UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE MEDICINA
COORDENAÇÃO DE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES GSTM1 E GSTT1 E A ASSOCIAÇÃO COM ENDOMETRIOSE EM MULHERES DE MATO GROSSO –
BRASIL
ELOÍSA HELENA KUBISZESKI
CUIABÁ, MT 2013
AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES GSTM1 E GSTT1 E A ASSOCIAÇÃO COM ENDOMETRIOSE EM MULHERES DE MATO GROSSO –
BRASIL
ELOÍSA HELENA KUBISZESKI
Orientadora: Profa. Dra. Bianca Borsatto Galera Co-orientador: Prof. Dr. Sebastião Freitas de Medeiros
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde, Área de Concentração Reprodução Humana e
Climatério.
CUIABÁ, MT 2013
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.
K95a Kubiszeski, Eloísa Helena
Avaliação de polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 e a associação com endometriose em mulheres de Mato Grosso - Brasil / Eloísa Helena Kubiszeski. -- 2013
75 f. : il. color. ; 30 cm.
Orientadora: Bianca Borsatto Galera.
Co-orientador: Sebastião Freitas de Medeiros.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Mato Grosso,
Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Cuiabá, 2013.
Inclui bibliografia.
Santo anjo do Senhor, meu zeloso e guardador, se a ti me confiou, a piedade, divina, sempre me rege, me guarde, me
governe, me ilumine, amém!
DEDICATÓRIA
A DEUS, fonte inesgotável de paciência, sabedoria e perseverança!
Ao UNIVERSO que conspirou para que eu conseguisse chegar até aqui! Aos MEUS PAIS, pelos ensinamentos que não encontramos em livros!
YUSKI e JULIA...filhos queridos, coragem, motivação, amor incondicional! Aos queridos AMIGOS que estão presentes em todos os momentos, tristes e alegres, pois a
AGRADECIMENTOS
À minha querida orientadora Profa. Dra. BIANCA BORSATTO GALERA, pelos ensinamentos, pela amizade e confiança, tem minha eterna admiração e carinho.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. SEBASTIAO FREITAS DE MEDEIROS, que fez com que eu percebesse que para ser mestre é preciso dedicação, espero supreendê-lo positivamente.
À minha querida amiga e mestranda JOZIANE AGNÓRIA DA SILVA SEIDEL, que de repente apareceu em minha vida, e agora faz parte dela, obrigada pela amizade e companheirismo.
À Dra. MARCIA MARLY WINCK YAMAMOTO DE MEDEIROS que me recebeu com carinho e respeito, grata pelo aprendizado e admiração pelo trabalho realizado com competência e dedicação.
À Profa. CARMEM LUCIA BASSI BRANCO, que me socorreu intelectualmente e pelos empréstimos de algumas xícaras de açúcar...devagar eu devolvo.
Ao Prof. Dr. MARCIAL FRANCIS GALERA que participou da banca de qualificação e contribui com sugestões importantes para a conclusão desta dissertação.
A toda equipe do Instituto Tropical de Medicina Reprodutiva e Menopausa - INTRO, especialmente a querida ARLENE, sempre muito prestativa, e FRANCISCA pelos cafezinhos quentinhos.
Aos doutores DALTON FERREIRA e OACIR MONTEIRO DA SILVA JUNIOR, que colaboraram imensamente neste estudo, oportunizando coletas de dados de suas pacientes. Ao Dr. ACIR ANDRE NOVACZYK pela colaboração, juntamente com a dos médicos que o auxiliam nas laparoscopias garantiram a qualidade dos dados coletados. Muito obrigada!
Ao Prof. Dr. COR JÉSUS FERNANDES FONTES, pela ampliação dos horizontes epidemiológicos, e pelo auxílio durante as análises estatísticas.
Às minhas colegas do grupo de pesquisa da Genética, NAYANA LEOTTI, REGIANE FESTI, ARIANNE MONTEIRO, JOZIANE A.S.SEIDEL, JACQUELYNE CONCEIÇÃO LIMA e LUIZA LIMA RIBEIRO DE ALMEIDA...minha ansiedade me descompensa, mas reconheço a importância de cada uma para a conclusão desta dissertação. Obrigada meninas!
Às pacientes por aceitarem participar do estudo, tornando um sonho possível e assim a ciência evolui...em nome da ciência!!!
SUMÁRIO Lista de Abreviaturas Lista de Tabelas Lista de Figuras Resumo Abstract 1. INTRODUÇÃO ... 13 2. OBJETIVOS ... 15 2.1 Objetivo Geral... 15 2.2 Objetivos Específicos... 15 3. REVISÃO DE LITERATURA... 16
3.1 Endometriose: Considerações Gerais ... 16
3.2 O Sistema Glutationa S Transferase ... 22
3.3 Polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 e endometriose ... 26
4. MATERIAL E MÉTODO... 29
4.1 Tipo de estudo e amostra ... 29
4.2 Critérios de inclusão e de exclusão ... 29
4.3 Tamanho da amostra... 30
4.4 Coleta de dados epidemiológicos e clínicos... 30
4.5 Coleta de sangue e processamento das amostras... 32
4.6 Extração de DNA ... 32
4.7 Técnica de PCR (Reação em Cadeia de Polimerase)... 33
4.8 Determinação dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1... 34
4.9 Análises Estatísticas ... 35 . 4.10 Considerações Éticas ... 36 5. RESULTADOS ... 37 6. DISCUSSÃO ... 43 7. CONCLUSÕES... 48 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 49 ANEXOS ... 54
LISTA DE ABREVIATURAS
DNA: ácido desoxirribonucleico
dNTPs: desoxinucleotídeo trifosfato EDTA: ácido etilenodiamintotetracético
GSH: Glutationa
GSTM1: gene mu (µ) 1 do sistema da glutationa S-transferase GSTT1: gene theta (Ɵ) 1 do sistema da glutationa S-transferase
IMC: índice de massa corpórea KCl: cloreto de potássio
MgCl2: cloreto de magnésio NaCl: cloreto de sódio pb: pares de bases
PCR: Reação de Cadeia em Polimerase SDS: Dodecilsulfato de sódio
TCLE: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TBE: tris-borato- ácido etilenodiamintotetracético TRIS: hidroximetil aminometano
TRIS HCl: tris hidrocloreto
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Sequência de iniciadores utilizados para análise de PCR e os tamanhos dos fragmentos amplificados...36
Tabela 2: Perfil demográfico de mulheres com endometriose e controles...39
Tabela 3: Frequências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 em casos e controles...40
Tabela 4: Associação entre os intervalos dos ciclos menstruais e a frequência do polimorfismo no gene GSTM1...41
Tabela 5. Associação entre os intervalos dos ciclos menstruais e a frequência do polimorfismo no gene GSTM1 entre casos e controles...42
Tabela 6. Associação do volume do sangramento menstrual e a frequência do gene GSTM1 entre casos e controles...43
Tabela 7. Associação do volume do sangramento menstrual e a frequência do gene GSTT1 entre casos e controles...43
Tabela 8. Combinação entre os polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 encontrados e estadiamento da endometriose...44
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Etapas da biossíntese da testosterona [26] e da progesterona [28]...27
FIGURA 2. Localização de genes da família GST classe mu...29
FIGURA 3. Localização de genes da família GST classe theta...30
FIGURA 4: Estadiamento da endometriose proposto pela American Society for Reproductive Medicine (1996)...33
RESUMO
Introdução: A endometriose é uma doença ginecológica comum, sendo caracterizada por implante e crescimento de tecido endometrial fora da cavidade uterina. Sua etiologia é complexa e fatores imunológicos, hormonais e genéticos são propostos para explicar à susceptibilidade a doença. Polimorfismos em genes envolvidos com a detoxicacão de xenobióticos e metabolismo de esteróides sexuais têm sido descritos, dentre eles os genes da classe Mu do sistema glutationa transferase (GSTM1) e o gene theta do sistema glutationa S-transferase (GSTT1). A presença destes polimorfismos resulta na ausência de atividades destas enzimas e maior risco de desenvolvimento de endometriose em mulheres. Objetivo: O presente trabalho teve como objetivos: estimar as freqüências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 em mulheres com e sem endometriose e verificar possível associação com estes polimorfismos. Material e Método: Foi realizado um estudo epidemiológico observacional do tipo caso-controle, sendo a amostra composta por 218 mulheres (121 casos/97 controles). A presença ou ausência de endometriose foi confirmada pela visualização das lesões por videolaparoscopia e exame histopatológico. A extração de DNA de amostra de sangue periférico foi realizada usando a técnica de salting out e PCR multiplex para identificação dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1. Resultados: Foi observada a frequência do polimorfismo no gene GSTM1 identificadas nas mulheres com e sem endometriose foram 54,50 e 51,50%, respectivamente. Para GSTT1, as frequências corresponderam a 20,70% nos casos e 33% nos controles (p=0,0395). Não foram observadas diferenças nas freqüências dos polimorfismos no gene GSTM1, entre casos e controles (p=0,659). Assim, polimorfismo em GSTM1 não conferiu suscetibilidade à endometriose. No entanto, o polimorfismo no gene GSTT1 mostrou associação conferindo proteção às mulheres portadoras. Quando comparados o intervalo do ciclo menstrual e polimorfismo no gene GSTM1 não mostrou associação, no entanto, quando comparados com o GSTT1 este conferiu fator de proteção. Sugerimos que presença do polimorfismo em GSTT1, ou seja, a ausência na atividade deste gene possa contribuir para o aumento na produção de espécies reativas de oxigênio que por sua vez poderão favorecer danos no DNA e consequentemente apoptose. Assim, em mulheres saudáveis tais efeitos contribuem para a não implantação de tecido endometrial ectópico. Além desta suposição, a contribuição dos produtos de outros polimorfismos em genes envolvidos com a síntese e metabolização de esteróides, somados a outros ainda não conhecidos, devem ser consideradas e investigadas em pesquisas futuras.
