UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
VINÍCIUS DE OLIVEIRA BOLDRINI
ESTUDO DOS LINFÓCITOS B E CÉLULAS
DENDRÍTICAS PLASMOCITÓIDES CITOTÓXICOS NO
SANGUE PERIFÉRICO DE PACIENTES COM
ESCLEROSE MÚLTIPLA
STUDY OF CYTOTOXIC B LYMPHOCYTES AND
PLASMACYTOID DENDRITIC CELLS IN THE
PERIPHERAL BLOOD OF PATIENTS WITH MULTIPLE
SCLEROSIS
CAMPINAS 2016
ESTUDO DOS LINFÓCITOS B E CÉLULAS DENDRÍTICAS
PLASMOCITÓIDES CITOTÓXICOS NO SANGUE PERIFÉRICO
DE PACIENTES COM ESCLEROSE MÚLTIPLA
STUDY OF CYTOTOXIC B LYMPHOCYTES AND
PLASMACYTOID DENDRITIC CELLS IN THE PERIPHERAL
BLOOD OF PATIENTS WITH MULTIPLE SCLEROSIS
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestre em Genética e Biologia Molecular, na área de Imunologia.
Dissertation presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Genetics and Molecular Biology, in the Immunology area.
Orientadora: Profa. Dra. Leonilda Maria Barbosa dos Santos
CAMPINAS 2016
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO VINÍCIUS DE OLIVEIRA BOLDRINI E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. LEONILDA MARIA BARBOSA DOS SANTOS.
Campinas, 31 de março de 2016.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Leonilda Maria Barbosa dos Santos [Orientadora]
Prof. Dr. Denis Bernardi Bichuetti Prof. Dr. André Luis Bombeiro Profa. Dra. Mariana Lazarini
Profa. Dra. Carolina Francelin Rovarotto
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
EPÍGRAFE
“Ser ou não ser, eis a questão – será mais nobre suportar na mente as flechadas da trágica fortuna, ou pegar em armas e lutar contra um mar de escolhos, e enfrentando-os, vencer?!”
AGRADECIMENTOS
A Deus, Inteligência Suprema e Causa Primeira de todas as coisas; que, através de Sua bondade e amor inexauríveis, nos permite, durante o curso natural da vida, infinitas oportunidades de crescimento e amadurecimento tanto de ordem moral quanto intelectual. Aos meus pais, Regina e Ariovaldo; por nunca terem medido esforços, fazendo tudo no limite de suas forças, para que me tornasse uma pessoa de bem. Em retribuição, apenas tenho-lhes a oferecer meu mais puro e sincero Amor; cuja origem é anterior ao berço e a permanência é para além de minha sepultura.
Ao estimado amigo, Prof. Emanuel Cristiano Rodrigues Mendes Domingues; pela grata oportunidade de verdadeira amizade e pela transmissão de inúmeros conhecimentos.
Ao estimado amigo, Prof. José Roberto Borelli Barros; por despertar em mim o interesse pelas Ciências Biológicas. Bem como pelo grande carinho, apoio e estímulo, desde o início, tão característicos de nossa sincera e verdadeira amizade.
À estimada amiga e Profa. Dra. Juliana Signori Baracat Zeferino; pelas aulas e também pela orientação no Trabalho de Conclusão de Curso na Faculdade de Ciências Biológicas da PUC-Campinas, o que me abriu portas e permitiu também realizar, agora, este trabalho. É preciso parabenizá-la ainda, querida Ju, sobretudo, pelo seu empenho na tarefa da docência e por sua sempre verdadeira disposição em ajudar e colaborar para o desenvolvimento de seus alunos, em todos os momentos. Sou grato por poder contar com sua amizade e incentivo! À querida Profa. Dra. Leonilda Maria Barbosa dos Santos; pelo estímulo e generoso acolhimento, permitindo-me fazer parte de sua equipe no Laboratório de Neuroimunologia, onde tanto pude aprender nestes anos de trabalho e convivência. Muito obrigado, Professora, pela orientação neste trabalho e pelos ensinamentos constantes! Agradeço também a todos os colegas dos Laboratórios de Neuroimunologia e de Neuroimunomodulação, pela sincera acolhida. Especialmente, devo agradecer à Equipe de “Humanos”, com destaque ao: Adriel, Alliny e Marília; pelo aprendizado na rotina de trabalho... Muito obrigado, pessoal!
Também agradeço ao Raphael e à Verônica; que vieram, posteriormente, nos ajudar no andamento dos trabalhos.
Ao Dr. Alfredo Damasceno, Dr. Rafael Paternó e Dr. Carlos Otávio Brandão; que constituem o “braço médico” de nossa equipe, e nos ajudam grandemente com sugestões, e também no recrutamento dos pacientes para as pesquisas. Ainda, no trato com os pacientes, é preciso lembrar da equipe de Ressonância Magnética do HC da UNICAMP: Andressa, Elessandra, Ieda, Juliana, Lourdes, Mônica, Valéria e Vanessa. Sem a ajuda de vocês o nosso trabalho seria muito mais difícil... Portanto, muito obrigado!
À Dra. Ana Leda Longhini e à Irene Santos pela ajuda com os sortings, citometria e também com a análise do CBA... Ana e Irene, muito obrigado!
Também, agradeço à Dra. Elaine Conceição Oliveira e ao Dr. Alessandro Farias pela ajuda na análise dos dados e sugestões sempre pertinentes ao andamento do projeto... Muito obrigado, Elaine e Lê!
Lembro ainda de todos os amigos, familiares, e, sobretudo, de todos os professores com quem tive oportunidade de conviver, e que através do conhecimento e incentivo transmitidos, me permitiram ser aquilo que sou. Aos queridos mestres, de todos os tempos, muito poderia ser dito em agradecimento... Na tentativa de dizer muito, falando pouco, recorro à palavra inspirada do mestre de Königsberg, Immanuel Kant, que de forma oportuna, considerou, lucidamente: “O homem não é nada além daquilo que a educação faz dele”.
Com carinho, agradeço aos pacientes de Esclerose Múltipla, do Ambulatório de Neurologia da UNICAMP; que, em meio a tantas dificuldades, sempre se dispõem a participar de nossas pesquisas, nos encorajando sempre à continuidade desta atividade. Não há como agradecer, verdadeiramente, a confiança que depositam em nosso trabalho... Assim, faço votos de que nosso estudo possa contribuir para o alento, senão deles próprios, daqueles que futuramente venham a sofrer pelas mesmas causas.
Finalmente, agradeço às agências CAPES, FAPESP e CNPq pelo apoio financeiro que permitiu a realização deste trabalho.
A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença autoimune do sistema nervoso central responsável pela desmielinização nas substâncias branca e cinzenta. Os mecanismos de citotoxicidade estão descritos como os mais importantes na indução da desmielinização na EM. A participação dos linfócitos T CD8+ e células NK nas lesões teciduais da EM está bem descrita na literatura. No entanto, nos últimos anos a atividade citotóxica começa a ser descrita em outras células como linfócitos T CD4+, B e células dendríticas plasmocitóides (pDCs). Neste trabalho, investigamos o sangue periférico de pacientes com EM remitente-recorrente (EMRR) e EM secundária progressiva (EMSP) para a produção de granzima B (GrB) pelas populações de linfócitos T, B e pDCs. Foi verificado que as populações de linfócitos B, T CD4+ e T CD8+ expressam significativamente mais GrB intracelular no sangue periférico de pacientes EMRR do que em indivíduos saudáveis. De forma semelhante, os linfócitos B e pDCs dos pacientes EMRR, quando isolados e estimulados, expressam também maiores quantidades de GrB no sobrenadante de cultura do que os indivíduos do grupo controle. Embora classicamente as granzimas estejam associadas ao processo de desmielinização na EM, evidências recentes sugerem a participação da GrB em mecanismos regulatórios. Nosso estudo é o primeiro a demonstrar a expressão de GrB em pDCs de pacientes com EM, abrindo novas perspectivas para um mecanismo ainda desconhecido da doença, e que quando melhor compreendido, pode gerar novas abordagens terapêuticas para o manejo da doença.
Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory autoimmune disease that leads to demyelination of the central nervous system. Cytotoxicity mechanisms are described as important for induction of demyelination in MS. The participation of CD8 + T lymphocytes and NK cells in the tissue lesions of MS, is well described in the literature. However, in recent years the cytotoxic activity begins to be described in other cells such as CD4 + T lymphocytes, B lymphocytes and plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In this study, we investigated the peripheral blood of patients with relapsing-remitting MS (RRMS) and secondary progressive MS (SPMS) for the production of granzyme B (GrB) by populations of T lymphocytes, B lymphocytes and pDCs. It was observed that B lymphocytes, CD4 + and CD8 + T cells express significantly more intracellular GrB in peripheral blood of RRMS patients than in healthy subjects. Similarly, the B cells and pDCs of RRMS patients, when isolated and stimulated, also express greater amounts of GrB in the culture supernatant than the control subjects. Although granzymes are those classically associated with demyelination process in MS, recent evidence suggests the involvement of GrB in regulatory mechanisms. Our study is the first to demonstrate the GrB expression in pDCs of patients with MS, opening new perspectives for an yet unknown mechanism of the disease, and when better understood, can lead to new therapeutic approaches to the clinical management of the patients.
