RESULTADOS
Classicamente, o aumento na população de linfócitos T CD8+ (Jacobsen et al., 2002; Skulina et al., 2004) é considerado como o principal responsável pela maior liberação de granzimas no SNC, resultando em dano axonal e inflamação aguda em diversas doenças (Merelli et al., 1991; Bien et al., 2002). Também, o aumento de linfócitos T CD4+ (Kivisakk et al, 2003), células dendríticas plasmocitóides (pDCs) (Longhini et al., 2011), e células B (Baranzini et al., 1999; Colombo et al., 2000; von Büdingen et al., 2010), no líquido cefalorraquiano de portadores de EM, pode sugerir a participação destas populações na produção e liberação de granzimas no parênquima do SNC, colaborando para a fisiopatologia da EM.
Quantificação da expressão de GrB em linfócitos do sangue periférico
Nesse grupo de experimentos, investigamos a expressão de GrB em linfócitos T CD8+ (Fig. 1), T CD4+ (Fig. 2), e B CD19+ (Fig. 3) no sangue periférico de pacientes EMRR e EMSP, e também no grupo controle. Pacientes com EM na forma remitente-recorrente, não tratados ou tratados com AG, foram incluídos dentro de um mesmo grupo (grupo EMRR). Essa opção se justifica por não existir aumento significativo entre a produção de GrB, pelas populações investigadas, quando analisados separadamente nos dois grupos (dados não apresentados).
Aumento da população de linfócitos T CD8+ produtores de GrB em pacientes com EM
Quando estudamos a população de linfocitos T CD8+ verificamos que houve aumento significativo na expressão de GrB nos pacientes EMRR quando comparados ao grupo controle.
[EMRR = 39,3 ± 18,78 (variação de 3,11 - 97,20); CTR = 19,2 ± 14,02 (variação de 1,34 - 50,50); EMSP = 26,2 ± 22,52 (variação de 2,17 - 69,10). Não há aumento significativo do grupo EMRR em relação ao grupo EMSP. **p<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Mann- Whitney test)].
Figura 1. Quantificação dos linfócitos T CD8+ expressando GrB.
Os linfócitos T CD8 produtores de GrB foram identificadas por citometria de fluxo. (A) A produção de GrB por linfócitos T CD8+ no sangue periférico de pacientes EMRR (sem tratamento ou tratados com AG) é significativamente maior quando comparada ao grupo controle (CTR). Não há aumento significativo do grupo EMRR em relação ao grupo EMSP.
(B) Uma amostra representativa da estratégia de gate é apresentada para os indivíduos de cada
um dos grupos EMRR, CTR e EMSP.
Aumento da população de linfócitos T CD4+ produtores de GrB em pacientes com EM
Os linfócitos T CD4+ não são considerados citotóxicos de uma forma geral. No entanto, em condições patológicas pode-se observar a produção de GrB por essas células.
Esse grupo de experimentos foi feito no sentido de investigar se os linfócitos T CD4+ de pacientes com EM nas formas EMRR e EMSP expressam GrB. Os resultados são apresentados na Figura 2.
[EMRR = 2,6 ± 2,88 (variação de 0,27 - 10,6); CTR = 1,3 ± 1,35 (variação de 0,15 - 4,82); EMSP = 5,2 ± 16,87 (variação de 0,25 - 51,10). Não há aumento significativo do grupo EMRR em relação ao grupo EMSP. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Mann-Whitney test)].
Figura 2. Quantificação dos linfócitos T CD4+ expressando GrB.
Os linfócitos T CD4+ produtores de GrB foram identificados por citometria de fluxo. (A) A produção de GrB por linfócitos T CD4+ no sangue periférico de pacientes EMRR (sem tratamento ou tratados com AG) é significativamente maior quando comparada ao grupo controle (CTR). (B) Uma amostra representativa da estratégia de gate é apresentada para os indivíduos de cada um dos grupos EMRR, CTR e EMSP.