ABSTRACT
Endometriosis is a common gynecological disease, characterized by growth and implantation of endometrial tissue outside the uterine cavity. Its etiology is complex and immune factors, hormonal and genetic factors have been proposed to explain the susceptibility to disease. Polymorphisms in genes involved in detoxification of xenobiotics and metabolism of sex steroids have been described, among them the genes of the Mu class of the glutathione S-transferase (GSTM1) and theta gene system glutathione S-transferase (GSTT1). The presence of these polymorphisms results in the lack of activity of these enzymes and a greater risk of developing endometriosis in women. Objective: This study tevecomo objectives: to estimate the frequencies of polymorphisms in GSTM1 and GSTT1 genes in women with and without endometriosis and verify possible association with these polymorphisms. Material and Methods: We conducted an observational epidemiological case-control, and the sample was composed of 218 women (121 casos/97 controls). The presence or absence of endometriosis was confirmed by the visualization of lesions by laparoscopy and histopathology. The extraction of DNA from peripheral blood sample was performed using the technique of salting out and multiplex PCR for identification of polymorphisms in GSTM1 and GSTT1. Results: It was observed frequency of GSTM1 polymorphism in the gene identified in women with and without endometriosis were 54.50 and 51.50% respectively. For GSTT1, the frequencies corresponded to 20.70% in cases and 33% in controls (p = 0.0395). There were no differences in the frequencies of GSTM1 gene polymorphisms in cases and controls (p = 0.659). Thus, GSTM1 polymorphism did not confer susceptibility to endometriosis. However, the GSTT1 gene polymorphism was associated women with conferring protection. We supposed that the presence of the polymorphism in GSTT1, the absence of this gene activity may contribute to the increased production of reactive oxygen species, which in turn may promote DNA damage and consequently apoptosis. Thus, such effects in healthy women not contribute to the implantation of endometrial tissue. In addition to this assumption, the contribution of the products of other polymorphisms in genes involved in the synthesis and metabolism of steroids, plus others not yet known, should be considered and investigated in future researches.
1. INTRODUÇÃO
A endometriose é uma doença ginecológica de controversa instalação, evolução e repetidos fracassos no tratamento clínico e cirúrgico. Acomete aproximadamente 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva, sendo caracterizada por implante e crescimento de tecido endometrial (glândulas e/ou estroma) fora da cavidade uterina. Os principais sinais e sintomas incluem dor pélvica crônica, infertilidade, dismenorreia, alterações intestinais e urinárias cíclicas (Olive e Schwartz, 1993; Skenazi et al., 1997; Kennedy et al., 2005)
A etiologia da endometriose é complexa, sendo que algumas teorias foram propostas para explicar o desenvolvimento da doença. As duas correntes principais sobre sua etiopatogenia são a da metaplasia celômica e a da menstruação retrógrada (Meyer, 1919; Sampson, 1927). Também são postulados fatores imunológicos, hormonais e genéticos para explicar a susceptibilidade aumentada de algumas mulheres à endometriose (Olive & Schwartz, 1993; Braun e Dmowski, 1998; Bischoff e Simpson, 2000; Tempfer et al., 2009).
Vários estudos associando a participação de genes e seus polimorfismos com endometriose têm sido realizados, sendo os resultados encontrados muitas vezes discordantes. Os genes mais frequentemente associados à endometriose são aqueles que codificam citocinas, moléculas de adesão, enzimas da matriz extracelular, proteínas envolvidas em vias de detoxicação, metabolismo de esteróides sexuais ou que regulam o ciclo celular (Huber et al., 2008; Tempfer et al., 2009; Anton et al., 2010; Borguese et al., 2010).
Umas das enzimas mais conhecidas são as da família da glutationa (GSH), que impedem a ação de toxinas endógenas e exógenas sobre as células, evitando assim possíveis danos ao DNA celular. Dentre os genes responsáveis por estas enzimas, estão incluídos os genes GSTM1, (gene mu (μ)1 do sistema da glutationa S-transferase), mapeado em 1p13.3 e o
gene GSTT1 (gene theta (θ)1 do sistema glutationa S-transferase), mapeado em 22q11.2 (Huber et al., 2008; Anton et al., 2010).
O gene GSTM1 é polimórfico na população humana, apresentando dois alelos funcionais ativos, que possuem a mesma eficiência metabólica, e um alelo com atividade nula por deleção em homozigose (Nakata et al., 2004; Huber et al., 2008; Rozati et al., 2009). Assim como o GSTM1, o GSTT1 também é polimórfico na população humana, podendo apresentar seu polimorfismo como fenótipo ausente por deleção. Sendo assim quando estes genes são polimórficos, os mesmos não sintetizam seu produto protéico devido à grande deleção dos genes. Homozigotos para o alelo GSTM1 ausente são considerados grupos de risco por permitirem implantação ectópica de tecido endometrial, devido ao defeito enzimático em seu sistema de detoxificação (Nakata et al., 2004; Huber et al., 2008; Rozati et al., 2009).
No estado de Mato Grosso, estudos como este, em mulheres com e sem endometriose são inexistentes. As frequências de tais polimorfismos nesta população são desconhecidas, também não se sabe se estão associados com endometriose.
Assim, o presente estudo tem como objetivo estimar as frequências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 e verificar se estão associadas com ocorrência de endometriose.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Estimar as frequências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 e verificar suas associações com a ocorrência de endometriose em mulheres de Mato Grosso.
2.2 Objetivos específicos
1. Determinar as freqüências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 em mulheres com e sem diagnóstico de endometriose;
2. Examinar possível associação entre as presenças dos polimorfismos GSTM1 e GSTT1 e a ocorrência de endometriose nas mulheres estudadas;
3. Identificar possíveis associações existentes entre freqüências das presenças dos polimorfismos GSTM1 e GSTT1 e as características clínicas das mulheres com endometriose.
