Pacientes: Foram incluídos neste estudo portadores de EMRR e EMSP, ambos, atendidos no Ambulatório de Neurologia do Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). A maioria dos pacientes é residente na cidade de Campinas ou em municípios vizinhos do Estado de São Paulo.
Critérios de Inclusão: Tanto a coleta de material dos indivíduos saudáveis para o grupo controle, como dos pacientes com EM, ocorreu após concordância de cada participante, tendo assinado uma cópia do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) proposto para este trabalho. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade de Ciências Médicas desta instituição (FCM-UNICAMP), registrada sob o número CAAE: 53022516.3.0000.5404.
Critérios de Exclusão: Foram excluídos da pesquisa indivíduos que:
1. Possuíam histórico de malignidades ou eram portadores de doenças infecto-contagiosas ou invasivas;
2. Não se enquadravam nos critérios estabelecidos por McDonald revisados (Polman et al., 2005), portanto, com diagnóstico de EM não claramente definido.
Coleta de pacientes e indivíduos saudáveis: Durante os anos de 2014-2015, foram recrutados 38 pacientes com EM e 40 indivíduos saudáveis para realização deste estudo.
Características clínicas: Os achados clínicos, como índice de EDSS, tempo de doença, tipo de tratamento e presença de BOC, para os indivíduos EMRR e EMSP, foram coletados dos prontuários de cada paciente e estão reunidos nas Tabelas 1 e 2.
Tabela 1: Sumário dos achados clínicos dos grupos de pacientes EMRR e controle estudados.
Coleta de sangue e LCR: As amostras foram obtidas durante o acompanhamento ambulatorial dos pacientes para exclusão de outras possíveis doenças. Quando os pacientes foram submetidos à coleta de soro e LCR para investigação da presença de BOC, por exemplo, uma alíquota destes materiais foi reservada para o nosso estudo. Assim, obtivemos: soro e sobrenadante do LCR para a realização do método ELISA; além de células do LCR e sangue periférico, ambos, para citometria de fluxo. As amostras de soro e LCR foram armazenadas em tubos de polipropileno, à -80ºC, para preservação até a realização do teste ELISA.
ELISA para GrB: A GrB presente no soro dos pacientes EMRR, EMSP e indivíduos do grupo controle foi investigada pelo método ELISA com o kit Abcam® (ab46142) (Abcam, Cambridge, UK). Segundo o protocolo do fabricante, 100 microlitros das amostras e das soluções para construção da curva padrão foram incubadas microplacas (Immulon I, Nunc, Roskilde, Denmark) com 50 microlitros do anticorpo anti – GrB marcado com biotina. Após 3 horas de incubação e lavagens, foi adicionado, em cada well, 100 microlitros de solução padronizada de estreptavidina-peroxidase (Sigma Chem, USA), associada à solução reveladora com substrato. Após 30 minutos e novas lavagens adicionou-se 100 microlitros do cromógeno, e após 10-20 minutos ao abrigo da luz, adicionou-se 100 microlitros da solução de parada que interrompeu a reação. As microplacas foram lidas em leitor de ELISA (Labsystem) a 492 nm. As concentrações finais foram obtidas em picogramas/mL.
Separação dos linfócitos: Uma alíquota do sangue total dos pacientes EMRR, EMSP e dos
indivíduos saudáveis foi separada para a realização da citometria de fluxo. Posteriormente, no restante das amostras foi realizada separação das PBMCs por gradiente de Ficoll-hypaque®. Após contagem das PBMCs obtidas, através da câmara de Neubeur, foi possível ajustar a concentração celular para o isolamento de linfócitos B ou pDCs.
Isolamento dos linfócitos B: As PBMCs separadas de acordo com o item anterior foram incubadas por 30 minutos com o mix do kit The EasySep® Human B Cell Enrichment, que isola linfócitos B por seleção negativa. As células não desejadas são marcadas com Complexos Tetraméricos de Anticorpo que reconhecem células não-linfócitos B e os beads
magnéticos. Utilizando o magneto EasySep®, as células não desejadas ficam retidas na parede do tubo por ação do campo magnético, enquanto as células B puderam ser coletadas em outro tubo.