Aumento da população de linfócitos B produtores de GrB em pacientes com EM
A exemplo do que foi mostrado para os linfócitos T CD4+, os linfocitos B não são classicamente células citotóxicas. No entanto, recentemente foi demonstrado a existência de uma subpopulação de linfócitos B com função citotóxica (Jahrsdörfer et al., 2006; Hagn et al., 2014). Esse grupo de experimentos foi conduzido no sentido de investigar a existência de linfócitos B citotóxicos no sangue periférico de pacientes com EM. Os resultados apresentados na Figura 3 mostram o aumento significativo na expressão de GrB por linfócitos B CD19+ dos pacientes EMRR quanto comparados ao grupo controle (CTR) e pacientes EMSP.
[EMRR = 1,6 ± 7,81 (variação de 0,92 - 33,20; CTR = 1,0 ± 0,61 (variaçao de 0,26 - 2,56); EMSP = 1,2 ± 1,43 (variação de 0,62 - 1,73). Também, houve aumento significativo do grupo EMRR quando comparado ao grupo EMSP. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Mann- Whitney test)].
Figura 3. Quantificação por citometria de fluxo dos linfócitos B CD19+ expressando GrB.
Os linfócitos B CD19+ produtores de GrB foram identificados por citometria de fluxo. (A) A produção de GrB por linfócitos B CD19+ no sangue periférico de pacientes EMRR (sem tratamento ou tratados com AG) é significativamente maior quando comparada ao grupo
controle (CTR). (B) Uma amostra representativa da estratégia de gate é apresentada para os indivíduos de cada um dos grupos EMRR, CTR e EMSP.
Comparação entre a expressão de GrB no sangue periférico e no LCR
A Figura 4 (A) apresenta uma visão integrada das populações do sangue periférico investigadas para a expressão de GrB nos grupos EMRR, EMSP e CTR. Posteriormente (Fig. 4, B) comparamos as populações B CD19+, T CD4+ e T CD8+ para a expressão de GrB em 4 pacientes EMRR, no sangue periférico e no LCR. Embora não haja aumento significativo, parece haver uma tendência de aumento da atividade de linfócitos B CD 19+ expressando GrB no LCR se comparado ao sangue periférico dos mesmos pacientes.
Visão integrada das populações de linfócitos B CD19+ [CD 19+ PBMC = 3,9 ± 5,13 (0,95 -
13,80); CD 19+ LCR = 6,7 ± 3,95 (0,70 - 35,00)], T CD4+ [CD 4+ PBMC = 5,9 ± 2,54 (4,29
- 9,94); CD4+ LCR = 6,1 ± 1,59 (3,29 - 7,58)] e T CD8+ [CD 8+ PBMC = 43,5 ± 10,82 (31,7
- 50,9); CD8+ LCR = 24,3 ± 18,1 (4,79 - 51,20)].
Figura 4. Visão integrada das populações de linfócitos B CD19+, T CD4+ e T CD8+ expressando GrB.
(A) As populações, no sangue periférico, de linfócitos B CD19+, T CD4+ e T CD8+ dos pacientes EMRR (sem tratamento ou tratados com AG) são comparados aos pacientes EMSP e grupo controle (CTR). (B) Expressão de GrB no sangue periférico e no LCR de pacientes EMRR (grupo sem tratamento e tratados com AG).
Avaliação da produção de GrB no soro e líquido cefalorraquiano de pacientes com EM
Através do método ELISA, quantificamos a presença de GrB em amostras de soro e LCR de pacientes EMRR e EMSP, além de soro do grupo controle.
Figura 5. Quantificação por ELISA da produção de GrB (pg/mL).
Não encontramos aumento significativo, entre os diferentes grupos, nas amostras investigadas para a presença de GrB.
Expressão de GrB em linfócitos B isolados de pacientes com EM e estimulados in vitro com CpG-ODN, IL-21 e LPS
No sentido de confirmar as observações feitas utilizando o sangue total, os linfocitos B foram purificados, estimulados in vitro e o número de células produtoras de GrB foram avaliadas por citometria de fluxo. Após isolamento e estímulo de linfócitos B em cultura, conforme a metodologia descrita, avaliamos a expressão de GrB por estas células (Fig. 6). Verificamos que pacientes EMRR expressam mais GrB do que indivíduos do grupo controle.