LISTA DE ABREVIATURAS
AG = Acetato de Glatirâmer
APC = Célula Apresentadora de Antígenos (Antigen Presenting Cell) BAFF = Fator ativador de linfócitos B
BCR = Receptor de célula B
BDNF = Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (Brain Devivated
Neutrotrofic-Factor)
BHE = Barreira Hemato-Encefálica CD3 = Cluster of Differentiation 3 CD4 = Cluster of Differentiation 4 CD8 = Cluster of Differentiation 8 CD19 = Cluster of Differentiation 19 CD20 = Cluster of Differentiation 20 CD45RA = Cluster of Differentiation 45RA CD56 = Cluster of Differentiation 56
CD303 = Cluster of Differentiation 303 (BDCA-2)
CIS = Síndrome Clinicamente Isolada (Clinically Isolated Syndrome) CXCL12 = Ligante de quimiocina CX 12
CXCL13 = Ligante de quimiocina CX 13 CXCR4 = Receptor de quimiocina CX 4 CXCR5 = Receptor de quimiocina CX 5 DC = Célula Dendrítica
DMD = Drogas Modificadoras de Doença (Disease Modifying Drug) EBV = Vírus Epstein-Barr
EAE = Encefalomielite Autoimune Experimental
EDSS = Escala Expandida do Estado de Incapacidade (Expanded Disability Status
Scale)
EM = Esclerose Múltipla
EMPP = Esclerose Múltipla Primária Progressiva
EMRR = Esclerose Múltipla Remitente Recorrente/Surto Remissão EMSP = Esclerose Múltipla Secundária Progressiva
FDA = Food and Drug Administration fDC = Célula Dendrítica folicular GrA = Granzima A
GrB = Granzima B GrH = Granzima H GrK = Granzima K GrM = Granzima M
FTY720 = Fingolimod (Imunossupressor)
Gd+ = Contraste de Gadolínio (observado em lesões ativas da EM) HLA = Antígeno Leucocitário Humano (Human Leukocyte Antigen) HSc = Célula tronco hematopoiética
IFN = Interferon
IFN-β = Beta-interferon (ou Interferon-beta) IDO = Indoleamina-2,3-dioxigenase IFN-γ = Interferon-γ IgD = Imunoglobulina D IgG = Imunoglobulina G IgM = Imunoglobulina M IL = Interleucina IL-4 = Interleucina-4 IL-6 = Interleucina-6 IL-7 = Interleucina-7 IL-9 = Interleucina-9 IL-10 = Interleucina-10 IL-12 = Interleucina-12 IL-17 = Interleucina-17 IL-21 = Interleucina-21 IL-22 = Interleucina-22 IL-23 = Interleucina-23 LCR = Líquido cefalorraquiano M6PR = Receptor de Manose-6-Fosfato
MBP = Proteína básica de mielina
MOG = Glicoproteína de Mielina presente em Oligodendrócitos
MHC = Complexo principal de histocompatibilidade (Major Histocompatibility
Complex)
MRZ = Sarampo, Rubéola e Varicella zoster NK = célula Natural Killer
NTZ = Natalizumab (anticorpo monoclonal)
PBMC = Células mononucleares do sangue periférico pDC = célula Dendrítica Plasmocitóide
PLP = Proteína Proteolipídica
RIS = Síndrome Radiolologicamente Isolada (Radiologically Isolated Syndrome) RMI = Imagem de Ressonância Magnética
S1PR = Receptor de esfingosina-1-fosfato SNC = Sistema Nervoso Central
TCR = Receptor de célula T
TGF-β = Fator de Crescimento Transformador β (Transforming Growth Factor β) Th1 = Linfócitos T helper 1
Th2 = Linfócitos T helper 2 Th17 = Linfócitos T helper 17 TLR = Receptor do tipo Toll
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 15
Epidemiologia, sintomatologia e formas pré-clínicas da Esclerose Múltipla... 16
Fatores de risco para a Esclerose Múltipla... 19
Resposta imune na Esclerose Múltipla... 20
Linfócitos B na Esclerose Múltipla... 22
Células Dendríticas Plasmocitóides na Esclerose Múltipla... 26
Citotoxicidade na Esclerose Múltipla... 29
Tratamento na Esclerose Múltipla... 34
OBJETIVOS ... 38 MATERIAL E MÉTODOS ... 40 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 46 CONCLUSÃO ... 61 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 63 ANEXOS ... 105
Epidemiologia, sintomatologia e formas pré-clínicas da Esclerose Múltipla
A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença autoimune do sistema nervoso central (SNC), caracterizada pela desmielinização nas substâncias branca e cinzenta (Hafler et al., 2005; Lassmann et al., 2007). A EM acomete, sobretudo, adultos jovens entre os 20 e 40 anos de idade e predominantemente indivíduos do sexo feminino, em uma razão de duas a três mulheres para cada homem afetado (Steinman, 2001; Steiman et al., 2002).
A EM é a maior condição incapacitante não traumática presente em adultos jovens, com cerca de 2,5 milhões de pessoas afetadas mundialmente (Pelletier & Haefler, 2012). Abordagens farmacológicas e não farmacológicas são utilizadas na tentativa de se evitar a progressão doença, bem como para o controle dos sintomas nos pacientes (Asche et al., 2010). Estima-se que ao longo da vida os custos, com cada paciente, cheguem a aproximadamente 1.2 milhão de dólares (Trisolini et al., 2010). Apenas nos EUA, estima-se um gasto de 14 bilhões de dólares anuais, para o tratamento de seus quase 500 mil pacientes com EM (Kobelt et al., 2006; Perumal & Khan, 2012).
No Brasil, um estudo determinou que a prevalência da EM, na cidade de São Paulo, no ano de 1990 era de 4,27/100.000 indivíduos (Callegaro et al., 1992). Posteriormente, em 1997, essa prevalência, na mesma cidade, era de 15/100.000 indivíduos (Callegaro et al., 2001). O aumento do número de casos pode ser real, mas também pode ser resultado de diagnóstico mais acurado e utilização de imagens por ressonância magnética (MRI) (Polman et al., 2005).
Em termos clínicos, a sintomatologia da EM é bastante diversa, dependendo da extensão e da área lesionadas no SNC. Os achados mais comuns nos pacientes com EM incluem: fadiga, dificuldade para andar (em 60-85%), espasticidade (em cerca de 75%); dor (em 80%), depressão (em 50-75%) e déficit cognitivo (em 40-60%). Outros sintomas, menos comuns, incluem disfunções sexuais e nos tratos urinário e intestinal. Em vista deste quadro, idealmente, o atendimento dos pacientes com EM deve contar com uma equipe multidisciplinar, com educadores físicos, terapeutas ocupacionais, neuropsicólogos e outros; afim de que a qualidade de vida dos pacientes possa melhorar, ao menos, com relação aos
sintomas mais prevalentes (Chiaravalloti et al., 2008; Compston & Coles, 2008; Goodman et al., 2009; Berger et al., 2011; Stein et al., 2011; Zwibel & Smrka, 2011; Stoll et al., 2012; Tullman, 2013).
Os sintomas refletem o agravamento da doença, e o comprometimento motor gerado pela EM é quantificado, em cada paciente, pela Escala Expandida do Estado de Incapacidade (EDSS) desenvolvida por Kurtzke (1983). Diversos estudos tem relacionado o EDSS com as taxas de atrofia cerebral encontradas nas substâncias branca e cinzenta nos pacientes com EM (Fischer et al., 2000). Foi verificado ainda que, enquanto atrofia na substância branca parece diminuir, ao longo dos anos, a atrofia na substância cinzenta tende a aumentar, e por isso, esta se mostra mais relacionada ao agravamento da doença (De Stefano et al., 2003; Fisniku et al., 2008).
Neste sentido, em termos radiológicos, através de MRI, evidências de lesões desmielinizantes no SNC disseminadas no tempo e no espaço podem corroborar os achados clínicos, auxiliando o diagnóstico da EM (Swanton et al., 2006; Swanton et al; 2007). Diversos estudos estabeleceram a relação entre o aumento do número e do volume de lesões captantes de gadolínio (Gd+) com a atividade e progressão da EM, estabelecendo-se assim este tipo de lesão como um importante marcador de atividade da doença (Kappos et al., 1999; Sormani et al., 2009; Sormani et al., 2010). Os eventos de desmielinização podem ser verificados, pela MRI, em indivíduos clinicamente assintomáticos. Nestes casos, classifica-se como síndrome radiologicamente isolada (RIS), um episódio sem manifestações clínicas, mas que apresenta critérios radiológicos sugestivos de processo desmielinizante (Barkhof et al., 1997). Embora os pacientes com RIS, também chamada EM pré-clínica, possam permanecer assintomáticos do ponto de vista clínico, acredita-se que cerca de um terço deles evolua, em um período de dois anos (Lebrun et al., 2008; Okuda et al., 2009), para os quadros conhecidos como síndrome clinicamente isolada (CIS) e para a forma surto-remissão da EM (EMRR) (Siva et al., 2009). Estudo recente demonstrou, através de análise retrospectiva de MRI, que homens, com menos de 37 anos e com lesões medulares possuem risco de conversão de RIS para CIS, de aproximadamente 90%, em até 5 anos (Okuda et al., 2014).