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Endometriose: considerações gerais
A endometriose é uma afecção ginecológica caracterizada pelo implante e crescimento de tecido endometrial fora da cavidade uterina. Acomete cerca de 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva, sendo uma das principais causas de infertilidade para este gênero (Olive e Schwartz, 1993; Skenazi e Warner, 1997; Kennedy et al., 2005). Afeta ainda 40 a 60 % das mulheres que apresentam dismenorréia, 40% dos casos de dor pélvica crônica e 20 a 70% dos casos de infertilidade (Olive e Schwartz, 1993; Kennedy et al., 2005; Medeiros et al., 2012). A lesão endometrial é uma condição esteróide-dependente, caracterizada pela instalação de tecido endometrial fora da cavidade uterina (Olive e Schwartz, 1993; Meyer, 1919; Sampson, 1927; Borguese et al., 2010).
Esta condição foi descrita em 1893 pelo médico alemão von Recklinghausen, ao observar achados de tecidos endometrióticos fora da cavidade uterina, em biópsia uterina. A etiopatogenia ainda não esta bem esclarecida, porém, as evidências indicam que combinações de fatores genéticos, hormonais e imunológicos possam contribuir para a formação e o desenvolvimento dos focos ectópicos da endometriose (Rozati et al., 2009; Borguese et al., 2010; Nácul e Sprintzer, 2010).
O tecido endometrial ectópico é histologicamente similar ao endométrio, apresentando características benignas, com glândulas e estroma, implantando-se em tecidos e órgãos, como as trompas, ovários, ligamentos útero-sacros, fundo de saco de Douglas, peritônio, cólon, região retrovaginal e bexiga (Ulrich et al., 2006; Berbel et al., 2008; Kondo et al., 2011).
Ainda do ponto de vista histológico, a lesão de endometriose não é formada somente por tecido endometrial, mas por um tecido de cicatrização decorrente de processo inflamatório infiltrativo, que muitas vezes acomete o tecido muscular, diferenças estas que afetam a eficácia do tratamento (Meyer, 1919; Kennedy et al., 2005; Borguese et al., 2010).
A endometriose pode ser dividida em dois tipos, dependendo da localização. Quando acomete os ovários, trompas e peritônio pélvico, as lesões são superficiais e quadro clínico mais ameno, é denominada endometriose propriamente dita e a de comprometimento central na região retro-uterina, uterina ou recesso vesical-vagina é denominada de adenomiose (Kumar et al., 2005; Rozati et al., 2009). Nessa divisão, a classificação não é feita pela profundidade da doença, mas sim pela expressão da atividade do endométrio ectópico, se ocorre sangramento dependente de hormônios sexuais esteróides ou metaplasia de músculo liso (Kumar et al., 2005; Bischoff e Simpson, 2000; Rozati et al., 2009).
Na adenomiose ocorre à diferenciação de tecido conjuntivo e muscular liso e acredita-se que deva existir uma resposta fraca à progesterona. Assim como a camada basal do endométrio no útero, responde aos hormônios esteróides. Já na endometriose propriamente dita, existe sangramento dependente de hormônio esteróide até o momento em que o sítio sofre fibrose. Conclui-se que a endometriose e adenomiose apresentam respostas diferentes a esses hormônios, o que pode vir a ser mais um alvo no tratamento da doença (Kumar et al., 2005; Berbel et al., 2008).
Os focos de endométrio respondem à estimulação hormonal tanto extrínseca cíclica (ovariana) quanto intrínseca por meio de sangramento periódicos. Essa característica dos focos leva ao aparecimento de nódulos com um aspecto que varia de vermelho-azulado a amarelo-acastanhado sobre as superfícies serosas do local acometido ou logo abaixo delas. Quando a doença afeta uma área grande, a organização da hemorragia leva a formação de
aderências fibrosas extensas entre as tubas, os ovários e outras estruturas e também a obliteração do fundo de saco de Douglas. Os ovários podem se tornar muito distorcidos pela presença de grandes massas císticas, endometriomas, repletos de restos de sangue degradado de cor castanha (Kumar et al., 2005; Berbel et al., 2008).
Biologicamente, o processo da gênese do foco de endometriose, semelhante ao do câncer, envolve: adesão, invasão, proliferação celular. No entanto, apesar do seu comportamento ser semelhante às células neoplásicas, é uma neoplasia benigna. A diferença principal entre ambas é que, na endometriose, em determinado momento, a lesão deixa de crescer e diminui sua capacidade de invasão (Borguese et al., 2010). O risco da malignidade em endometriose é atualmente discutido. Apesar das chances apresentarem-se baixas, alguns estudos relataram a coexistência de endometriose e câncer de ovário (Borguese et al., 2010).
Existem várias teorias para explicar a etiopatogenia da endometriose, entre as quais: a teoria da metaplasia celômica e a da menstruação retrógrada (Meyer, 1919; Sampson, 1927). A primeira, descrita em 1919 por Meyer, sugere que o epitélio celômico original sofre metaplasia, formando glândulas endometriais e estroma, a que explicaria a endometriose profunda.
Somente em 1927, Sampson caracterizou a endometriose como é conhecida atualmente, elaborando a hipótese etiológica mais aceita, denominada metastática, sugerindo que por meio da menstruação retrógrada fragmentos endometriais, descamados durante a fase menstrual e contendo células viáveis, são transportados através das tubas uterinas até a cavidade peritoneal onde se implantam, crescem e invadem tecidos de órgãos adjacentes (Sampson, 1927).
Algumas evidências sustentam a hipótese supracitada, como a presença de células endometriais viáveis no efluente menstrual e fluido peritoneal, o fato do endométrio ser
capaz de se implantar e crescer dentro da cavidade peritoneal e cerca de 70 a 90% das mulheres apresentarem menstruação retrógrada (Guo, 2006). Evidencia-se também que a ocorrência deste implante, depende da influência de um ambiente hormonal favorável e de fatores imunológicos que falharam em eliminar tais células deste local impróprio (Ulrich et al., 2006; Rozati et al., 2009; Borguese et al., 2010).
Acredita-se que a endometriose esteja associada com a capacidade das células ectópicas de neutralizar a resposta imune local, devido a defeitos do sistema de vigilância imunológica e supressão de células do sistema imune (Braun e Dmowski, 1998; Tempfer, 2009).
A maioria das mulheres apresenta queixas clinicas em diferentes intensidades, sendo as principais dismenorréia (cólicas menstruais), dispareunia de profundidade (dor durante a relação sexual), dor pélvica crônica, sintomas intestinais cíclicos (dor ao evacuar, constipação, hematoquezia e diarréia), sintomas urinários (disúria, cistite de repetição, polaciúria, urgência urinária e hematúria) e infertilidade (Kennedy et al, 2005; Skaff et al., 2011; Villareal et al., 2011; Medeiros et al., 2012).
Muitas vezes as pacientes apresentam sintomas sugestivos e, no entanto, podem não ter endometriose. O diagnóstico final pode ser dificultado, pois a apresentação é variável e o grau dos sintomas pode não se correlacionar com a extensão da doença (Chapron et al., 2002; Hudelist et al., 2009; Hsu et al., 2010).
Diante desta variabilidade dos sinais e sintomas a endometriose pode ser confundida com outras patologias pélvicas, levando a um diagnóstico geralmente tardio. O Real Colégio de Obstetras e Ginecologistas de Londres sugere que exista uma demora de até 12 anos de início dos sintomas até o diagnóstico definitivo (Giudice e Kao, 2004; Mackintosh et al., 2011).