Estímulos in vitro: CPG-ODN (5 µg/mL), IL-21 (100 ng/mL) e LPS (50 ng/mL [EMRR = 1,9
± 10,07 (variação de 0,31 - 27,00); CTR = 0,8 ± 0,50 (variação de 0,65 - 1,90). *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Mann-Whitney test)].
Figura 6. Quantificação linfócitos B CD19+ expressando GrB depois de isolados do sangue
periférico de pacientes com EM e grupo controle (CTR).
Linfócitos B purificados foram estimulados in vitro e a seguir o número de células produtoras de GrB foi avaliada por citometria de fluxo. (A) Pacientes EMRR (sem tratamento ou tratados com AG) expressam mais GrB em linfócitos B do que indivíduos do grupo controle (CTR).
(B) Uma amostra representativa da estratégia de gate é apresentada para os indivíduos de dos
grupos EMRR e CTR.
Expressão de GrB em pDCs isoladas de pacientes com EM e estimuladas in vitro com CpG- ODN e IL-21
Após isolamento e estímulo de pDCs em cultura, conforme a metodologia descrita, avaliamos a expressão de GrB por estas células (Fig.7). Verificamos que pacientes EMRR tendem a expressar mais GrB do que indivíduos do grupo controle, embora não haja diferença significativa entre os grupos.
Estímulos in vitro: CPG-ODN (5 µg/mL) e IL-21 (100 ng/mL) [EMRR = 5,0 ± 16,41 (variação de 3,52 - 46,60; CTR = 1,8 ± 2,05 (variação de 0,62 - 6,81). P=0,0755. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Mann-Whitneytest)]
Figura 7. Quantificação por citometria de fluxo de pDCs expressando GrB depois de isoladas
do sangue periférico.
(A) Pacientes EMRR (sem tratamento ou tratados com AG) tendem a expressar mais GrB em
pDCs do que indivíduos do grupo controle. (B) Uma amostra representativa da estratégia de
gate é apresentada para os indivíduos de dos grupos EMRR e CTR.
Quantificação da expressão de GrB em sobrenadantes de linfócitos B e pDCs isolados e estimulados
Após isolamento e estímulo de linfócitos B e pDCs em cultura, conforme a metodologia descrita, coletamos os sobrenadantes e avaliamos a expressão de GrB por meio do método CBA (Fig.8). Verificamos que os sobrenadantes de linfócitos B de pacientes EMRR tendem a conter mais GrB do que nos indivíduos do grupo controle, embora não haja
diferença significativa entre os grupos. De maneira semelhante, a quantidade de GrB encontrada nos sobrenadantes de pDCs de pacientes EMRR é significativamente maior do que aquela encontrada nos sobrenadantes do grupo controle.
Estímulos in vitro: Cultura de linfócitos B: CPG-ODN (5 µg/mL), IL-21 (100 ng/mL) e LPS (50 ng/mL). Cultura de pDCs: CPG-ODN (5 µg/mL) e IL-21 (100 ng/mL).
Sobrenadante de linfócitos B [EMRR = 122,4 ± 954,38 (variação de 0,00 - 2528,97); CTR = 0,0 ± 13,60 (variação de 0,00 - 29,20). P=0,0922. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Mann- Whitney test)].
Sobrenadante de pDCs [EMRR = 463,0 ± 2765,8 (variação de 87,5 - 8779,7); CTR = 40,3 ± 88,21 (variação de 0,00 - 275,75). *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Mann-Whitney test)].
Figura 8. Quantificação de GrB nos sobrenadantes de linfocitos B e pDCs purificados de
pacientes com EM e grupo controle, após estimulação in vitro.