A CIS é classificada como um evento inflamatório desmielinizante no SNC que resulta em sinais e sintomas compatíveis com o quadro clínico da EM. Acometimentos no nervo óptico, diplopia, ataxia e parestesias são achados comuns nos pacientes que passaram pelo episódio de CIS (Frohman et al., 2003). Foi demonstrado, por exemplo, que pacientes em CIS com duas ou mais lesões na substância branca do SNC, concomitantes à sintomatologia clínica, possuem maior risco de desenvolver EMRR clinicamente definida (O’Riordan et al., 1998) .
Na forma EMRR, presente em aproximadamente 85-90% dos pacientes, ocorrem períodos de agudização ou exacerbação dos sintomas clínicos, chamados de surtos, seguidos por fases de remissão (Hafler et al., 2005; Steinman, 2014). No período de remissão pode ocorrer tanto a recuperação completa das funções neurológicas, como também disfunções neurológicas residuais que persistem ao longo do tempo (Lublin & Reingold, 1996). Os surtos são o reflexo clínico de um evento inflamatório responsável pela formação das áreas de desmielinização nas substâncias branca e cinzenta (Brownell & Hughes, 1962; Kidd et al, 1999; Lumsden, 1970). Vários estudos sugerem a desmielinização na substância branca como evento patológico inicial na EM (Sepulcre et al., 2009; Freund et al., 2011), entretanto, outras evidências apontam que o acometimento das substâncias branca e cinzenta ocorrem independentemente uma da outra no contexto da doença (Kutzelnigg et al., 2007; Gilmore et al., 2009). As lesões no córtex cerebral podem ocorrer desde a fase inicial da EM (Lucchinetti et al., 2011), e aparecem em três formas: lesões leucocorticais, pequenas lesões intra corticais e lesões subpiais (Bo et al., 2003). As lesões na região subpial parecem ser especificas da EM, uma vez que não são encontradas em outras doenças neurodegenerativas (Fischer et al., 2013; Moll et al., 2008). Durante a fase ativa de destruição da mielina, os axônios degeneram em uma extensão variável de paciente para paciente e variável, até mesmo, em um determinado paciente (Ferguson et al., 1997; Trapp et al., 1998; Kornek et al., 2000).
Além da forma EMRR, aproximadamente 10-20% dos pacientes desenvolvem outra forma inicial da doença denominada primária progressiva (EMPP). Nestes casos o
comprometimento é progressivo com velocidade variável, e é difícil identificar a ocorrência de surtos bem definidos (Lublin e Reingold, 1996; Sellner et al. 2011).
Após cerca de 10 anos, quando os danos neurológicos atingem certo limite (Hauser & Oksenberg, 2006), em aproximadamente 50-60% dos pacientes com a forma EMRR (Lassmann et al., 2012), a doença se torna secundária progressiva (EMSP). Nos pacientes com EMSP os surtos se tornam raros ou ausentes e, ao mesmo tempo, há uma contínua deterioração neurológica. Enquanto a forma EMRR era caracterizada pelo intenso processo inflamatório, observado por meio das lesões Gd+ na MRI, sugere-se que na forma EMSP predomine o fenômeno de neurodegeneração, resultando em atrofia cortical mais pronunciada. Especula-se que isso aconteceria, sobretudo, porque o processo inflamatório seria impedido pelo reestabelecimento da barreira hemato-encefalica, que teria sido fechada ou parcialmente restaurada nos pacientes com EMSP (Hochmeister et al., 2006).
Fatores de risco para a Esclerose Múltipla
Entre os fatores associados à ocorrência da EM, a vitamina D, por exemplo, tem ganhado destaque como um possível componente ambiental. Nos últimos anos, diversos estudos tem elucidado a função imunoregulatória deste esteroide, entretanto, mais estudos são necessários para compreender como a vitamina D pode agir na fisiopatologia da EM (Ascherio et al., 2010; Farias et al., 2013). Também, fatores sócio-econômicos, como a chamada “hipótese da higiene”, e o tabagismo, tem sido associados à maior ocorrência de processos autoimunes (Friend et al., 2006). Ainda, fatores genéticos, como a presença de determinados alelos do complexo principal de histocompatibilidade/antígeno leucocitário humano (MHC/HLA) tem sido investigados na EM (Okuda et al., 2009).
Assim, ainda que se considere a etiologia da EM como desconhecida, sabe-se que diversos fatores podem também contribuir para a sua ocorrência. No aspecto microbiológico, além da infecção pelo EBV (Wandinger et al., 2000), atribui-se papel importante, por
exemplo, ao herpes vírus humano 6 (HSV-6) e às bactérias Chlamydia pneumoniae (Meinl et al., 2006) e Borrelia burgdorferi (Bednárová et al., 2005).
Também, a resposta policlonal (MRZ) contra os vírus do sarampo, rubéola e varicela zoster tem sido relatada entre 70-92% dos pacientes com EM (Felgenhauer et al., 1992; Reiber et al., 1998; Hottenrott et al., 2015). Acredita-se que estes e outros agentes etiológicos funcionem como gatilhos para o desencadeamento da resposta autoimune presente na EM, uma vez que produzem peptídeos estruturalmente semelhantes aos componentes da mielina. Assim, por mimetismo molecular, estes determinantes antigênicos poderiam induzir, por exemplo, o reconhecimento da proteína básica de mielina (MBP), presente nos oligodendrócitos, por linfócitos T (Wucherpfenning & Hafler, 1995; Olson et al., 2004), iniciando o quadro da doença.
Resposta imune na Esclerose Múltipla
Em termos imunológicos, a EM, em suas diferentes formas clínicas, é considerada uma doença inflamatória de caráter autoimune, responsável pela desmielinização nas substâncias branca e cinzenta do SNC (Lassmann et al., 2007).
Atualmente, a autoimunidade é entendida como um mecanismo fisiológico normal. O organismo convive com os clones de linfócitos autorreativos e com os autoanticorpos, devido principalmente aos mecanismos de indução de tolerância imunológica periférica. As doenças autoimunes acontecem quando há falhas ou ativação desses mecanismos.
Os linfócitos T autorreativos, que escaparam aos mecanismos de tolerância central e periférica, e que, portanto, reconhecem antígenos próprios, podem migrar para o SNC em consequência de ativação causada, por exemplo, pelos agentes infecciosos, em um fenômeno conhecido como ativação bystander ou de mimetismo molecular (Sospedra & Martin, 2005). O MHC de classe II presente em células apresentadoras profissionais (APCs), como macrófagos, células dendríticas e linfócitos B, apresenta epítopos que são reconhecidos por linfócitos T CD4+, através do receptor de células T (TCR). Assim, verifica-se que o processo
inflamatório, responsável pelo dano tecidual na EM, está associado à presença de infiltrado de linfócitos T CD8+, T CD4+ e B, além de plasmócitos (Frischer et al., 2009), macrófagos e fatores solúveis, identificados como anticorpos, complemento e citocinas além das espécies reativas do oxigênio e nitrogênio (Genain et al., 1996). Autoanticorpos, entre os quais anti-MOG e o recentemente descrito anti-KIR4.1 (Srivastava et al., 2012), são capazes de induzir desmielinização axonal tanto através da opsonização para macrófagos capazes de fagocitar a mielina (Trotter et al., 1986), quanto através da ativação do sistema complemento, resultando na montagem do complexo de ataque à membrana em oligodendrócitos (MAC) (Mead et al., 2002). Também, o aumento da liberação de interferon (IFN)-γ e do fator de necrose tumoral (TNF)-α, concomitante à redução da expressão de interleucina (IL)-10, por exemplo, sugerem que o desbalanço na liberação de citocinas pró e anti-inflamatórias está associado à atividade da EM (Correale et al., 1995).
Mosmann e colaboradores (1986) postularam sobre a existência de duas subpopulações de células T CD4+, denominadas Th1 e Th2, em que: Th1 era caracterizada pela elevada produção de IFN-γ, estimulada pela interleucina 12 (IL-12), gerando imunidade celular contra patógenos intracelulares, e Th2, que desempenharia funções tanto na destruição de parasitas extracelulares quanto na mediação da resposta imune humoral, por meio da secreção das interleucinas (IL)-4, -5, -13, e -24 (Sospedra & Martin, 2005; Steinman, 2007).