Em vários casos o exame ginecológico pode ser normal, mas a presença de dor à mobilização uterina, retroversão uterina ou aumento do volume ovariano é sugestiva de endometriose, embora não seja específica. Os sinais sugestivos de endometriose profunda infiltrativa são nodulações palpáveis no fórnice vaginal posterior ou septo retovaginal, espessamento dos ligamentos uterossacros ou lesões violáceas na vagina (Bischboff e Simpson, 2000; Nácul e Sprintzer, 2010; Hsu et al., 2010)
Apesar dos exames de imagens disponíveis apresentarem boa acurácia no diagnóstico da endometriose, a videolaparoscopia com biópsia das lesões para análise anatomopatológica ainda é o ―padrão ouro‖ no diagnóstico desta afecção. No entanto, alguns estudos sugerem que este método apresente eficácia limitada. Assim, propõe-se que a videolaparoscopia deve ser combinada com o exame histopatológico, a fim de melhorar a eficácia da confirmação do diagnóstico da doença (Chapron et al., 2002; Nácul e Sprintzer, 2010; Hsu et al., 2010)
Após a realização da videolaparoscopia, a endometriose pode ser classificada de acordo com o tipo histológico dos implantes, com a localização anatômica da doença – peritônio, ovário ou septo retovaginal – ou pela extensão da doença sobre os órgãos pélvicos. A classificação mais utilizada atualmente é a da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva – revisada em 1996. Essa classificação gradua e endometriose em mínima (I), leve (II), moderada (III) e grave (IV), pela extensão da doença no peritônio e ovários, bem como pele presença de aderências tubo-ovarianas e obliteração do fundo de saco de Douglas (ASRM, 2008).
A endometriose é uma patologia de difícil tratamento, caracterizada como condição crônica e, que muitas vezes, pode reicidivar apesar dos procedimentos de retirada dos tecidos ectópicos. O tratamento deve ser individualizado, avaliando a sintomatologia mais relevante de cada paciente. Pode ser utilizado tratamento farmacológico, cirúrgico ou a
combinação das duas abordagens (Giudice e Kao, 2004; Kennedy et al., 2005; Arya e Shaw, 2005; Díaz-Yamal e Sanabria- Gaitán, 2008).
A terapia medicamentosa para endometriose é baseada no fato de que esta responde a hormônios. Duas condições fisiológicas, gravidez e menopausa, estão frequentemente associadas à resolução da dor provocada pela endometriose. Os análogos farmacológicos levam às condições hormonais semelhantes à vista durante a gravidez e/ou promovem supressão do estrogênio endógeno (Navarro et al., 2006).
As terapias farmacológicas atualmente disponíveis têm o intuito de controlar a dismenorréia, dispareunia, a dor pélvica e a infertilidade. São utilizados, preferencialmente, analgésicos e anti-inflamatórios não-esteroidais; contraceptivos estroprogestogênicos, progestogênicos isolados e análogos do hormônio liberador de gonadrotofina (GnRH) (Mounsey et al., 2006; Díaz-Yamal e Sanabria- Gaitán, 2008; Nácul e Sprintzer, 2010).
O tratamento cirúrgico da endometriose compreende procedimentos de baixa complexidade, como a cauterização de focos superficiais e a liberação de aderências velamentosas, até intervenções complexas nos ovários, fundo de saco de Douglas, intestino, bexiga, ureteres, exigindo em alguns casos uma equipe multidisciplinar (Ulrich et al., 2006; Nácul e Sprintzer, 2010).
Os mecanismos envolvidos na gênese da infertilidade em pacientes com endometriose incluem anormalidades anatômicas causadas pelas aderências relacionadas à endometriose (fator mecânico), alterações imunológicas no ambiente peritoneal, alterações dos mecanismos de implantação ou mesmo alterações genéticas. A abordagem laparoscópica pode solucionar as alterações anatômicas, mas mecanismos imunológicos possivelmente não são corrigidos com a abordagem cirúrgica (Kumar et al., 2005; Ulrich et al., 2006; Bereck e Novak, 2008).
3.2 O Sistema Glutationa S Transferase
Vários estudos têm demonstrado correlação entre fatores genéticos e endometriose. Por tratar-se de uma doença multifatorial, observa-se aumento do risco para parentes de primeiro grau, assim como nos casos de gemelaridade monozigótica (Treolar et al., 2002; Zondervan, 2009).
Recentemente, várias linhas de pesquisa buscam identificar genes relacionados com a susceptibilidade à endometriose, como aqueles envolvidos com síntese de hormônios esteroidais e processos de detoxificação do organismo, os genes do sistema GST (Montogomery et al., 2008; Tempfer et al., 2009).
A GST é uma família de enzimas intracelulares que catalisam o ataque nucleofílico da forma reduzida da glutationa (GSH) a compostos que apresentam um carbono, um hidrogênio ou um átomo de enxofre eletrofílico (Huber et al., 2008).
Como estão envolvidas no metabolismo de muitos carcinógenos, poluentes ambientais e drogas anticancerígenas supõem-se que a falta de isoenzimas específicas tenha um efeito significante na tolerância de um organismo a carcinogênios (Morais et al., 2008).
As GSTs são classificadas de acordo com a seqüência de aminoácidos e/ou nucleotídeos, propriedades imunológicas, parâmetros de cinética enzimática e/ou estrutura terciária e quaternária. Cinco classes de genes da GST foram identificadas em humanos: Alpha (A1, A2, A3 e A4), PI (P1), Mu (M1, M2, M3, M4 e M5), Theta (T1, T2) e Zeta (Huber et al., 2008; Anton et al., 2010).
A GST possui o principal componente sulfidril não-proteico em células de mamíferos, atuando na neutralização de peróxidos e na proteção celular contra o estresse oxidativo. A GSH é um tripeptídio presente tanto no estágio reduzido quanto no oxidado, cujos
níveis são mantidos por síntese de novo catalisada por duas enzimas, uma das quais é inibida por compostos produzidos em resposta ao estresse oxidativo (Agarwal et al., 2005; Nwose etg al., 2008; Andrade et al., 2010).
Esse antioxidante está presente no oócito e no fluido tubário, participando dos processos de maturação oocitária, descondensação espermática, ativação oocitária, além de desempenhar importante função permissiva para o desenvolvimento embrionário pré-implantação. Uma das atividades antioxidantes da glutationa consiste em eliminar, indiretamente, o tocoferol oxidado, importante para a reciclagem e manutenção de níveis fisiológicos de vitamina E, essenciais para o combate ao estresse oxidativo (Pemble, et al., 1994; Steinhoff et al., 2000; Agarwal et al., 2005; Nwose etg al., 2008; Andrade et al., 2010).
Além da remoção de espécies reativas de oxigênio, enzimas da família da GST realizam catálise de conjugações com substâncias endógenas, catálise de reações em vias metabólicas não associadas com desintoxicação. Têm também sido associadas a fenômenos que envolvem agentes de resistência a quimioterápicos, antibióticos, inseticidas e herbicidas (Stenhoff et al., 2000; Sheehan et al., 2001; Vichi et al., 2012). Espécies reativas de oxigênio, dentre elas, o ânion superóxido (O2), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (HO), produtos da respiração aeróbica, podem causar danos ao DNA, lipídios da membrana, proteínas, carboidratos e outros (Pemble et al., 1994; Steinhoff et al., 2000; Huber et al., 2008; Augoulea et al., 2012).
As enzimas da família GST também são responsáveis pela detoxificação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, os quais são ubíquos e possivelmente o contaminante ambiental mais nocivo (Stenhoff et al, 2000; Guo 2005).
A biossíntese da GSH ocorre no meio intracelular (exceto em células epiteliais) pela ação consecutiva de duas enzimas. Na primeira reação, é formada uma ligação peptídica
entre os aminoácidos: ácido glutâmico e cisteína, catalisada pela enzima γ-glutamilcisteína sintetase, levando à γ-L-glutamil-L-cisteína. Este dipeptídeo é então ligado à glicina pela ação da glutationa sintetase. Estas etapas requerem ATP e Mg+2. A γ-glutamilcisteína sintetase sofre regulação pela GSH através de um feedback negativo, o que previne a produção excessiva desta ou o acúmulo do intermediário γ-glutamilcisteína (Vasconcelos et al., 2007; Huber et sl, 2008).