Após purificação e estimulação de linfocitos B [CPG-ODN (5 µg/mL), IL-21 (100 ng/mL) e LPS (50 ng/mL] e pDCs [CPG-ODN (5 µg/mL) e IL-21 (100 ng/mL)] os sobrenadantes das culturas foram testados para a presença de GrB pelo método CBA. (A) Linfócitos B CD19+
tendem a expressar mais GrB, depois de isolados e estimulados, em pacientes EMRR (sem tratamento ou tratados com AG) do que no grupo controle. (B) pDCs expressam significativamente mais GrB, depois de isoladas e estimuladas, em pacientes EMRR (sem tratamento ou tratados com AG) do que no grupo controle
DISCUSSÃO
Nesse estudo avaliamos a produção de GrB nas populações CD8+, CD4+, CD19+, e também pelas pDCs no sangue periférico de pacientes com EM, comparados a indivíduos saudáveis, como grupo controle (CTR). Quando analisamos separadamente os pacientes com a forma remitente-recorrente da EM, sem tratamento e tratados com AG, não observamos diferença significativa entre as produções CD8+, CD4+ e CD19+ expressando GrB, nos dois grupos (dados não apresentados). Este achado nos permitiu agrupar os resultados obtidos, para os grupos sem tratamento e tratado com AG, dentro de um único grupo denominado “EMRR”. Esses resultados sugerem que o AG não interfere nos mecanismos de citotoxicidade dos indivíduos tratados com o fármaco.
A literatura mostra a presença de linfócitos T CD8+ no LCR (Jacobsen et al., 2002) e nas lesões ativas da EM (Cabarrocas et al., 2003; Skulina et al., 2004; Lucchinetti et al., 2011), sugerindo a participação destas células na ocorrência de desmielinização e de surtos (Malmeström et al., 2008). Lucchinetti e colaboradores (2011), inclusive, mostram a presença de linfócitos T CD8+ nas áreas de desmielinização da substância cinzenta, em biópsia de pacientes com EM na fase inicial da doença (CIS). Esses resultados enfatizam a importância dessas células no dano tecidual do sistema nervoso, nos pacientes com EM. Os linfócitos T CD8+, assim como as células NK, possuem importante função citotóxica e produzem GrB constitutivamente. Essas granzimas são proteases e estão associadas principalmente ao dano tecidual em diferentes doenças.
Nossos resultados mostraram aumento significativo de GrB nos linfocitos T CD8+, T CD4+ e B de pacientes com EM quando comparado com indivíduos saudáveis. Takahashi e
colaboradores (2009) mostraram aumento nos níveis de GrB no LCR de pacientes com síndrome de Rasmussen quando comparados com indivíduos saudáveis. E, de maneira semelhante, um estudo com portadores de EM verificou aumento na atividade citotóxica de linfócitos T CD8+ no líquido cefalorraquiano de pacientes em surto, com a forma clínica EMRR, quando comparados, a indivíduos saudáveis. Foram relatados níveis aumentados de GrA e GrB no LCR, porém não no plasma, dos pacientes em surto. Os níveis de granzima permaneceram elevados também nos meses seguintes, sugerindo a participação local destas substâncias na ocorrência dos surtos (Malmeström et al., 2008). Nossos resultados estão de acordo com essas observações, uma vez que não fomos capazes de demonstrar a presença de granzimas, no soro e no LCR de pacientes com EM, quando utilizamos o teste ELISA comercial. No entanto, quando utilizamos um método mais sensível (CBA) fomos capazes de detectar níveis consideráveis de GrB no sobrenadante de linfocitos B e pDCs de pacientes com EM. Quando analisamos o sobrenadante das pDCs que foram previamente estimuladas com os agonistas dos TLRs 7 e 9, verificamos que a produção de GrB estava significativamente aumentada em relação aos indivíduos normais.