Muitos destes mecanismos fisiopatológicos propostos para a EM só puderam ser melhor investigados e compreendidos a partir do modelo da Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE). A EAE é induzida através da imunização de animais com antígenos de mielina, como o MBP, e adjuvantes, resultando em infiltrado inflamatório, desmielinização e dano axonal no SNC, de maneira semelhante à EM (Nylander & Hafler, 2012). Embora existam diferenças na fisiopatologia das duas doenças, diversos estudos comprovaram que vários mecanismos imunológicos estão presentes tanto na EAE quanto na EM. Estes achados permitiram, por exemplo, que a investigação da eficácia e da segurança de possíveis drogas para o tratamento da EM fossem antes avaliadas no modelo da EAE.
Um dos mecanismos, por muito tempo, sugeridos era que os linfócitos Th1 constituiam os principais mediadores da neuroinflamação, através da liberação de citocinas como o IFN-γ, tanto na EAE quanto na EM (Olsson et al., 1992; Balashov et al., 1997). Entretanto, foi possível verificar que mesmo animais knockout para IFN-γ (Ferber et al., 1996) e IL-12 (Becher et al., 2002) eram capazes de desenvolver a EAE, o que sugeria a participação de outros mediadores inflamatórios na fisiopatologia da doença. Em vista desta evidência foi possível identificar, posteriormente, também na EM, que uma população de linfócitos T CD4+ encefalitogênicos produtora de IL-17 (Murugaiyan et al., 2008) era gerada a partir do estímulo pelo fator de crescimento transformante (TGF)-β, e pelas IL-6, -21, e -23 (Bettelli et al., 2008; Korn et al., 2007). Esta nova população denominada de linfócitos CD4+ Th17 seria responsável, além da produção de IL-17A e -17F, também pela expressão de outras citocinas inflamatórias como IL-21 e -22 (Korn et al., 2009). Logo, verificou-se que o perfil Th17 parecia induzir uma forma mais severa da EAE, quando comparada à doença mediada pelo perfil Th1 (Stromnes et al., 2008), e isto foi explicado pela elevada quantidade de IL-17 no SNC dos animais doentes (Domingues et al., 2010).
Pacientes com lesões ativas na EM apresentam linfócitos Th17 reativos ao MBP e grandes quantidades de IL-17 no sangue periférico (Hedegaard et al., 2008). Também, os linfócitos Th17 podem ser encontrados no infiltrado inflamatório característico das lesões ativas da EM (Tzartos et al., 2008), demonstrando com isso o envolvimento desta população tanto na fisiopatologia central quanto periférica da doença.
Linfócitos B na Esclerose Múltipla
Os linfócitos B são células que participam das respostas imunológicas adaptativas. A primeira função descrita para estas células foi a capacidade de produção de anticorpos (Fagraeus, 1948 apud). Behring e Kitassato (1890 apud) foram os primeiros a demonstrar a importância de fatores solúveis na imunidade contra a difteria e o tétano. Posteriormente, Erlich (1908 apud) sugeriria que estes fatores ou antitoxinas eram produzidos por células com receptores específicos para estas toxinas (Cooper, 2015). A partir destes achados foi possível
investigar a natureza química dos anticorpos (Endelman, 1959; Porter, 1959), bem como as estruturas anatômicas relacionadas à sua produção (Rabellino & Grey, 1971). Um estudo, com modelo experimental, por exemplo, permitiu observar que a retirada da Bursa de Fabricius, um órgão linfoide associado à mucosa, presente em aves, prejudicava as respostas humorais dos indíviduos bursectomizados contra a bactéria Salmonella typhimurium (Glick et al., 1956). Por outro lado, a bursectomia prevenia o surgimento de um tipo de linfoma em linfócitos B de aves, enquanto que a timectomia não interferia neste processo (Peterson et al., 1963). Assim, percebeu-se que a Bursa de Fabricius era o principal sítio de desenvolvimento de linfócitos B em aves, uma vez que a retirada do órgão durante o período embrionário tornava os indivíduos incapazes de desenvolver linfócitos B e, consequentemente, de produzir anticorpos (Ratcliffe, 1989). Desta forma, as evidências pareciam indicar que os diferentes órgãos linfoides possuíam diferentes funções (Warner et al, 1962; Cooper et al., 1966), e que as linhagens de linfócitos T e B pareciam atuar nas respostas imunológicas de maneira independente. Esta ideia foi reforçada ao verificar que aves, simultaneamente, bursectomizadas e timectomizadas apresentavam comprometimento tanto das respostas imunológicas celulares quanto humorais (Hitzig, 1958 apud).
Diferentemente das aves, em mamíferos, o desenvolvimento de linfócitos B ocorre no fígado fetal, durante o período embrionário, e na medula óssea, nas demais fases da vida (Owen et al, 1974; LeBien & Tedder, 2008). A diferenciação de células tronco hematopoiéticas (HSc), localizadas na cavidade da medula óssea, permite o surgimento dos precursores dos linfócitos B que se diferenciam terminalmente em célula B madura (Riser & Vassali, 1974; Raff et al., 1976). No microambiente da medula óssea, vários fatores são necessários para a diferenciação dos linfócitos B. A quimiocina CXCL12, por exemplo, liberada a partir de células estromais (Tashiro et al., 1993), foi descrita como essencial para a formação dos primeiros precursores dos linfócitos B (Egawa et al., 2001). Também, a quimiocina CXCL12 é importante no recrutamento de HSc, através do receptor CXC4 (CXCR4), para o interior da cavidade medular nas etapas inicias do desenvolvimento fetal (Nagasawa et al., 1996; Ara et al., 2003).
A produção destes anticorpos altamente específicos ocorre, sobretudo, fora da medula óssea, em estruturas denominadas centros germinativos (Liu & Banchareau, 1996). Os centros germinativos são estruturas localizadas nos órgãos linfoides secundários, dentro dos quais, as células B maduras, recém-saídas da medula óssea, sofrem expansão clonal e diferenciação em células de memória ou em plasmócitos (Klein & Dalla-Favera, 2008). As células B maduras
naives, que sofrem rearranjo das cadeias V(D)J e também possuem o receptor de células B
(BCR) funcional, migram para os folículos linfoides secundários, onde são capazes de reconhecer antígenos (Victora & Nussenzweig, 2012). Assim, esses linfócitos B sofrem hipermutação somática e expansão clonal, na chamada zona escura dos centros germinativos.
Posteriormente, na chamada zona clara, ocorre a maturação de receptores e formação de anticorpos com alta afinidade, induzidos por moléculas co-estimulatórias, entre as quais: CD40, fator ativador de células B (BAFF) e também receptores do tipo Toll-like (TLRs) (Victora & Nussenzweig, 2012).
A migração no interior dos centros germinativos, bem como a expansão clonal e a maturação dos receptores, requer a interação dos linfócitos B com células dendríticas foliculares (fDCs) (Tew et al., 2001), linfócitos T CD4+ e macrófagos, nestes nichos. As fDCs, por exemplo, secretam a quimiocina CXCL13, capaz de orientar tanto a movimentação dos linfócitos B quanto dos linfócitos T CD4+, no interior destas estruturas, uma vez que ambos possuem o receptor (CXCR5) para esta quimiocina (Cyster et al., 2000).
Curiosamente, em diversas doenças autoimunes, tem sido relatada a presença de nichos ectópicos contendo fDCs, linfócitos interfoliculares e linfócitos B com centros germinativos. Acredita-se que estas formações levem à persistência na resposta autoimune mediada por autoanticorpos e quimiocinas (Hjelmstrom et al., 2001), ou ainda através do recrutamento de linfócitos T e produção de citocinas pró-inflamatórias (Kratz et al.,1996), o que poderia ser indicativo de manutenção do processo inflamatório e consequente piora no prognóstico de diferentes doenças (Weyand et al., 2001). Nichos linfoides ectópicos contendo centros germinativos foram descritos, por exemplo, em doenças como: tireoidite autoimune (Armengol et al., 2001), síndrome de Sjögren (Salomonsson et al., 2003), artrite reumatoide seguida de sinovite (Takemura et al., 2001), e artrite psoriática (Cañete et al., 2007).
Estes achados ectópicos, bem como a expressão de quimiocinas CXCL13 e BAFF, foram também descritos também na EM (Magliozzi et al., 2004; Serafini et al., 2004; Magliozzi et al., 2007). Estudo recente demonstrou a correlação entre a presença de CXCL13 e linfócitos B no LCR de pacientes em CIS, com maior taxa conversão para a forma EM clinicamente definida (Ferraro et al., 2013).
Antes mesmo da descrição dos nichos ectópicos nas meninges de pacientes com EM, já se sugeria que os linfócitos B poderiam participar da fisiopatologia da doença através da síntese de autoanticorpos contra epítopos da mielina (Prineas et al., 1981). Posteriormente, com a verificação da existência destes autoanticorpos (Genain et al., 1999), observou-se também a síntese intratecal de imunoglobulinas de especificidade desconhecida, denominadas de bandas oligoclonais (OCB) (Walsh 1986; Sharief et al., 1991). A presença de OCB é o achado imunológico mais comumente encontrado em pacientes com EM, e está associada à expansão clonal dos linfócitos B no líquido cefalorraquiano de seus portadores (Colombo et al., 2000). Foi verificado que a ocorrência tanto de autoanticorpos (Qin et al., 2003; Bennet et al., 2008) como de OCB (Ferraro et al., 2013) parece aumentar a chance de conversão de pacientes em CIS para o diagnóstico de EM clinicamente definida. Assim, estes achados lançaram maiores evidências sobre o possível envolvimento dos linfócitos B como agentes de desmielinização na EM.