As GSTs também desempenham função no metabolismo de esteróides sexuais. Através de várias etapas, entre elas, reações de oxidação e isomerização, o colesterol é convertido em hormônios esteroidais, como testosterona e progesterona (Johansson e Mannervik, 2001; Huber et al., 2008; Speroff e Fritz, 2005).
A biossíntese destes hormônios (Figura 1) envolve a formação de um intermediário-chave comum, o 3-β-hidróxipregnenona. A clivagem da cadeia lateral de 23, seguida da oxidação da hidroxila 3β, fornece a Δ5-androstendiona, que, sob a ação da glutationa transferase citossólica A3-3 (GST A3-3), é convertida ao seu regioisômero Δ4-androsteniona, A testosterona [26] é então obtida a partir de 25, após redução seletiva da carbonilacetônica presente no anel D. Alternativamente, o intermediário 23 é oxidado à Δ5-pregnendiona, e a isomerização da ligação dupla pela ação da GST A3-3, resultando na produção de progesterona [28] (Speroff e Fritz, 2005).
FIGURA 1. Etapas da biossíntese da testosterona [26] e da progesterona [28] (Speroff e Fritz, 2005).
3.3 Polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 e endometriose
Os genes GSTM1 e GSTT1 são polimórficos em humanos e as variantes se apresentam como ausência dos genes (deleção em homozigose) em 10-60% dependendo da população étnica (Rebbeck, 1997; Guo, 2005). Como os produtos destes genes catalisam substâncias químicas cancerígenas, a presença dos polimorfismos tem sido associada à maior risco de desenvolver câncer (Anton et al., 2010). Rebbeck (1997) relata que a freqüência do polimorfismo no gene GSTM1 em caucasianos varia de 33 a 67%, em africanos e afro– americanos de 22 a 35%. Em relação ao polimorfismo no gene GSTT1, observa-se, em caucasianos, freqüência 20% maior do que as observadas em populações africanas ou asiáticas (Rebbeck, 1997; Guo, 2005).
Os polimorfismos em genes das GSTs têm sido investigados em diferentes condições nosológicas, dentre elas a endometriose. Embora ainda não seja totalmente elucidada, a literatura sugere correlação entre a endometriose e os polimorfismos em GSTM1 e GSTT1 (Ertunc et al., 2005). Diante das propriedades de detoxificação da família de enzimas GST, supõe-se que as ausências da atividade destas enzimas devido ao polimorfismo de deleção podem predispor as mulheres a risco aumentado para endometriose (Guo, 2005).
Como mencionado, as isoenzimas citosólicas são divididas em pelo menos cinco classes principais (α, μ, π, ɵ, δ), entre os quais polimorfismos foram detectados nos genes que codificam as enzimas GSTM1 e GSTM3 (classe μ,), GSTP1 (classe π), GSTT1 (classe ɵ) e GSTZ1 (classe δ) (Mitrunen e Hirvonen, 2002; Huber et al., 2008).
O gene GSTM1 (Figura 2), mapeado no cromossomo 1p13.3, codifica enzimas da classe GST mu (μ), estando presente em dois alelos ativos: GSTM1 A, GSTM1 B e um alelo nulo (GSTM1 0). Suas combinações correspondem aos genótipos ativos GSTM1A / A ou A / 0; GSTM1B / B ou B / 0 e GSTM1A / B e um genótipo não ativo, GSTM10 / 0, que não é
transcricionalmente ativo devido a uma deleção estendida (10Kb) (Mitrunen e Hirvonen, 2002; Parl, 2005; Costa, 2010; Fedulova et al, 2010).
FIGURA 2. Localização de genes da família GST classe mu (da esquerda para a direita estão representados os genes GSTM4, GSTM2, GSTM1, GSTM5, GSTM3). O alelo selvagem do gene GSMT1 está representado por um retângulo negro; os retângulos cinzas representam regiões flanqueadoras do gene. O alelo polimórfico mostra a deleção no gene GSTM1 (Parl, 2005).
Este polimorfismo (deleção em homozigose) foi observado influenciando a suscetibilidade à endometriose em mulheres francesas, russas, indianas, chinesas, taiwanesas, coreanas, japonesas e australianas (9).
O gene GSTT1(Figura 3) está mapeado no cromossomo 22q11.2. Duas isoenzimas na classe theta foram identificadas, GSTT1-1 e GSTT2-2, sendo as duas compostas por cinco éxons com limites de íntron/exon idênticas. Embora sejam semelhantes, apresentam somente 55% de seqüência de aminoácidos idênticas (Mitrunen e Hirvonen, 2002; Parl, 2005; Fedulova et al., 2010).
Alelo Polimórfico Alelo Selvagem
FIGURA 3. Localização de genes da família GST classe theta (da esquerda para a direita estão representadas regiões flanqueadoras, genes GSTT1, GSTT2). O alelo selvagem do gene GSTT1 está representado por um retângulo negro maior; os retângulos cinzas menores mostram regiões externas ao gene. O alelo polimórfico mostra a deleção no gene GSTT1 (Parl, 2005).
Estudos realizados na Grécia, França, Índia, Reino Unido, Japão e a Coréia não mostraram correlação entre a variante GSTT1 ausente e a susceptibilidade à endometriose, enquanto, Ivashchencko et al. (2003) em um estudo com mulheres russas mostrou tal associação.
Os estudos brasileiros relacionados a possíveis alterações genéticas em mulheres com endometriose são escassos, sendo que alguns demonstram resultados contraditórios (Carvalho et al.,2003). Nesse sentido, o presente trabalho em Mato Grosso pretende preencher esta lacuna.
Alelo Selvagem
Alelo Polimórfico
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Tipos de estudo e amostra
O presente estudo tem desenho epidemiológico observacional do tipo caso-controle. A amostra deste estudo foi composta por mulheres com idade entre 18 a 50 anos atendidas no Instituto Tropical de Medicina Reprodutiva e Menopausa (INTRO), em Cuiabá/MT, Brasil. A coleta ocorreu no período de 29 de novembro de 2010 a 8 de janeiro de 2013.
Alocaram-se como casos, mulheres com diagnóstico laparoscópico e histopatológico positivo para endometriose e, como controles mulheres inférteis ou férteis submetidas à laparoscopia para diagnóstico ou laqueadura tubária com ausência de lesões endometrióticas.
4.2 Critérios de inclusão e exclusão
Os critérios de inclusão foram mulheres com a idade de 18 a 50 anos, com ou sem diagnóstico laparoscópico de endometriose e que concordaram em assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE (Anexo 1).
Os critérios de exclusão foram mulheres fora da faixa etária padronizada por esta pesquisa e as que se recusaram em assinar o TCLE.
4.3 Tamanho da amostra
A amostra foi constituída por 218mulheres, sendo 121 casos e 97 controles. O cálculo do tamanho amostral foi realizado a partir das frequências alélicas dos respectivos polimorfismos estudados, conforme a literatura com frequências em torno de 15-20%, dependendo da etnia estudada (Rebbeck, 1997; Guo, 2005).
O cálculo do tamanho da amostra foi de comparação de dois grupos independentes, com poder do estudo de 80%. Para tanto foi utilizada a seguinte fórmula (Callegari-Jaques, 2007):
Onde:k = 7,8 = (p1 – p2)
4.4 Coletas de dados epidemiológicos e clínicos
Todas as mulheres incluídas no estudo (casos e controles) foram submetidas a uma entrevista padronizada para coleta de variáveis de interesse do estudo: idade, idade na menarca, duração e regularidade do fluxo menstrual, dispareunia, dismenorréia, dor pélvica crônica, infertilidade, vulvodinia, alterações intestinais (diarréia, constipação, aumento do transito intestinal, sangramento retal, puxo e tenesmo), alterações urinárias cíclicas (disúria, polaciúria, hematúria), fibromialgia, síndrome temporomandibular, cefaleia, enxaqueca, idade do diagnóstico da endometriose, idade no primeiro parto, paridade e número de gestações, história familiar da endometriose, tabagismo, alcoolismo, características alimentares e práticas esportivas.
n ≥ k [p1(1 - p1) + p2 (1 - p2)] 2
As pacientes com endometriose tiveram sua doença classificada durante o procedimento cirúrgico pelos critérios da American Society for Reproductive Medicine (ASRM), revisado em 1996, estádios I – IV.