Estimulação de linfócitos B para o fenótipo produtor de GrB: Após o isolamento, os linfócitos B foram colocados em meio de cultura (RPMI-1640 Sigma Aldrich, MO, USA) enriquecido com 10% de soro humano AB, antibióticos e glutamina. Durante 16-24h em cultura, foi realizado estímulo com CPG-ODN (5 µg/mL), IL-21 (100 ng/mL) e LPS (50 ng/mL (Jahrsdörfer et al., 2006; Hagn et al., 2014), segundo a literatura, para investigação da expressão de GrB. Após o período em cultura, os sobrenadantes foram armazenados à -80ºC, e as células foram marcadas para investigação do perfil CD19+ GrB+ através da citometria de fluxo.
Isolamento de pDCs: De maneira semelhante à obtenção linfócitos B, o isolamento de pDCs ocorreu a partir da incubação de PBMCs, obtidos do sangue periférico por gradiente de Ficoll-hypaque®, com o mix do kit The EasySep® Human pDC Cell Enrichment. A seleção negativa permite a obtenção das pDCs e retenção das células não-pDCs no interior do tubo submetido ao magneto EasySep®.
Estimulação de pDCs para o fenótipo produtor de GrB: Após o isolamento, as pDCs foram também colocadas em meio de cultura (RPMI-1640 Sigma Aldrich, MO, USA) enriquecido com 10% de soro humano AB, antibióticos e glutamina. Durante 16-24h em cultura, foi realizado estímulo com CPG-ODN (5 µg/mL) e IL-21 (100 ng/mL) (Jahrsdörfer et al., 2010), segundo a literatura, para investigação da expressão de GrB. Após o período em cultura, os sobrenadantes foram armazenados à -80ºC, e as células foram marcadas para investigação do perfil BDCA-2+ GrB+ através da citometria de fluxo.
Estimulação de linfócitos no LCR para o fenótipo produtor de GrB: Após centrifugação a 800 rpm, por 10 minutos, o precipitado contendo as células do LCR foi ressuspendido em meio de cultura (RPMI-1640 Sigma Aldrich, MO, USA) enriquecido com 10% de soro humano AB, antibióticos e glutamina. Durante 16-24h em cultura, foi realizado estímulo com
CPG-ODN (5 µg/mL), IL-21 (100 ng/mL) e LPS (50 ng/mL), para investigação da expressão de GrB em linfócitos CD4+, CD8+ e CD19+, através da citometria de fluxo.
Citometria de Fluxo: Após o período de estimulação, as culturas de LCR, linfócitos B e pDCs foram lavadas e os pellets ressuspendidos em 100 microlitros para marcação com os anticorpos. No sangue periférico e LCR foram utilizados os anticorpos anti human BD de superfície: CD3 – PercP 5.5., CD4 – APC, CD 8 – APC-Cy7, e CD 19 – FITC. Enquanto que as culturas de populações isoladas, de linfócitos B e pDCs, foram marcadas com CD 19 – FITC e BDCA-2 – APC, cada uma, respectivamente. Após 30 minutos de incubação para marcação extracelular, todas as amostras foram lavadas, e os pellets ressuspendidos em 200 microlitros de tampão Fixation/Permeabilization do kit BD CytoFix/CytoPerm™ (BD Biosciences®) para a fixação da molécula de anticorpo à membrana e permeabilização celular. Após 20 min com tampão Fixation/Permeabilization, à 4º C, o pellet de células será novamente lavado em 2 ml de Perm/Wash™ e ressuspendido em 100 microlitros do mesmo tampão de lavagem. Para a investigação do perfil citotóxico realizou-se marcação intracelular com anticorpo anti Granzima B – PE em todas as amostras. A aquisição foi realizada em citômetro de fluxo Gallios® (Beckman Coulter), e para as análises utilizou-se o software FlowJo®.
CBA para GrB: A GrB presente no sobrenadante das culturas de linfócitos B e pDCs, ambos isolados, dos pacientes EMRR e indivíduos do grupo controle foi investigada pelo método Cytometric Bead Array (BD Biosciences®). Segundo o protocolo do fabricante, 50 microlitros das amostras e das soluções para construção da curva padrão foram incubadas com beads que contém anticorpos monoclonais para GrB. Após incubação por 2 horas, foi adicionado anticorpo revelador conjugado com o fluorocromo PE. A aquisição foi realizada em citômetro de fluxo FACSCanto (BD Bioscience®), e para as análises utilizou-se o software FCAP Array (BD Bioscience®).