Neste sentido, outros estudos foram feitos no intuito de se esclarecer como os linfócitos B participam da fisiopatologia da EAE e também da EM, uma vez que as duas doenças foram entendidas, por algum tempo, como mediadas, exclusivamente, por linfócitos CD4+ Th1 (Sriram et al., 1982; Comabella et al., 1998).
Um estudo recente mostrou, por exemplo, que os linfócitos Th17 parecem contribuir, através da produção de IL-17, para a formação de nichos ectópicos de linfócitos B, no SNC, durante o curso da EAE (Peters et al., 2011). Os linfócitos Th17 podem contribuir para o estabelecimento dos centros germinativos, e ao mesmo tempo os linfócitos B possivelmente colaboram para a diferenciação de linfócitos Th17, pela liberação de IL-6 e TGF-β. Desta forma, sustenta-se o processo patológico, tanto por meio de respostas celulares quanto
humorais (Gommerman & Browning, 2003). Neste sentido, foi sugerido que animais tratados com Acetato de Glatirâmer (AG) tiveram um abrandamento no curso da EAE, devido ao aumento na produção de IL-10 por linfócitos B (Kala et al., 2010; Begum-Haque et al., 2011). Ainda, foi visto que a liberação de IL-4 e IL-13 aumentou, em linfócitos B de animais com EAE tratados com AG, enquanto que a expressão de IL-6, IL-12, TNF-α, e BAFF diminuiu, nestes mesmos animais (Begum-Haque et al., 2010).
Correale e colaboradores (2008) mostraram uma evolução menos agressiva da EM em pacientes com infecções parasitárias, o que se justificaria pelo predomínio de uma resposta do tipo Th2, com citocinas anti-inflamatórias, utilizadas para o combate aos helmintos. Foi visto ainda que pacientes com EM têm menos linfócitos B capazes de produzir IL-10 do que indivíduos saudáveis (Duddy et al., 2007). Isto parece ser uma evidência de que o desequilíbrio da ação reguladora exercida pelos linfócitos B, através de citocinas anti-inflamatórias, é importante para o agravamento no curso da EM.
Outra relação mais recentemente investigada refere-se ao envolvimento da IL-21 na atividade dos linfócitos B (Ettinger et al., 2008; Kaltenmeier et al., 2015). A IL-21, que compartilha a cadeia gama de seu receptor com as citocinas IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15, é produzida por linfócitos T foliculares, células NKT e pelos linfócitos Th17 (Habib et al., 2003; Moens & Tangye, 2014). Além de agir como mitógeno para os próprios linfócitos Th17 e células T foliculares (Kom et al., 2007; Vogelzang et al., 2008), a IL-21 também promove mudança de isotipo e diferenciação de linfócitos B (Ozaki et al., 2002; Spolski & Leonard, 2008), além de induzir a produção de granzimas tanto em linfócitos B (Hagn et al., 2009; Hagn et al., 2012) como em pDCs (Bratke et al., 2010; Jahrsdörfer et al., 2010). Tanto os linfócitos B quanto as pDCs possuem receptores funcionais para a IL-21 (Karrich et al., 2013; Lindner et al., 2013).
Células Dendríticas Plasmocitóides na Esclerose Múltipla
As células dendríticas plasmocitóides (pDCs) constituem uma população distinta das células dendríticas convencionais (cDCs), e possuem papel importante na montagem e
regulação das respostas imunes (Banchareau et al., 2000). Lennert & Remmele (1958) foram os primeiros a descrever as pDCs no paracórtex de linfonodos ativados, indicando o envolvimento destas células na ativação de linfócitos T (Cella et al., 1999). As pDCs apresentam grande capacidade de produzir IFNs do tipo I (IFNs α/β) em resposta a produtos virais ou microbianos (Siegal et al., 1999; Liu, 2005). Esta capacidade depende, por exemplo, da interação de estruturas como o DNA viral de fita simples, ou o DNA bacteriano de fita dupla, com os receptores do tipo Toll-like (TLR), 7 e 9, respectivamente, encontrados nas pDCs. Quando este reconhecimento ocorre as pDCs liberam citocinas pró-inflamatórias, como IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α (Liu et al., 2005), além de quimiocinas (Sozzani et al., 2010), que possuem efeitos pleiotrópicos sobre linfócitos T e B, células NK e cDCs (Kadowaki et al., 2000).
Originadas a partir de um progenitor mielóide comum, caracterizado como Flt3+ M-CSFR+ cKitlow (Naik et al., 2007; Onai et al., 2007), as pDCs, em humanos, são caracterizadas como CD11c− CD45RA+ CD85g+ (ILT-7) CD123+ CD132+ (IL21R) CD303+ (BDCA-2) (Dzionek et al., 2000; Dzionek et al., 2001; Rissoan et al., 2002; Cao et al., 2006; Karrich et al., 2013). Ainda, as pDCs podem expressar CD4, MHC de classe II, IL3R, BDCA-4 e CD2 (Swiecki et al., 2010; von Glehn et al., 2012).
Após a captura e o processamento de um antígeno viral, as pDCs migram para os linfonodos, onde promovem estímulos para a diferenciação, expansão e sobrevivência de linfócitos T que se tornaram ativados. Recentemente, foi sugerida ainda a participação de linfócitos Th17 na ativação das pDCs através da produção de IL-26 (Croxford et al., 2015), o que reforça a ideia do envolvimento destas células tanto em processos de combate a patógenos como também em eventuais transtornos autoimunes. Acredita-se que as pDCs contribuam, sobretudo, para o processo inflamatório através da liberação de IFN do tipo I, IL-6 e IFN-γ, promovendo a polarização tanto Th1 quanto Th17 (Serada et al., 2008; von Glehn et al., 2012).
Ao mesmo tempo, acredita-se que estes próprios linfócitos ativados sejam capazes de emitir sinais que induziriam as pDCs para efeitos tolerogênicos (Karrich et al., 2013). Esta
ação supressora desempenhada pelas pDCs pode ser, ao menos parcialmente, explicada expressão da enzima intracelular indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO) (Munn et al., 2004). A IDO cataboliza o aminoácido triptofano, através do consumo de espécies reativas de oxigênio, e gera metabólitos conhecidos como kinureninas (Kwidzinski & Bechmann, 2007). Acredita-se que estes metabólitos Acredita-sejam capazes de induzir linfócitos T reguladores (Hill et al., 2007).
Assim, o envolvimento das pDCs no desbalanço das respostas imunológicas, tem sido associado a diversas doenças de autoimunidade (Bennett et al., 2003; Nestle et al., 2005; Gottenberg et al., 2006).
Em pacientes com EM, o número de pDCs no sangue periférico parece ser semelhante ao número encontrado em indivíduos saudáveis (Lopez et al., 2006). Contudo, além da presença no líquido cefalorraquiano (LCR) (Pashenkov et a., 2001), a observação de que o número de pDCs aumenta no LCR de pacientes EM durante os surtos (Longhini et al., 2011), sugere o envolvimento local desta população na neuroinflamação. Curiosamente, foi descrita maior produção de quimiocinas CCL3, CCL4 e CCL5, que regulam a migração das pDCs para os sítios inflamatórios, em pacientes com EM não tratados (Aung et al., 2010).
Assim, a presença de pDCs no LCR, no infiltrado inflamatório das meninges e nas lesões ativas de pacientes sugere um envolvimento mais pró-inflamatório desta população no contexto da EM. (Pashenkov et al., 2001; Lande et al., 2008). No entanto, evidências da EAE parecem mostrar um envolvimento mais complexo das pDCs. Por exemplo, foi verificado aumento na liberação de IL-17 e IFN-γ por linfócitos T CD4+, durante o pico da EAE, em animais que tiveram suas pDCs depletadas sugerindo a participação desta população em mecanismos tolerogênicos (Bailey-Bucktrout et al., 2008).
Recentemente descritas com a capacidade de expressão de GrB as pDCs parecem liberar e direcionar estas proteases mediante o contato célula-célula, e de maneira independente de perforinas, para os linfócitos T (Jahrsdorfer et al., 2010). A IL-10 parece estimular a expressão de GrB pelas pDCs, o que sugere também a participação de linfócitos B e Th2 na indução deste perfil. A produção de GrB pelas pDCs, por sua vez, tem sido
associada à inibição da proliferação de linfócitos T, e estímulo para o surgimento de linfócitos T reguladores (Gondek et al., 2005; Vignali et al., 2008).
O entendimento dos mecanismos de expressão de GrB pelas pDCs, até o momento, não foram descritos na EM e podem colaborar para o desenvolvimento de futuras estratégias de controle da doença.