Os linfócitos T CD4+ não são células citotóxicas constitutivamente, no entanto, em algumas condições patológicas, como é o caso das infecções virais e câncer, uma subpopulação de linfócitos T CD4+ passa a produzir GrB (Martorelli et al., 2010). Na EM, linfócitos T CD4+ com atividade citotóxica já foram descritos (Zaguia et al., 2013; Mazzola et al., 2015). Nosso trabalho está em acordo com esta observação uma vez que mostramos aumento significativo de linfócitos T CD4+ produtores de GrB nos pacientes com EM na fase surto-remissão da doença. O esclarecimento da exata função desta sub-população de linfócitos T CD4+ depende de estudos mais detalhados. Pode-se supor que esta população esteja promovendo o processo de desmielinização, a exemplo do que acontece com os linfócitos T CD8+. Estudo recente demonstra a redução na transcrição de IFN-γ e GrB em linfócitos T CD4+ de pacientes com EM tratados com Fingolimod (Mazzola et al., 2015), sugerindo que estas moléculas teriam função primordialmente inflamatória. De forma semelhante, outros estudos mostraram que a GrB expressa por linfócitos T CD4+ pode inibir a ação de linfócitos Treg (Bhela et al., 2015), e promover a morte de oligodendrócitos in vitro (Zaghia et al.,
2013). Ainda, foi demonstrado que o bloqueio do receptor (CD222) que permite a internalização de GrB diminui a morte de neurônios in vitro (Haile et al., 2015). Por outro lado, pode-se especular que as granzimas, possivelmente, teriam também algum envolvimento em mecanismos reguladores. A demonstração de que a GrB, além de entrar nos linfócitos T (Lindner et al., 2013), pode exteriormente clivar a cadeia ζ do TCR de linfócitos T CD4+, diminuindo a proliferação deste tipo celular (Wieckowski et al., 2002; Fabricius et al., 2013), corrobora a ideia de que estas proteases podem ter efeito benéfico no contexto da autoimunidade. Ainda, outra evidência do envolvimento benéfico das granzimas, no curso da EM, foi o aumento descrito na população de células NK reguladoras CD56bright no sangue periférico de pacientes com a forma clínica EMRR em uso de Daclizumab (Zenapax), um anticorpo monoclonal que bloqueia a cadeia IL-2Rα do receptor de IL-2 (CD25) (Bielekova, et al., 2006). Posteriormente, um estudo complementar do mesmo grupo demonstrou que estas células reguladoras NK CD56bright induzem a morte de células T ativadas através da liberação de GrA e GrK, de forma dependente de perforinas (Jiang et al., 2011).
Trabalhos prévios mostraram que os linfócitos T CD8+ têm uma função reguladora sobre as células autorreativas (Karandikar et al., 2002; Tennakoon et al., 2006). Outros autores mostram que os linfócitos T CD8+ com função supressora estariam presentes em pacientes com formas progressivas da EM (Antel et al., 1986; Bania et al., 1986). Diversos perfis de linfócitos T CD8+ com funções reguladoras têm sido descritos, entre eles: CD8+ CD28- (Crussian et al., 1995), CD8+ CD25+ FoxP3+ (Correale et al., 2010), CD8+ CXCR3+ IL-10+ (Shi et al., 2010), CD8+ CD27- CD28- CD45RO- CD62L- CD57+ (Cunnusamy et al., 2014). Estes linfócitos T CD8+ reguladores parecem necessitar do MHC de classe I para o reconhecimento de linfócitos autorreativos Th1 assim como do estímulo por IFN-γ e perforinas (Cunnusamy et al., 2014), segundo evidências obtidas na EAE (Ortega et al., 2013). Especialmente a presença do IFN-γ parece ser importante, neste contexto, uma vez que, segundo estudos recentes, esta citocina poderia promover redução na expressão de MHC de classe I em APCs (Martini et al., 2010), o que levaria à diminuição da apresentação de autoantígenos. Ainda, o IFN-γ promoveria o desenvolvimento de linfócitos T CD4+
reguladores (Wang et al., 2006) e indução da liberação de IDO por DCs (Jurgens et al., 2009), aumentando, assim, os mecanismos reguladores no contexto da doença.
Com relação aos linfócitos B, essas células também não são constitutivamente citotóxicas. Demonstramos o aumento significativo na expressão de GrB em linfócitos B CD19+ isolados de pacientes EMRR quando comparados a indivíduos saudáveis e uma tendência de aumento na expressão de GrB também foi encontrada nos sobrenadantes de cultura de linfocitos B dos pacientes EMRR quando comparados ao grupo controle. Nossas observações estão em acordo com a de Andrés e colaboradores (2014) que descreveram a produção de granzimas e perforinas pela população de células B CD19+ CD25+ FoxP+. Segundo os autores, os pacientes EMRR em surto, apresentam estes linfócitos B CD19+ CD25+ FoxP+ em maior número no LCR, do que no sangue periférico, sugerindo a capacidade migratória desta população para o SNC.