FIGURA 4. Estadiamento da endometriose proposto pela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (1996).
4.5 Coleta de sangue e processamento das amostras
Todas as mulheres foram submetidas à coleta de amostra de sangue periférico (8 mL), com seringa e dispositivo flexível e transferido para tubo contendo EDTA (VACUPLAST®, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) e estocados em freezer -20°C (CONSUL®), até extração de DNA. Todos os experimentos foram executados no Laboratório de Genética da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Mato Grosso.
4.6 Extração de DNA
A extração de DNA foi realizada utilizando o método salting out descrito por Lahiri e Nurnberg (1991), com modificações (Miller et al., 1998). Em todos os experimentos foram utilizadas micropipetas (EPPENDORF®, Hamburg, DE) calibradas. Para tanto, foram utilizados 4,5 mL de sangue periférico total congelado e a esta quantidade foram adicionadas 7 mL de solução de lise I (10mM Tris-HCl; 0,32M Sacarose; 5mM MgCl2; Triton X-100 0,75%) homogeneizadas por 10 minutos e centrifugadas (SIGMA®, St. Louis, US) por 5 minutos a 7.000 rpm. O sobrenadante foi retirado e este processo foi repetido por mais duas vezes com apenas 3 mL da solução de lise I. Quando este procedimento não foi suficiente para o precipitado de células estar isento de hemoglobina, foi realizado mais uma vez. Após a última centrifugação, o sobrenadante foi retirado e o pelete ressuspendido em 1 mL solução de lise II (10mM Tris; 10mM EDTA; 10mM NaCl; 0,5% SDS) que constituiu a segunda etapa de lise. Em seguida, foi agitado no vórtex (FANEM®, São Paulo, BR), homogeneizado e adicionado 333 µL de solução de precipitação de proteínas (6M NaCl). O material foi novamente agitado no vórtex (FANEM®, São Paulo, BR) e até homogeneização e levado para centrifugação (SIGMA®, St. Louis, US) por 5 minutos a 7.000 rpm. E seguida 1220 µL de sobrenadante foram transferidos para dois tubos estéreis, dos quais foram adicionados 660 µL de isopropanol
100%. O material foi homogeneizado manualmente até que o DNA fosse observado e em seguida centrifugado (SIGMA®, St. Louis, US) por 10 minutos a 13.000 rpm. Descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 500 µL de álcool 70%, agitando-se no vórtex (FANEM®, São Paulo, BR) até o desprendimento do pelete. O material foi centrifugado (SIGMA®, St. Louis, US) por 10minutos a 13.000 rpm, sendo esta etapa repetida por mais duas vezes. Após último descarte de sobrenadante, os tubos abertos foram acomodados sobre papel toalha, e assim permaneceram em torno de 3 horas em temperatura ambiente. Para diluição, foram utilizados 200 µL de água ultra-purificada (PURELAB®, Indianapolis, US) sendo a solução homogeneizada com pipeta até apresentar-se gelatinosa e transparente. Caso a homogeneização não fosse alcançada, o material era colocado ao banho maria (FANEM®, São Paulo, BR) por 24h/56ºC. Todas as amostras de DNAs extraídas foram quantificadas no aparelho Nanodrop (MOD2000-UNISCIENCE®, Winnipeg, CA) na unidade de medida ng/µL. Finalmente, as amostras foram congeladas e armazenadas em freezer -20ºC (CONSUL ®, Whirlpool, U.S.).
4.7 Técnica de PCR (Reação em Cadeia de Polimerase)
Para realização de PCR, previamente foram selecionados os oligonucleotídeos utilizados para cada gene investigado, além dos volumes e concentrações utilizados dos reagentes. Para a PCR, utilizou-se como controle positivo, o gene da β globina (268pb). Também em cada PCR, utilizou-se como controle negativo água ultra-purificada (PURELAB®, Indianapolis, US). Na mistura da reação recém-preparada, foi adicionado 1µL de DNA correspondente para cada amostra, já devidamente identificados em microtubos apropriados. Para a reação de PCR foram utilizados concentrações de tampão 5 µL de 10x (Tris 100 mM/L, pH 8,3, KCL 500 mM/L, MgCl2 20 mM/L), 0,5 µl MgCl (50mM), 0,2 µl dNTPs (10mM/µL), 1,2 µLGSTM1, 1,2 µL GSTT1 e 1,2 µL β-globina de iniciadores (10mM/µL), 0,5 µl Taq DNA
polimerase (5U/mL) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 µl de amostra de DNA (100ng/µL), completando com água ultra-purificada até completar o volume final de 18µL. Em seguida, os tubos foram levados para o termociclador (AMPLITHERM®,) programando-se um tempo de ciclagem de: desnaturação inicial: 95ºC por 3 minutos; 35 ciclos de desnaturação (94ºC – 1 minuto); anelamento (60ºC – 1 minuto); extensão (72ºC – 1 minuto); 1 ciclo de extensão final (72ºC – 10 minutos). Para o preparo do gel de agarose 1,5%, foram utilizados 100mL de TBE 1x, 1,5g de agarose e 4µL de brometo de etídio. Em seguida, o material foi levado ao forno microondas (BRASTEMP®) por 90 segundos, despejado na cuba de eletroforese aguardando polimerização (ENDURO-LABNET®, Edison, US). Após serem amplificadas, as amostras foram aplicadas em gel de agarose 1,5% para a corrida de eletroforese de 90 v, 81 AM e 7 w, utilizando fonte de energia específica (ENDURO-LABNET®, Edison, US).
Tabela 1: Sequência de iniciadores utilizados para análise de PCR e os tamanhos dos fragmentos amplificados.
Gene Sequência (5’ 3’) Tamanho do
fragmento GSTT1 5'- GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3' 5'-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3' 480pb a GSTM1 5'-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3' 5'-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3' 215pb a
β Globina 5´ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3´
5´GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3´
268pba a Ichioka et al., 2009.
4.8 Determinação dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1
Para a genotipagem de GSTM1 e GSTT1, previamente amplificadas através de PCR Multiplex, utilizaram-se os tamanhos das bandas referentes aos fragmentos polimórficos,
480 pb para o genótipo GSTT1 positivo e de 215 pb para GSTM1 positivo. Como controle interno positivo foi utilizado β-Globina com fragmento de 268 pb. Para controle negativo para DNA foi utilizado água ultra-purificada (PURELAB®, Indianapolis, US). O marcador do peso molecular de DNA foi de 100 pb.
FIGURA 5. Eletroforese em gel agarose 1,5%: 1º – Marcador de peso molecular; 2º - Controle negativo para DNA; 3º, 4º, 6º, 9º - Positivo para GSTM1 e GSTT1; 5º, 8º, 10º, 11º, 13º, 15º e 16º - Positivos para GSTT1 e negativos para GSTM1; 7º e 12º Negativos para GSTT1 e positivos para GSTM1; 14º - Negativos para GSTM1 e GSTT1.
4.9 Análises estatísticas
Para as variáveis continuas foram calculado a media e o desvio padrão. Para a associação entre os polimorfismos GSTM1 e GSTT1 e a endometriose foram utilizados teste de proporção qui-quadradro (χ2) de Pearson, teste Z e teste Welsh. A comparação dos genes polimórficos GSTM1 e GSTT1 entre os grupos estudados foi utilizada razão de chance (OR), com intervalo de confiança de 95%. O valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significante. Os dados foram armazenados e analisados com auxílio do programa EpiData Software, version 2.2.2 build 177, Dinamarca.