Citotoxicidade na Esclerose Múltipla
Devido à extensa desmielinização do sistema nervoso central, encontrada em pacientes com EM, os mecanismos que levam ao dano tecidual têm sido estudados desde o início do último século. Marburg (1906 apud) postulou a existência de um fator solúvel desmielinizante, enquanto a escola Francesa indicava a importância das células pro-inflamatórias no processo de destruição da mielina na EM (Babinski, 1885 apud). Posteriormente, diversos estudos mostraram que os dois mecanismos estão envolvidos no dano à mielina. Células T citotóxicas que reconhecem os antígenos expressos nos oligodendrócitos (Na et al., 2008; Saxena et al., 2008), ou autoanticorpos dirigidos contra a mielina foram descritos (Linington et al.,1988). Com relação às lesões na região subpial, onde a existência e produção de um fator desmielinizante é altamente provável, os estudos patológicos não foram capazes de mostrar a participação de anticorpos e de complemento ativados (Brink et al., 2005; Fischer et al., 2013). Trabalhos recentes, entretanto, sugerem a participação de um fator solúvel com efeito mielinotóxico produzido por linfócitos B (Howell et al., 2011; Lisak et al., 2012).
Com a introdução dos modelos de cultura de células foi descoberto que o soro e amostras do líquido cefalorraquiano de pacientes com EM contém fatores solúveis que podem induzir desmielinização in vitro (Bornstein & Appel,1965; Hughes & Field, 1967, Lumsden, 1971). Trabalhos clássicos mostraram que o soro de animais que desenvolveram EAE apresentavam fatores citotóxicos (Appel & Bornstein, 1964; Bornstein & Appel, 1961), e eventualmente, identificados como autoanticorpos ativavam as moléculas do sistema complemento tanto in vitro (Grundkel et al.,1981) como in vivo (Lassmann et al.,1981,1983).
O antígeno alvo desses anticorpos foi posteriormente identificado como a glicoproteína da mielina dos oligodendrócitos (MOG) (Linington & Lassmann, 1987; Linington et al., 1988). Esses autoanticorpos induziam placas parecidas com desmielinização na substância branca (Storch et al., 1998), assim como na substância cinzenta do cérebro (Storch et al., 2006). Os estudos realizados in vivo mostraram que os danos teciduais lembravam os observados na EM. Esses autoanticorpos podiam induzir lesões corticais desmielinizantes, na região subpial, semelhantes às observadas na EM (Storch et al.,2006). Curiosamente, os pacientes com EM possuem elevados índices de anticorpos anti-MOG (Lalive et al., 2006), embora considere-se que este achado não seja específico da doença (Lalive et al., 2011).
No entanto, a remoção dos anticorpos e a inativação do complemento não aboliram a atividade citotóxica do soro sugerindo o envolvimento de agentes com potencial citotóxico e desmielinizante ainda desconhecidos (Grundkel and Bornstein, 1980). De forma semelhante, recentemente, Lisak e colaboradores (2012) descreveram a existência de fatores, capazes de induzir oligodendrócitos à morte in vitro. Estes fatores obtidos no sobrenadante de culturas de linfócitos B isolados a partir de pacientes EMRR, embora ainda não identificados, sugerem a participação desta população em possíveis mecanismos fisiopatológicos ainda desconhecidos na EM.
Assim, entre as diversas moléculas com potencial citotóxico, as granzimas têm sido relatadas em diversas doenças inflamatórias, tanto de etiologia viral quanto de fundo autoimune. A função classicamente descrita para estas proteases, homólogas à tripsina, é a indução do processo de morte na célula-alvo através da clivagem de substratos extra ou intracelulares (Barry & Bleackley 2002).
Diversos estudos têm demonstrado a participação das granzimas, por exemplo, na degradação de antígenos virais (Romero & Andrade, 2008), bem como, na clivagem e remodelamento de componentes da matriz extra celular (Froelich et al., 1993; Buzza et al., 2005). Ainda, tem se sugerido que estas proteases podem funcionar como citocinas (Metkar et al., 2008), sendo capazes de gerar imunossupressão por meio de estímulos para os linfócitos T CD4+ reguladores (Gondek et al., 2005; Devadas et al., 2006).
Níveis pouco elevados de granzima circulante, em indivíduos saudáveis, não estão associados a comprometimento das funções fisiológicas (Spaeny-Dekking et al., 1998; Bade et al., 2005). Entretanto, este achado não exclui o possível envolvimento patogênico destas proteases, que é suportado por diversas evidências. Por exemplo, a presença de granzimas foi descrita em lesões ateromatosas (Kim et al., 2007); no fluido broncoalveolar de pacientes com asma (Bratke et al., 2004), no líquido sinovial de portadores de atrite reumatoide (Ronday et al., 2001), e em diversas infecções virais (ten Berge et al., 1998), como pelo HIV e dengue (Buzza & Bird, 2006).
Embora não se saiba exatamente como as granzimas extracelulares sejam secretadas, sugere-se que formas solúveis, descritas em diversas doenças, circulem de modo menos ativo ou até inativo, como zimogênios, dependendo da interação com outras proteínas para adquirirem capacidade citotóxica (Prakash et al., 2009). Assim, o maior efeito citotóxico parece depender da interação entre a célula liberadora de grânulos citotóxicos, contendo granzima, e a célula alvo, em uma sinapse imunológica conhecida como “beijo da morte” (Richter et al., 2009; Sobottka et al., 2009).
A entrada das granzimas no citoplasma da célula alvo, em geral, ocorre na presença de perforinas. As perforinas são proteínas que compartilham homologia com o CAM do sistema complemento, e de forma semelhante, criam poros na membrana plasmática da célula alvo. Durante algum tempo acreditou-se que o transporte das granzimas do meio extra para o meio intracelular ocorria através destes poros. Keefe e colaboradores (2005), no entanto, demonstraram através de microscopia confocal que as perforinas geram aumento no influxo de cálcio na célula alvo e provavelmente esse desequilíbrio osmo-eletrolítico alteraria a permeabilidade da membrana plasmática, permitindo a entrada das granzimas mais rapidamente para o interior do citoplasma.
Em humanos são descritas cinco formas diferentes de granzimas: A (GrA), B (GrB), H (GrH), K (GrK) e M (GrM), sendo que todas constituem serinas proteases.
A GrB é uma proteína de 32 kDa, e constitui o membro mais estudado da família das granzimas. Esta serina protease é um dos componentes mais abundantes nos grânulos
citotóxicos de linfócitos T e células NK (Lord et al., 2003, Jahrsdorfer et al., 2010), e induz a morte das células alvo, sobretudo, pela degradação da caspase-3 gerando resíduos de ácido aspártico (Hagn & Jahrsdörfer, 2012).
A GrA e GrH induzem a morte da célula alvo através de mecanismos semelhantes aos da apoptose (Shresta et al., 1999; Fellows et al., 2007). Dentro da matriz mitocondrial a GrA é capaz de clivar componentes da cadeia respiratória, causando a liberação do citocromo c e formação de ânion superóxido (Martinvalet et al., 2005). Paralelamente, no núcleo, a GrA degrada a histona H1, o que torna a cromatina mais suscetível à ação de nucleases, culminando o processo de morte celular (Zhang et al., 2001). De forma semelhante à fragmentação do material genético causado pela GrA, a GrK também parece compartilhar funções catalíticas com a GrB (Zhao et al., 2007).
Acredita-se que a GrH, encontrada em células NK, esteja relacionada à resposta inata contra células infectadas por antígenos virais (Choudhury & Lieberman, 2009). Neste mesmo sentido também a GrM, presente nas células NK e linfócitos T γδ, parece ter função em mecanismos da imunidade inata (Sayers et al., 2001; Pao et al., 2005), além de possivelmente colaborar para a efetividade da GrB, degradando seus inibidores (Mahrus et al., 2004).
Recentemente a produção de GrB foi descrita em populações não-clássicas, como em: linfócitos B (Jahrsdorfer et al., 2006; Hagn et al., 2009), pDCs (Rissoan et al., 2002, Vermi et al., 2005), linfócitos T CD4+ (Zaguia et al., 2013), progenitores hematopoiéticos (Berthou et al., 1995), basófilos (Tschopp et al., 2006), mastócios (Strik et al., 2007), monócitos ativados (Korthals et al., 2007), neutrófilos (Wagner et al., 2004), condrócitos (Horiuchi et al., 2003), células de Sertoli, espermatócitos e células sinciciais do trofoblasto (Hirst et al., 2001), além de diversas linhagens tumorais (Hu et al., 2003; D’Eliseo et al., 2010). Curiosamente, na maioria das células com capacidade de expressão de GrB, verificou-se ao mesmo tempo a expressão da proteinase inibidora-9 (PI-9) (Bladergroen et al., 2001; Hirst et al., 2003; Phillips et al., 2004). A PI-9 é uma serpina induzida por citocinas pró-inflamatórias como IFN-γ e IL-1β que impede a ação pró-apoptótica autócrina da GrB (Sun et al., 1996). Interessantemente ainda, a expressão de PI-9 parece ser aumentada em certos tipos de
tumores, na presença do fator indutor de hipóxia-1 (HIF-1) (Holmquist-Mengelbier et al., 2006), constituindo um mecanismo de escape à resposta imunológica mediada pela GrB (Medema et al., 2001).