As pDCs e os linfócitos B têm em comum a expressão dos TLRs 7 e 9, e quando esses receptores são estimulados, na presença de IL-21, as subpopulações citotóxicas são ativadas. Nesse estudo, mostramos o aumento significativo da expressão de GrB nas pDCs isoladas e estimuladas in vitro dos pacientes EMRR quando comparadas aos indivíduos saudáveis. Embora as pDCs sejam conhecidas como as maiores produtoras de IFN-α (Colonna et al., 2004; Gilliet et al., 2008) e por seu papel central na defesa contra vírus e bactérias, várias evidências tem demonstrado a participação destas células na fisiopatologia de doenças autoimunes (Bennett et al., 2003; Nestle et al., 2005; Gottenberg et al., 2006).
Até onde sabemos, este trabalho é o primeiro na literatura a descrever a produção de GrB pelas pDCs na EM. Além disso, o aumento das GrB pelos linfócitos B pode explicar, pelo menos em parte, os danos no SNC nessa doença. Esses resultados podem explicar as lesões subpiais observadas em pacientes com EM que apresentam os nichos ectópicos, ou células inflamatórias na região das meninges. Esses nichos terciários são compostos principalmente pelos centros germinais de linfócitos B, sendo que as pDCs também foram observadas nesses sítios (Lande et al., 2008; Aung et al., 2010). A liberação de GrB por estas células pode explicar as lesões na região subpial, onde a neurodegeneração ocorre na ausência
do infiltrado linfocitário (Lassmann et al., 2007; Haugen et al., 2014). Reforçando essa hipótese, nossos resultados mostram a presença de linfócitos B produtores de GrB no LCR dos pacientes com EM. Embora o número de pacientes ainda seja pequeno, o fato de observarmos linfócitos B no LCR, indica a circulação dessas células dentro do SNC, e a presença de GrB corrobora a hipótese da participação destas proteases na neurodegeneração subpial observada na EM.
Nossos resultados são relevantes e atuais, pois contribuem para o entendimento da função dos linfócitos B e pDCs na EM expandindo o conhecimento para além dos mecanismos já elucidados. O entendimento do papel das granzimas na EM pode, no futuro, colaborar para o desenvolvimento de terapias que busquem o controle da doença.
O nosso estudo mostra que:
1. Linfócitos CD4+, CD8+ e CD19+ expressam significativamente mais GrB, no sangue periférico, de pacientes EMRR quando comparados a indivíduos saudáveis;
2. Não existe diferença significativa na expressão de GrB pelos linfócitos CD4+, CD8+ e CD19+, no sangue periférico, entre indivíduos com EM sem tratamento e tratados com AG. O que sugere que este imunomodulador parece não interferir nos mecanismos de citotoxicidade, ao menos, pela via da GrB;
3. Não foi detectado aumento significativo na concentração de GrB presente no soro de pacientes EMRR e EMSP, quando comparados ao grupo controle;
4. Verificamos a produção de GrB pelos linfócitos CD4+, CD8+ e CD19+ no LCR de pacientes EMRR. Embora não haja relevância estatística, e pequeno número de amostras, este achado acrescenta novas evidências sobre o envolvimento, sobretudo, dos linfócitos B na fisiopatologia central da EM.
5. Linfócitos B obtidos a partir do sangue periférico, quando isolados e estimulados, expressam significativamente mais GrB nos pacientes EMRR do que em indivíduos saudáveis.
6. pDCs possuem a capacidade de produzir GrB, quando isoladas e estimuladas, nos pacientes com EM. A expressão de GrB no sobrenadante das culturas de pDCs é significativamente maior nos pacientes EMRR quando comparada ao grupo de indivíduos saudáveis.