MATERIAL E MÉTODOS

Análises morfológicas Coleta de adultos

Foram coletados frutos de hospedeiros de A. antunesi, A. atrigona, A. bahiensis, A. coronilli, A. curitis, A. distincta, A. manihoti, A. pickeli, A. pulchra, A. striata, A. sororcula, A. turpiniae e A. zenildae. Para A. manihoti e A. pickeli, além de frutos também foram coletados ramos jovens de seu hospedeiro preferencial (Manihot esculenta Crantz). As coletas foram realizadas nos municípios de Manaus, Maués e Presidente Figueiredo no estado do Amazonas, de Camamu, Maracás e Una no estado da Bahia, de Porto Velho no estado de Rondônia e de Boa Vista no estado de Roraima.

As amostras de frutos e ramos jovens foram pesadas e armazenadas individualmente em frascos plásticos de 500 mL contendo vermiculita e cobertos por organza. Após aproximadamente dez dias, a vermiculita foi peneirada e as pupas obtidas foram contadas e transferidas para frascos plásticos de 30 mL contendo vermiculita úmida e cobertos com organza até a emergência dos adultos. Os adultos foram mortos em etanol 100%, armazenados em freezer -20ºC e posteriormente foram contados, sexados e identificados.

Após a pesagem dos frutos, foram retiradas algumas larvas (de uma a cinco larvas por fruto) e outras larvas (de uma a cinco larvas por fruto) foram mantidas nos frutos até a emergência dos adultos. As larvas foram mortas e armazenadas como descrito acima para os adultos. Apenas em uma amostra de larvas houve a emergência de duas espécies de Anastrepha que foram identificadas através da técnica PCR-RFLP testada neste estudo.

Identificação dos adultos

A identificação das espécies de Anastrepha foi realizada através das fêmeas. O acúleo de cada fêmea foi extrovertido e colocado entre lâmina e lamínula para análise das características ao microscópio óptico. A identificação ao nível de espécie foi baseada em Steyskal (1977), Silva e Ronchi-Teles (2000), Zucchi (2000) e Zucchi et al. (2011a).

Os espécimes testemunho foram depositados na Coleção de Invertebrados do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, Amazonas, e na coleção do Departamento

de Ciências Biológicas do Laboratório de Entomologia da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia.

Análises moleculares Extração de DNA

Foi extraído o DNA de cerca de cinco adultos de A. antunesi, A. atrigona e A. manihoti, e cerca de dez adultos e dez larvas de A. bahiensis, A. coronilli, A. curitis, A. distincta, A. pickeli, A. pulchra, A. striata, A. sororcula, A. turpiniae e A. zenildae, totalizando 94 adultos e 100 larvas. A extração de DNA foi realizada utilizando-se o kit de extração de tecidos animais DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) e o protocolo descrito em Han e McPheron (1997) que utiliza fenol e clorofórmio, com uma etapa adicional usando proteinase K (20 mg/mL) e incubação a 55°C por 30 min.

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Para a reação de PCR foram utilizados primers para amplificar fragmentos dos genes mitocondriais COI (citocromo oxidase I) e 16S, e o espaçador ITS1 (espaçador interno transcrito 1) (Tabela 1) de todas as espécies listadas acima. As reações de PCR foram realizadas nas condições descritas em McPheron et al. (1994). Três µL de DNA extraído foram usados nessa reação, tendo volume final de 25 µL.

Tabela 1 - Oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados na amplificação via PCR.

Primer Sequência Referência

COI LCO1490: 5' GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3' HCO2198: 5' TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 3’ Folmer et al. 1994 16S LR-J-12883: 5′ CTCCGGTTTGAACTCAGATC 3′ LR-N-13398: 5′ CGCCTGTTTATCAAAAACAT 3′ McPheron et al. 1999 ITS1 18SF: 5’ TAACTCGCATTGATTAAGTCCC 3’ 5.8SR: 5’ GATATGCGTTCAAATGTCGATG 3’ Prezotto 2008

A amplificação foi realizada em termocicladores [Swift Maxi Thermal Cycler (ESCO) e TC-512 (Techine)] com programas específicos para cada par de primers (Tabela 2).