Jahrsdörfer e colaboradores (2006) mostraram que células B presentes na leucemia linfocítica crônica adquiriam a capacidade de secretar granzimas, idealmente, após a estimulação com anticorpo para o receptor de células B (anticorpo anti-BCR) ou CpG oligodeoxinucleotídeos (CpG ODN) combinados com IL-21. Esta estimulação promovia a liberação de granzimas e a apoptose bystander das células alvo presentes na doença. Posteriormente, o mesmo grupo apresentaria a correlação encontrada entre os níveis séricos de IL-21 e de granzimas liberadas pelas células B CD5+ em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (Hagn et al., 2010).
Linfócitos T CD8+ contendo grânulos citotóxicos foram descritos danificando axônios desmielinizados em lesões ativas da EM (Booss et al., 1983; Gay et al., 1997; Neumann et al., 2001; Skulina et al., 2004). Os linfócitos T CD8+, in vitro, são capazes de produzir sobrenadante contendo granzima B (GrB), que por sua vez, tem propriedades neurotóxicas (Wang et al., 2006). Neste caso, a morte neuronal ocorre porque os neurônios expressam o receptor de manose-6-fosfato (M6PR), responsável pela internalização das GrB, o que os torna especialmente vulneráveis à ação desta protease (Motyka et al., 2000; Kar et al., 2006). Ainda, foi demonstrado que o bloqueio do M6PR é capaz de prevenir a morte neuronal pela GrB tanto na EAE quanto na EM (Haile et al., 2011; Haile et al., 2015).
Estudos prévios demonstraram um pior prognóstico para as funções cognitivas na EMSP, e recentemente sugeriu-se que também a neurodegeneração poderia ser explicada pela resposta inflamatória. Justifica-se que, apesar do reestabelecimento da barreira hemato-encefálica, na forma EMSP, o processo inflamatório seria consequência da presença de agregados linfocitários ectópicos formados nas meninges destes pacientes. Interessantemente, estes nichos ectópicos contendo centros germinativos estão bem reduzidos nas meninges de pacientes EMPP (Serafini et al., 2004; Magliozzi et al., 2010).
Ainda, em estudo recente, verificou-se que em 40% dos pacientes EMSP biopsiados, havia denso infiltrado perivascular contendo linfócitos B e plasmócitos infectados pelo vírus Epstein-Barr (EBV) em lesões corticais e também nas meninges. Nestes pacientes observou-se que linfócitos T CD8+, preobservou-sentes nas lesões corticais, liberaram perforinas e GrB para eliminar as células infectadas pelo EBV (Magliozzi et al., 2013). Estes achados sugerem que a resposta imunológica ao EBV pode contribuir para o processo fisiopatológico da EM também através do mecanismo de citotoxicidade (Aloisi et al., 2010).
Recentemente, Ireland e colaboradores (2014) descreveram menor responsividade de linfócitos B ao estímulo do CD40L em portadores de EM tratados com AG. Nestes pacientes, isto poderia significar o aumento do fenótipo CD19+ expressando GrB, que parece acontecer na presença de IL-21 e ausência de CD40L, enquanto a diferenciação em plasmócitos parece depender simultaneamente da IL-21 e CD40L (Hagn et al., 2012).
Em 2010, demonstrou-se que a produção de GrB enzimaticamente ativa por pDCs (Jahrsdorfer et al., 2010) era capaz de reduzir a proliferação de linfócitos T. Isto sugeriria o papel possivelmente tolerogênico da GrB liberada pelas pDCs, em um mecanismo desejável no contexto da autoimunidade.
Por outro lado, outras evidências mostram maior expressão de GrB em linfócitos Th17, que produzem simultaneamente IL-17 e IL-22, em portadores de EM (Kebir et al., 2007), corroborando o possível papel patogênico destas proteases no contexto da doença.
Tratamento na Esclerose Múltipla
Tendo em vista das lesões de natureza primordialmente inflamatórias presentes nas formas CIS e EMRR, tem se buscado estratégias para o tratamento com drogas anti-inflamatórias e/ou imunomoduladoras nestas etapas da doença (Wiendl e Hohlfeld, 2009). Enquanto os pacientes são tratados preferencialmente com imunossupressores durante os surtos (Pithadia et al., 2009), as terapias de primeira linha para as formas CIS e EMRR
incluem o uso de imunomoduladores como o interferon- β (IFN-β) e o acetato de glatirâmer (AG) (Goodin et al., 2002).
Aprovado em 23 de julho de 1993 para o tratamento da EMRR, o IFN-β1b subcutâneo foi o primeiro imunomodulador, ou droga modificadora de doença, utilizada na tentativa de se impedir a progressão da EM, que até então, historicamente, era tratada apenas sintomaticamente (Ransohoff et al., 2015).
O efeito benéfico do tratamento com o IFN-β pode ser explicado, pelo menos em parte, pela diminuição na expressão do MHC de clase II em APCs, como também, pela ação desta citocina estimulando a produção de IL-10, através do perfil Th2, inibindo a resposta pró-inflamatória dos linfocitos Th1 e Th17, tanto na EAE quanto na EM (Prinz et al., 2008; Durelli et al., 2009). Diversos estudos tem demonstrado a eficácia do uso do IFN-β na redução da taxa de conversão de CIS para EMRR, bem como no número de lesões Gd+ em pacientes EMRR, além da diminuição da taxa anual de surtos, nos pacientes tratados (Comi et al., 2001; Kappos et al., 2006; Comi et al., 2013). Estudo recente demonstrou ainda que cerca de 60% dos pacientes EMSP em uso de IFN-β possuem o transcriptoma, em PBMCs, semelhante ao dos pacientes EMRR também tratados com IFN-β (Gurevich et al., 2015), sugerindo que a resposta aos imunomoduladores talvez ocorra em alguma parcela dos pacientes com formas progressivas da EM, ainda que a inflamação não pareça ocupar papel central nestas etapas.
Ainda, alguns estudos associaram o uso do IFN-β a imunossupressores, como o metotrexato, como uma possível terapia combinada. O metotrexato associado ao uso de IFN-β parece ser mais efetivo na redução do número de lesões Gd+, em pacientes EMRR, do que se comparado ao IFN-β como terapia única (Calabresi, 2002). Pacientes EMRR, em uso exclusivo do metotrexato, possuem também redução no número de surtos, entretanto, o uso desta única terapia não parece ser efetivo nas formas progressivas da EM (Neumann & Ziegler, 1972; Currier et al., 1993; Goodkin, 1996).
Em alternativa ao uso do IFN-β, o AG é outra opção, sobretudo, para o tratamento das formas CIS e EMRR. Licenciado para o tratamento da forma EMRR em 1997, o AG é um polímero sintético composto pelos peptídeos L-alanina, L-lisina, L-tirosina, L-ácido
glutâmico, e provavelmente constitui a terapia mais segura para o tratamento da EM (Johnson, 2012). Dados obtidos a partir da MRI demonstram redução no acúmulo de lesões Gd+ (Comi et al., 2001), bem como redução na taxa de conversão de CIS para EMRR em pacientes tratados com AG (Comi et al., 2013).
Descoberto inicialmente com efeitos supressores na EAE, o principal mecanismo de ação do AG seria a capacidade de ativar uma população de células T CD4+ não responsiva aos antígenos da mielina. Foi demonstrado que o AG ocupa a posição do MBP (Teitelbaum et al., 1988), MOG (Ben-Nun et al., 1996) e PLP (Teitelbaum et al., 1996) no MHC de classe II, inibindo assim o reconhecimento destas estruturas pelos linfócitos autorreativos e, possivelmente, criando uma população Th2 reativa ao fármaco (Aharoni et al., 2000).
Sugere-se que, nos pacientes em uso do AG, uma população de linfócitos Th2 reativa ao fármaco apareça após cerca de 1 mês de tratamento e permaneça até um período superior a 9 anos (Chen et al., 2002). Curiosamente, acredita-se ainda que o AG promova aumento na população de linfócitos T CD8+, mas que estas células, nos pacientes tratados, teriam papel imunoregulatório sobre os linfócitos autorreativos, através da liberação de IFN-γ, tanto no SNC quanto na periferia (Hafler et al., 2002; Karandikar et al., 2002). Também, o AG poderia trazer benefícios aos pacientes com EM por meio do estímulo à liberação do fator neurotrófico cerebral (BDNF) (Ziemssen et al., 2002), promovendo reparo da bainha de mielina e maior sobrevivência neuronal (Bergamaschi, 2003).
Na última década novas drogas surgiram como alternativa ao uso do IFN-β e do AG, até hoje considerados como imunomoduladores clássicos utilizados na primeira linha de tratamento.
Em 2004, o Natalizumab (NTZ), um anticorpo monoclonal humanizado, foi aprovado como terapia para a forma EMRR, demonstrando maior eficácia tanto na redução da taxa de surtos quanto no acúmulo de lesões Gd+, quando comparado às terapias tradicionais (Polman et al., 2006). O NTZ visa o bloqueio das α4β1 e α4β7 integrinas dos linfócitos com os receptores endoteliais impedindo, assim, a migração de linfócitos T (Kivisäkk et al., 2009), linfócitos B (Krumbholz et al., 2008) e células NK (Skarica et al., 2011) para o SNC.