GSTT1(480pb) β-Globina(267pb) GSTM1(215pb)
4.10 Considerações éticas
O protocolo da pesquisa foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Júlio Müller (n°954/CEP-HUJM/2010). Todas as participantes foram esclarecidas sobre os objetivos e procedimentos (punção venosa, entrevista e revisão de prontuários médicos) do presente estudo e sobre sua total liberdade para participar ou não. As participantes que concordaram em fazer parte do estudo assinaram inicialmente o TCLE. A pesquisa não conferiu nenhum risco, exceto aqueles inerentes a simples punção venosa.
Todas as pacientes receberam os resultados dos exames e da pesquisa, sendo que as mesmas são acompanhadas periodicamente no serviço de referência. Todas as pacientes são acompanhadas pela equipe do projeto e aquelas que apresentarem os polimorfismos genéticos que poderão ser considerados fatores de risco, receberão aconselhamento genético.
5. RESULTADOS
Os resultados referentes às distribuições de etnia, nos casos e controles estão apresentados na Tabela 2. Para estes parâmetros, não foram encontradas diferenças estatísticas entre os dois grupos incluídos no estudo. A média da idade dos casos foi 32,07 (±5,62) anos e controles, 31,01 (±6,20) anos p=0,208. No que se refere à média de idade da menarca, nos casos foi 12,68 (±2,35) anos e 12,49 (±3,19) nos controles p=0,116.
Tabela 2: Perfil demográfico de mulheres com endometriose e controles.
Casos (n=121) Controles (n=97) p Idadea 32,07 (+/-5,62) 31,06 (+/-6,20) 0, 208 Idade da menarca 12,68(+/-2,35) 12,49 (+/-3,19) a 0, 116 Etniab Branco 49 (40,5%) 40 (41,2%)b 0, 762 Negro 9 (7,4%) 11 (11,3%)b Pardo 60 (49,6%) 45 (46,4%) Asiático 2 (1,7%) 1 (1,0 %) Indígena 1 (0,8%) 0 (0,0%)
Familiares com endometriose
Sim 15 (12,4%) 8 (8,2%) 0, 167 Não 106 (87,6%) 89 (91,8%) Familiar acometido Irmã 5 (4,13%) 2 (2,1%) 0,669 Mãe 5 (4,13%) 2 (2,1%) 0,669 Prima 3 (2,48%) 3 (3,09%) 0,892 Tia 2 (1,65%) 1(1,0%) Não informado 106 (87,6%) 89 (91,75%) 0, 404 a Teste de Welsh; b Teste de Proporção (Teste Z).
A presença de familiares com endometriose e o grau de parentesco dos mesmos não configurou fator de risco para esta afecção nos grupos de casos e controles. Nos casos, foram relatados 15/121 (12,4%) de familiares acometidos e 8/97 (8,2%) nos controles p=0,167 (Tabela 2).
Na Tabela 3 não foram observadas diferenças nas frequências dos polimorfismos no gene GSTM1, entre casos e controles: OR=1,128 (IC=95% 0,660–1,927 p=0,659). No entanto, o polimorfismo do gene GSTT1 foi mais frequente nos controles do que nos casos, OR=0,529 (IC95% 0,285-0,983 p=0,0395).
Tabela 3: Frequências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 em casos e controles.
Genótipo Casos (n%) Controles(n%) OR95% p
GSTM1 Ausente 66 (54,50) 50 (51,50) 1,128 (0, 660-1, 927) 0,659 Presente 55 (45,50) 47 (48,50) GSTT1 Ausente 25 (20,70) 32 (33,0) 0,529 (0, 285- 0, 983) 0,0395 Presente 96 (79,30) 65 (67,0)
Quadrado-IC (95%), valor de p (bicaudal).
Nas Tabelas 4 e 5 estão apresentados os intervalos dos ciclos menstruais e a frequência dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 em casos e controles. O polimorfismo GSTM1, não apresentou associação com este parâmetro em casos (p=0,370) e
também nos controles (p=0,664). De modo semelhante, o polimorfismo no gene GSTT1 não mostrou associação com os intervalos nos ciclos menstruais em pacientes. No entanto, esse polimorfismo foi significativamente mais frequente nos controles com relação ao intervalo normal do ciclo menstrual do que naquelas com intervalo anormal (p=0,052).
Tabela 4. Associação entre os intervalos dos ciclos menstruais e a frequência do polimorfismo no gene GSTM1.
Intervalo do Ciclo Menstrual
Casos (n=121) Controle (n=97)
Anormal1 Normal2 IC(95%) p Anormal1 Normal2 IC(95%) p GSTM1 *Ausente 20 46 0,3281 – 1,513 0,370 17 33 0,5107 – 2,902 0,664 Presente 21 34 14 33
* Ausente = polimorfismo (deleção);
Presente=sem o polimorfismo (sem deleção). χ 2 Pearson;IC(95%); o valor de p
1 Anormal (Intervalo < 21 e >36 dias) 2Normal (Intervalo 22-35 dias)
Tabela 5. Associação entre os intervalos dos ciclos menstruais e a frequência do polimorfismo no gene GSTM1 entre casos e controles.
Intervalo do Ciclo Menstrual
Casos (n=121) Controles (n=97)
Anormal1 Normal2 IC(95%) p Anormal1 Normal2 IC(95%) p GSTT1 *Ausente 9 16 0,4308 – 2,823 0,797 6 26 0,1243 -1,009 0,052 Presente 32 64 25 40
* Ausente = polimorfismo (deleção);
Presente=sem o polimorfismo (sem deleção). χ 2 Pearson;IC(95%); valor de p
1 Anormal (Intervalo < 21 e >36 dias) 2Normal (Intervalo 22-35 dias)
Não houve associação entre os polimorfismos e o volume do sangramento menstrual tanto em casos como no grupo controle. Para GSTM1, em relação aos casos, o valor de p foi igual a 0, 645; nos controles, p igual a 0, 198. Para GSTT1, nos casos o valor de p foi 0, 853 e nos controles, p foi igual a 0, 950 (Tabela 6 e 7).
Tabela 6. Volume do sangramento menstrual e a frequência do gene GSTM1 entre casos e controles.
Intervalo do Ciclo Menstrual
Casos (n=121) Controles (n=97)
Anormal1 Normal2 IC(95%) p Anormal1 Normal2 IC(95%) p GSTM1 *Ausente 19 47 0,379- 1,824 0,645 27 46 0,762 – 3,938 0,198 Presente 18 37 12 35
* Ausente = polimorfismo (deleção); * Presente=sem o polimorfismo (sem deleção). Qui-quadrado; IC (95%), valor de p
1 Anormal (Volume > 2 dia < 7 dias) 2 Normal (Volume entre 3 - 7 dias).
Tabela 7. Volume do sangramento menstrual e a frequência do gene GSTT1 entre casos e controles.
Intervalo do Ciclo Menstrual
Casos (n=121) Controles (n=97)
Anormal1 Normal2 IC(95%) p Anormal1 Normal2 IC(95%) p GSTM1 *Ausente 8 17 0,402 -2,787 0,853 13 19 0,425 – 2,446 0,950 Presente 29 67 26 39
* Ausente = polimorfismo (deleção); * Presente=sem o polimorfismo (sem deleção). Qui-quadrado; IC (95%), valor de p
1 Anormal (Volume > 2 dia < 7 dias) 2 Normal (Volume entre 3 - 7 dias).
Na Tabela 8, são apresentadas as possíveis combinações entre os polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1, identificados nos casos incluídos no estudo, em relação ao estadiamento clínico da doença (I-mínima, II - leve III- moderada, IV-grave). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes.
Tabela 8: Combinação entre os polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 encontrados e estadiamento da endometriose.
