMA®, St. Louis, US) por 10minutos a 13.000 rpm, sendo esta etapa repetida por mais duas vezes. Após último descarte de sobrenadante, os tubos abertos foram acomodados sobre papel toalha, e assim permaneceram em torno de 3 horas em temperatura ambiente. Para diluição, foram utilizados 200 µL de água ultra-purificada (PURELAB®, Indianapolis, US) sendo a solução homogeneizada com pipeta até apresentar-se gelatinosa e transparente. Caso a homogeneização não fosse alcançada, o material era colocado ao banho maria (FANEM®, São Paulo, BR) por 24h/56ºC. Todas as amostras de DNAs extraídas foram quantificadas no aparelho Nanodrop (MOD2000-UNISCIENCE®, Winnipeg, CA) na unidade de medida ng/µL. Finalmente, as amostras foram congeladas e armazenadas em freezer -20ºC (CONSUL ®, Whirlpool, U.S.).
4.7 Técnica de PCR (Reação em Cadeia de Polimerase)
Para realização de PCR, previamente foram selecionados os oligonucleotídeos utilizados para cada gene investigado, além dos volumes e concentrações utilizados dos reagentes. Para a PCR, utilizou-se como controle positivo, o gene da β globina (268pb). Também em cada PCR, utilizou-se como controle negativo água ultra-purificada (PURELAB®, Indianapolis, US). Na mistura da reação recém-preparada, foi adicionado 1µL de DNA correspondente para cada amostra, já devidamente identificados em microtubos apropriados. Para a reação de PCR foram utilizados concentrações de tampão 5 µL de 10x (Tris 100 mM/L, pH 8,3, KCL 500 mM/L, MgCl2 20 mM/L), 0,5 µl MgCl (50mM), 0,2 µl dNTPs (10mM/µL), 1,2 µLGSTM1, 1,2 µL GSTT1 e 1,2 µL β-globina de iniciadores (10mM/µL), 0,5 µl Taq DNA
polimerase (5U/mL) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 µl de amostra de DNA (100ng/µL), completando com água ultra-purificada até completar o volume final de 18µL. Em seguida, os tubos foram levados para o termociclador (AMPLITHERM®,) programando-se um tempo de ciclagem de: desnaturação inicial: 95ºC por 3 minutos; 35 ciclos de desnaturação (94ºC – 1 minuto); anelamento (60ºC – 1 minuto); extensão (72ºC – 1 minuto); 1 ciclo de extensão final (72ºC – 10 minutos). Para o preparo do gel de agarose 1,5%, foram utilizados 100mL de TBE 1x, 1,5g de agarose e 4µL de brometo de etídio. Em seguida, o material foi levado ao forno microondas (BRASTEMP®) por 90 segundos, despejado na cuba de eletroforese aguardando polimerização (ENDURO-LABNET®, Edison, US). Após serem amplificadas, as amostras foram aplicadas em gel de agarose 1,5% para a corrida de eletroforese de 90 v, 81 AM e 7 w, utilizando fonte de energia específica (ENDURO-LABNET®, Edison, US).
Tabela 1: Sequência de iniciadores utilizados para análise de PCR e os tamanhos dos fragmentos amplificados.
Gene Sequência (5’ 3’) Tamanho do
fragmento GSTT1 5'- GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3' 5'-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3' 480pb a GSTM1 5'-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3' 5'-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3' 215pb a
β Globina 5´ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3´
5´GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3´
268pba a Ichioka et al., 2009.
4.8 Determinação dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1
Para a genotipagem de GSTM1 e GSTT1, previamente amplificadas através de PCR Multiplex, utilizaram-se os tamanhos das bandas referentes aos fragmentos polimórficos,
480 pb para o genótipo GSTT1 positivo e de 215 pb para GSTM1 positivo. Como controle interno positivo foi utilizado β-Globina com fragmento de 268 pb. Para controle negativo para DNA foi utilizado água ultra-purificada (PURELAB®, Indianapolis, US). O marcador do peso molecular de DNA foi de 100 pb.
FIGURA 5. Eletroforese em gel agarose 1,5%: 1º – Marcador de peso molecular; 2º - Controle negativo para DNA; 3º, 4º, 6º, 9º - Positivo para GSTM1 e GSTT1; 5º, 8º, 10º, 11º, 13º, 15º e 16º - Positivos para GSTT1 e negativos para GSTM1; 7º e 12º Negativos para GSTT1 e positivos para GSTM1; 14º - Negativos para GSTM1 e GSTT1.
4.9 Análises estatísticas
Para as variáveis continuas foram calculado a media e o desvio padrão. Para a associação entre os polimorfismos GSTM1 e GSTT1 e a endometriose foram utilizados teste de proporção qui-quadradro (χ2) de Pearson, teste Z e teste Welsh. A comparação dos genes polimórficos GSTM1 e GSTT1 entre os grupos estudados foi utilizada razão de chance (OR), com intervalo de confiança de 95%. O valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significante. Os dados foram armazenados e analisados com auxílio do programa EpiData Software, version 2.2.2 build 177, Dinamarca.
GSTT1(480pb) β-Globina(267pb) GSTM1(215pb)
4.10 Considerações éticas
O protocolo da pesquisa foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Júlio Müller (n°954/CEP-HUJM/2010). Todas as participantes foram esclarecidas sobre os objetivos e procedimentos (punção venosa, entrevista e revisão de prontuários médicos) do presente estudo e sobre sua total liberdade para participar ou não. As participantes que concordaram em fazer parte do estudo assinaram inicialmente o TCLE. A pesquisa não conferiu nenhum risco, exceto aqueles inerentes a simples punção venosa.
Todas as pacientes receberam os resultados dos exames e da pesquisa, sendo que as mesmas são acompanhadas periodicamente no serviço de referência. Todas as pacientes são acompanhadas pela equipe do projeto e aquelas que apresentarem os polimorfismos genéticos que poderão ser considerados fatores de risco, receberão aconselhamento genético.