O NTZ parece modular a resposta imunológica dos pacientes com EMRR, o que poderia representar mais um ganho no controle da doença (Niino et al., 2006). Mellegärd e colaboradores (2013), por exemplo, descreveram o aumento da população de células NK citotóxicas (CD3-CD56dim) concomitante à diminuição de células NK reguladoras (CD3
-CD56bright) no sangue periférico de pacientes EMRR em uso de NTZ.
Recentemente, o Fingolimod (FTY720) foi proposto como terapia oral para a forma EMRR (Brinkmann, 2009; Cohen et al., 2010). Depois de fosforilado, o FTY720 atua como antagonista funcional dos receptores de esfingosina-1-fostato (S1PR) presentes em linfócitos T e B (Brinkmann et al., 2002), impedindo que células autorreativas destas populações saiam de órgãos linfóides secundários para a circulação (Matloubian et al., 2004). Interessantemente, o FTY720 parece promover, no entanto, maior migração de linfócitos B produtores de IL-10 para o SNC, melhorando o prognóstico da EM (Grutzke et al., 2010). Entretanto, poucos estudos sobre as possíveis funções imunoreguladoras do FTY720 foram descritas até o momento (Kowarik et al., 2011).
Outras abordagens terapêuticas para a EM se baseiam, ainda, na hipótese do efeito danoso dos linfócitos B para a doença. Os anticorpos anti-CD20, como rituximab, ocrelizumab e ofatumumab depletam os linfócitos B circulantes e com isso, parecem diminuir a atividade da doença (Hauser et al., 2008; Kappos et al., 2011; Sorensen et al., 2014). Contudo, há necessidade de maiores estudos sobre as funções desempenhadas pelos linfócitos B no curso das diferentes formas da EM.
Em vista deste panorama complexo, e ainda controverso, foi nosso objetivo neste trabalho, investigar a produção de GrB pelas populações de linfócitos T CD4+ e CD8+, linfócitos B e pDCs no sangue periférico de pacientes com EM, em suas diferentes formas.
Identificar os linfócitos B e células dendríticas plasmocitóides (pDCs) citotóxicos isolados do sangue periférico de pacientes com EM.
Objetivos secundários:
1. Identificar a expressão de granzima B (GrB) intracelular nos linfócitos B, linfócitos T CD4+ e T CD8+ no sangue periférico de pacientes com EM.
2. Identificar a expressão de granzima B (GrB) intracelular nos linfócitos B, linfócitos T CD4+ e T CD8+ no líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com EM.
Pacientes: Foram incluídos neste estudo portadores de EMRR e EMSP, ambos, atendidos no Ambulatório de Neurologia do Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). A maioria dos pacientes é residente na cidade de Campinas ou em municípios vizinhos do Estado de São Paulo.
Critérios de Inclusão: Tanto a coleta de material dos indivíduos saudáveis para o grupo controle, como dos pacientes com EM, ocorreu após concordância de cada participante, tendo assinado uma cópia do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) proposto para este trabalho. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade de Ciências Médicas desta instituição (FCM-UNICAMP), registrada sob o número CAAE: 53022516.3.0000.5404.
Critérios de Exclusão: Foram excluídos da pesquisa indivíduos que:
1. Possuíam histórico de malignidades ou eram portadores de doenças infecto-contagiosas ou invasivas;
2. Não se enquadravam nos critérios estabelecidos por McDonald revisados (Polman et al., 2005), portanto, com diagnóstico de EM não claramente definido.
Coleta de pacientes e indivíduos saudáveis: Durante os anos de 2014-2015, foram recrutados 38 pacientes com EM e 40 indivíduos saudáveis para realização deste estudo.
Características clínicas: Os achados clínicos, como índice de EDSS, tempo de doença, tipo de tratamento e presença de BOC, para os indivíduos EMRR e EMSP, foram coletados dos prontuários de cada paciente e estão reunidos nas Tabelas 1 e 2.
Tabela 1: Sumário dos achados clínicos dos grupos de pacientes EMRR e controle estudados.
Coleta de sangue e LCR: As amostras foram obtidas durante o acompanhamento ambulatorial dos pacientes para exclusão de outras possíveis doenças. Quando os pacientes foram submetidos à coleta de soro e LCR para investigação da presença de BOC, por exemplo, uma alíquota destes materiais foi reservada para o nosso estudo. Assim, obtivemos: soro e sobrenadante do LCR para a realização do método ELISA; além de células do LCR e sangue periférico, ambos, para citometria de fluxo. As amostras de soro e LCR foram armazenadas em tubos de polipropileno, à -80ºC, para preservação até a realização do teste ELISA.
ELISA para GrB: A GrB presente no soro dos pacientes EMRR, EMSP e indivíduos do grupo controle foi investigada pelo método ELISA com o kit Abcam® (ab46142) (Abcam, Cambridge, UK). Segundo o protocolo do fabricante, 100 microlitros das amostras e das soluções para construção da curva padrão foram incubadas microplacas (Immulon I, Nunc, Roskilde, Denmark) com 50 microlitros do anticorpo anti – GrB marcado com biotina. Após 3 horas de incubação e lavagens, foi adicionado, em cada well, 100 microlitros de solução padronizada de estreptavidina-peroxidase (Sigma Chem, USA), associada à solução reveladora com substrato. Após 30 minutos e novas lavagens adicionou-se 100 microlitros do cromógeno, e após 10-20 minutos ao abrigo da luz, adicionou-se 100 microlitros da solução de parada que interrompeu a reação. As microplacas foram lidas em leitor de ELISA (Labsystem) a 492 nm. As concentrações finais foram obtidas em picogramas/mL.
Separação dos linfócitos: Uma alíquota do sangue total dos pacientes EMRR, EMSP e dos
indivíduos saudáveis foi separada para a realização da citometria de fluxo. Posteriormente, no restante das amostras foi realizada separação das PBMCs por gradiente de Ficoll-hypaque®. Após contagem das PBMCs obtidas, através da câmara de Neubeur, foi possível ajustar a concentração celular para o isolamento de linfócitos B ou pDCs.
Isolamento dos linfócitos B: As PBMCs separadas de acordo com o item anterior foram incubadas por 30 minutos com o mix do kit The EasySep® Human B Cell Enrichment, que isola linfócitos B por seleção negativa. As células não desejadas são marcadas com Complexos Tetraméricos de Anticorpo que reconhecem células não-linfócitos B e os beads
magnéticos. Utilizando o magneto EasySep®, as células não desejadas ficam retidas na parede do tubo por ação do campo magnético, enquanto as células B puderam ser coletadas em outro tubo.
Estimulação de linfócitos B para o fenótipo produtor de GrB: Após o isolamento, os linfócitos B foram colocados em meio de cultura (RPMI-1640 Sigma Aldrich, MO, USA) enriquecido com 10% de soro humano AB, antibióticos e glutamina. Durante 16-24h em cultura, foi realizado estímulo com CPG-ODN (5 µg/mL), IL-21 (100 ng/mL) e LPS (50 ng/mL (Jahrsdörfer et al., 2006; Hagn et al., 2014), segundo a literatura, para investigação da expressão de GrB. Após o período em cultura, os sobrenadantes foram armazenados à -80ºC, e as células foram marcadas para investigação do perfil CD19+ GrB+ através da citometria de fluxo.
Isolamento de pDCs: De maneira semelhante à obtenção linfócitos B, o isolamento de pDCs ocorreu a partir da incubação de PBMCs, obtidos do sangue periférico por gradiente de Ficoll-hypaque®, com o mix do kit The EasySep® Human pDC Cell Enrichment. A seleção negativa permite a obtenção das pDCs e retenção das células não-pDCs no interior do tubo submetido ao magneto EasySep®.
Estimulação de pDCs para o fenótipo produtor de GrB: Após o isolamento, as pDCs foram também colocadas em meio de cultura (RPMI-1640 Sigma Aldrich, MO, USA) enriquecido com 10% de soro humano AB, antibióticos e glutamina. Durante 16-24h em cultura, foi realizado estímulo com CPG-ODN (5 µg/mL) e IL-21 (100 ng/mL) (Jahrsdörfer et al., 2010), segundo a literatura, para investigação da expressão de GrB. Após o período em cultura, os sobrenadantes foram armazenados à -80ºC, e as células foram marcadas para investigação do perfil BDCA-2+ GrB+ através da citometria de fluxo.
Estimulação de linfócitos no LCR para o fenótipo produtor de GrB: Após centrifugação a 800 rpm, por 10 minutos, o precipitado contendo as células do LCR foi ressuspendido em meio de cultura (RPMI-1640 Sigma Aldrich, MO, USA) enriquecido com 10% de soro humano AB, antibióticos e glutamina. Durante 16-24h em cultura, foi realizado estímulo com