Endometriose (n=121)
Genes Estágio
I – II Estágio III – IV Total (%) p GSTM1 e GSTT1 Ausente/ausente 25 20 45 (37,2) 0, 580 Ausente/presente 5 5 10 (8,3) Presente/ausente 28 23 51 (42,1) Presente/presente Total (%) 11 69 (57,0) 4 52 (43) 15 (12,4) 121 (100,0) * Ausente = polimorfismo (deleção);
* Presente=sem o polimorfismo (sem deleção). Teste Qui-quadrado=1, 963, GL=3, valor de p
6. DISCUSSÃO
A endometriose é uma doença ginecológica benigna, dependente de estrógeno e caracterizada pela implantação de tecido endometrial fora da cavidade uterina. A intensidade com que as manifestações clínicas se apresentam pode prejudicar diretamente a vida psicoemocional, profissional e social da mulher acometida.
Sendo uma doença frequente nos dias atuais e associada à infertilidade, é imprescindível que pesquisas sejam conduzidas objetivando fornecer subsídios para melhora nas formas de intervenções às mulheres acometidas.
Em nosso estudo, analisamos o efeito de variantes genéticas na susceptibilidade à endometriose. Observamos que a presença de familiares com endometriose e o grau de parentesco dos mesmos não contribuiu para o desenvolvimento dessa condição clínica. Acreditamos que, através deste tipo de análise, não foi possível verificar a existência de fator genético para familiares. Além disso, sugerimos que pelo fato da doença ser investigada nos últimos anos com procedimentos que oferecem boa acurácia nos resultados, e assim resultados mais fidedignos das mulheres em geral acometidas ou não pela doença.
Embora a literatura demonstre que idade da menarca, IMC, intervalos menstruais e aumento de volume menstrual sejam possíveis precursores da endometriose (14) em nosso estudo, não observamos associação. Levando-se em conta que fatores ambientais também podem contribuir para doenças complexas como a endometriose, supõe-se que devam ser investigados em mulheres de Mato Grosso.
Observamos que as frequências do polimorfismo no gene GSTM1, identificadas nos grupos de mulheres com e sem endometriose, foram 54,50 e 51,50%, respectivamente. Para GSTT1, as frequências corresponderam a 20,70% nos casos e 33% nos controles.
Outros estudos relatam que o polimorfismo no gene GSTM1 está presente em 53% das mulheres caucasianas e asiáticas, apresentando diferentes condições clínicas (Guo, 2005). Em decorrência de resultados conflitantes, questiona-se se de fato a deleção em GSTM1 (polimorfismo) está relacionada ao aumento no risco de desenvolvimento de endometriose (Guo, 2005). As frequências do polimorfismo no gene GSTT1 foram observadas variando de 11-20% em caucasianas e 47% em asiáticas (Rebbeck, 1997; Guo, 2005).
Os primeiros estudos com desenho epidemiológico do tipo caso-controle relatando envolvimento de polimorfismos GSTT1 no desenvolvimento da endometriose relataram frequência de 20% deste em mulheres com endometriose e 9,7% em mulheres saudáveis (OR=2,32). Mundialmente, a frequência do polimorfismo no gene GSTT1 varia entre 9 -74% em mulheres afetadas e entre 9-48% em mulheres sem endometriose (Guo, 2005).
No presente estudo, a presença do polimorfismo no gene GSTM1 (ausente) não contribuiu para o desenvolvimento de endometriose. Estudos semelhantes a este, em mulheres de diferentes etnias, como americanas, inglesas, gregas, coreanas, japonesas, iranianas e italianas corroboram nossos achados (Hadfield et al., 2001; Baxter et al., 2001; Arvantis et al., 2003; Hur et al., 2004; Kim et al., 2007; Matsuzaka et al., 2012; Seifati et al., 2012; Vichi et al., 2012).
Resultados mostrando associação entre o polimorfismo em GSTM1 e endometriose foram observados em mulheres francesas, indianas, mulheres de Taiwan, iranianas (Baranova et al., 1997; Hsieh et al., 2004; Babu et al., 2005; Rozati et al., 2008; Huang et al., 2010; Hosseinzadeh et al., 2011).
Em uma meta-análise, demonstrou-se que o polimorfismo no gene GSTM1 não está associado à susceptibilidade a endometriose (Guo, 2005). Contudo, as análises do polimorfismo no gene GSTT1 (ausente) mostraram associação com a doença. Sugere-se que
este resultado apresente vieses, uma vez que parâmetros como: número de indivíduos em cada grupo estudado, critérios de inclusão /exclusão de controles foram heterogêneos em cada estudo.
Em nosso estudo, o número de indivíduos foi calculado com intervalo de confiança de 95% e um poder de precisão de 80%, porém a amostra recrutada foi maior, dando força de 90% de precisão. Todas as mulheres recrutadas foram submetidas à avaliação laparoscópica e histopatológica, considerada a melhor (padrão-ouro) para caracterização de casos ou controles.
Nossos resultados demonstraram que o polimorfismo no gene GSTT1 foi significativamente mais observado no grupo controle, desempenhando papel protetor. Resultados semelhantes são observados em outros trabalhos (Vichi, 2012). Não se sabe se de fato o polimorfismo no gene GSTT1 confere efeito protetor para endometriose.
Quando comparamos os genes polimórficos GSTM1 e GSTT1 (ausentes) com alterações no volume do sangramento menstrual, não encontramos associação. Em relação aos intervalos dos ciclos menstruais e associação com o gene GSTM1 (ausente), não encontramos diferenças estatisticamente significante. No entanto, quando comparados os intervalos dos ciclos menstruais e associação com o gene GSTT1 (ausente) este conferiu fator de proteção as mulheres portadoras do polimorfismo, sendo as que apresentarem maior número de ciclos menstruais normais.
Uma vez que as enzimas de GST foram encontradas em células que compõem o tecido ovariano, e concomitantemente participando com 3β-hidroxiesteroide hidroxigenase na conversão de pregnenolona a progesterona e desidroepiandrosterona para androstenediona e desempenham um papel importante na gênese de esteróides sexuais (Rahilly et al, 1991). Nosso estudo examinou uma possível ação associação entre polimorfismos GSTM1 e GSTT1 com o
intervalo do ciclo menstrual e volume de sangramento. A falta de associação encontrada pode sugerir que e modificação no ciclo menstrual das mulheres com endometriose não sofreu o impacto destes polimorfismos.
Supõem-se neste estudo que a ausência de atividade das enzimas antioxidantes resultantes dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 não afetaram a produção de espécies reativas de oxigênio, resultantes da resposta inflamatória na cavidade peritoneal. A condição clínica aparentemente não está associada à presença da deleção em GSTM1.
Por outro lado, deleção em GSTT1 (polimorfismo) foi observada em mulheres saudáveis. A ausência da enzima nesse grupo não afetou seu papel no processo de detoxificação.
Sugerimos que presença do polimorfismo em GSTT1, ou seja, a ausência na atividade deste gene possa contribuir para o aumento na produção de espécies reativas de oxigênio que por sua vez poderão favorecer danos no DNA e consequentemente apoptose. Assim, em mulheres saudáveis tais efeitos contribuem para a não implantação de tecido endometrial ectópico. Além desta suposição, a contribuição dos produtos de outros polimorfismos em genes envolvidos com a síntese e metabolização de esteróides, somados a outros ainda não conhecidos, devem ser consideradas e investigadas em pesquisas futuras.
7. CONCLUSÕES
Através do estudo da associação dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 com endometriose em mulheres de Mato Grosso, concluímos que:
1. As frequências dos polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 são semelhantes às observadas na literatura;
2. A presença do polimorfismo no gene GSTM1 não está associada à ocorrência de endometriose na população de mulheres de Mato Grosso;
3.No entanto o polimorfismo do gene GSTT1 conferiu proteção as mulheres sadias;
4. Os polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 não influenciaram as características clínicas das mulheres com endometriose.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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