Tabela 2 - Programas específicos para amplificação de cada par de oligonucleotídeos iniciadores

(primers) para espécies de Anastrepha.

Etapas COI 16S ITS1

Desnaturação inicial 94º (3 min) 95º (12 min) 94º (2 min) Desnaturação 94º (1 min) 94º (30 seg) 94º (30 seg) Anelamento 50º (1 min) 54º (30 seg) 54º (30 seg) Extensão 72º (1 min) 72º (1 min) 68º (2 min) Extensão final 72º (10 min) 72º (5 min) 72º (5 min)

Ciclos 39 40 31

Para cada reação de amplificação, foram corridos géis de agarose a 1% corados com GelRed (10.000X) com tampão TBE 0,5X preparado de acordo com Sambrook e Russel (2001). As amostras foram preparadas utilizando-se 2 µL de produto de PCR, 2 µL de uma solução de azul de bromofenol 0,25%, xileno cianol 0,25% e sacarose 40% e 4µL de água milli-Q estéril. Como marcador de peso molecular foi utilizado φX174 DNA/BsuRI digerido com Hae III. As bandas de DNA foram visualizadas e fotografadas em fotodocumentador de luz ultravioleta (UV).

Reação de Purificação dos fragmentos amplificados

Após a obtenção dos produtos de PCR dos exemplares de Anastrepha, as amostras foram purificadas para a eliminação de resíduos de oligonucleotídeos iniciadores, de RNA e de di- nucleotídeos tri-fostato que podem interferir no sequenciamento dos fragmentos de DNA que foram amplificados. Para a purificação foram utilizadas as enzimas exonuclease I de Escherichia coli (EXOI) e fosfatase alcalina de camarão (SAP) adicionadas ao produto de PCR.

As reações de purificação foram realizadas em termociclador (Termociclador Mastercycler Gradiente, Eppendorf) onde foram incubados a 37°C por 30 minutos e em seguida a 80°C por 15 minutos. Para cada reação de purificação, foram corridos géis de agarose a 1,7%, corados com brometo de etídeo (5g/mL), utilizando o tampão TBE 0,5X preparado de acordo com Sambrook et al. (1989). Essa etapa foi realizada no laboratório de Genética e Biologia Molecular da UESC.

As amostras foram preparadas utilizando-se 12 μL de produto de PCR na concentração de 20 ng / μL, 0,66 μL de EXOI, 0,66 μL de SAP e 0,68 μL de água Mili-Q, totalizando 20 μL de

solução. Os géis foram fotografados utilizando-se o sistema Image Quant 350 (GE Healthcare). As reações que se apresentaram totalmente purificadas foram sequenciadas.

Sequenciamento (COI)

Foram obtidas três sequências de cerca de 700 pb que compreendem o tRNA cisteína, o tRNA tirosina e um fragmento da subunidade I do gene da Citocromo Oxidase de indivíduos das espécies A. antunesi, A. atrigona, A. bahiensis, A. coronilli, A. curitis, A. distincta, A. manihoti, A. pickeli, A. pulchra, A. striata, A. sororcula, A. turpiniae e A. zenildae.

Os produtos de PCR foram sequenciados com os mesmos oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de amplificação. O sequenciamento dos fragmentos de DNA amplificados foi realizado em um sequenciador automático (MegaBACETM DNA Analysis System 1000 da GE Healthcare) no Centro de Estudos do Genoma Humano da Universidade de São Paulo.

As sequências geradas para o gene COI foram comparadas com os genes correspondentes de Anastrepha spp. ou de Drosophila yakuba Burla disponíveis no GenBank. O alinhamento das sequências foi conduzido utilizando-se o programa Clustal W. As sequências serão depositadas no GenBank. As sequências obtidas foram utilizadas para gerar mapas de restrição utilizando-se o programa Webcutter 2.0 (Heiman 1997) que auxiliaram na escolha das enzimas testadas.