2.1 Coleta e preparação do extrato das folhas de Spondias mombin
As folhas de S. mombin foram coletadas em uma fazenda particular na região de Tábua em Dom Marcolino Dantas/ RN (Tabua- RN S S° 28’ 14’’ W 35° 27’ 37’’). A espécie foi identificada pelo botânico Alan de Araújo Roque, com número de exsicata 12252.
As folhas de S. mombin foram submetidas à secagem na sombra, sob temperatura ambiente durante duas semanas. Após secas, foram trituradas em um moinho de facas. O extrato foi preparado por maceração utilizando etanol: H2O (70:30), durante um período de sete dias, obtendo-se assim o extrato hidroetanólico das folhas (EH). O extrato foi filtrado e eliminado todo solvente orgânico com auxílio de um rotaevaporador à temperatura de 45° C. Para os testes biológicos o EH foi liofilizado.
2.2 Prospecção fitoquímica
Foi realizada uma triagem fitoquímica preliminar em que foram testadas as principais reações de caracterização para metabólitos secundários. Para a identificação de fenóis adicionou-se ao extrato bruto uma quantidade do agente oxidante cloreto férrico (FeCl3). Para a identificação de flavonoides foi utilizado
o teste de Shinoda. Os taninos foram caracterizados pela reação de precipitação com gelatina. Para detecção da presença de saponinas, empregou-se o teste de formação de espuma. O teste para alcaloides baseou- se em reações de formação de complexos insolúveis produzidos por reagentes específicos como: Dragendorff; Mayer; Wagner e Bertrand (Langassner e Giordani 2013).
2.3 Caracterização química por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
O E.H foi analisado por CCD utilizando como fase estacionária cromatoplacas de alumínio de sílica gel 60 GF254 e como fase móvel vários sistemas de eluentes (Wagner; Bladt, 2001). O revelador utilizado foi o Reagente Natural A (difenilboriloxietilamina 0,5% em metanol). Os cromatogramas foram visualizados sob luz UV 254 e 365 nm. Para a identificação dos compostos presentes no extrato foram utilizados padrões de referências adquiridos da Sigma Aldrich® (St. Louis, Missouri, EUA).
2.4 Linhagens microbianas
Foram utilizadas amostras de Enterococcus faecalis (ATCC 292012) e Candida albicans (ATCC 36802) da coleção de cultura do Laboratório da Universidade Estácio de Sá e Laboratório de Micologia da UFRJ (Rio de Janeiro/RJ) que foram reativadas no Laboratório de Microbiologia do Departamento de Odontologia/CCS/UFRN. As amostras de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 19429) e Staphylococcus aureus (ATCC 23235) foram obtidas obtidas mediante solicitação na Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro/RJ) e posteriormente reativadas no Laboratório de Microbiologia do Departamento de Odontologia/CCS/UFRN.
Enterococcus faecalis isolado clinicamente (AB 44) foi obtido da coleção de cultura do Laboratório de Microbiologia da UNESA (Comitê de Ética em Pesquisa CEP protocolo nº. 0248/08), coletado de pacientes de clínicas endodônticas da UFRJ e UNESA. Inicialmente, cones de papel de filtro foram
introduzidos nos canais radiculares desses pacientes. O material foi transferido para caldo Enterococcosel e incubadas durante 72 h a 35 °C. Posteriormente foram introduzidos em placas de Agar sangue e incubadas a 35 °C durante 72 h. Colônias puras foram submetidas a testes para a identificação de espécies de enterococos (coloração de Gram, morfologia da colônia, teste de catalase, crescimento em caldo de NaCl, hidrólise de arginina, utilização de piruvato, motilidade, produção de pigmentação e testes de fermentação de carboidratos. A identificação foi confirmada pela PCR utilizando iniciadores específicos de E. faecalis.
Candida albicans isolada clinicamente (AB 100) foi obtida da coleção de cultura do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da UFRN (Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes - CEP-HUOL protocolo nº. 152/07). As amostras clínicas foram coletadas de pacientes a partir de saliva estimulada e semeadas em ágar Sabouraud-dextrose. As mesmas foram identificadas através das provas do tubo germinativo, caldo hipertônico, tolerância à temperatura de 42ºC , microcultivo, assimilação de hidratos de carbono, fermentação de açúcares e PCR.
2.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A atividade antimicrobiana em placas foi realizada segundo a metodologia adaptada de Bauer et al. (1966) para a determinação da Concentração Inibitória Mínima . As linhagens microbianas foram cultivadas em caldo nutritivo (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan, Estados Unidos), incubadas a 37°C por 18-20 horas. Em placas de petri contendo Agar Mueller Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) foi introduzida solução salina inoculada com cada crescimento microbiano e foram confeccionados cinco orifícios padronizados de aproximadamente seis mm de diâmetro em cada placa. Foram introduzidos 50µL da substância teste (EB até a diluição em água destilada 1:512) nos orifícios e as placas foram incubadas a 37°C por 24 horas. Cada ensaio foi realizado em triplicata sobre cada linhagem. O mesmo procedimento foi utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina
a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA) e nistatina 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brasil).
Foi considerada CIM, a menor concentração do extrato capaz de inibir o crescimento microbiano, representado pela presença de um halo de inibição, aferido em mm com auxílio do paquímetro (Digimess®, São Paulo, Brasil).
Aos resultados obtidos no teste da Concentração Inibitória Mínima aplicou-se ao nível de 5% de significância, o teste t-Student ou de Mann Whitney (p<0,05), comparando a atividade antimicrobiana entre o extrato e os controles positivos.
2.6 Determinação da Cinética Bactericida e Fungicida
O potencial bactericida e fungicida do extrato de S. mombin foi avaliado pelo método adaptado de Peyret et al. (1990). As amostras foram inoculadas em caldo nutritivo BHI (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos), incubadas a 37º C por 18 a 20 horas e subcultivadas em Caldo Mueller Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) por 1 hora. A 9mL de cada cultura microbiana, foi adicionado 1mL do extrato (bruto e na CIM), e ao tubo controle foi adicionado 1mL de água destilada e esterilizada. Os tubos foram mantidos na estufa a 37º C por 24 horas, e alíquotas foram retiradas após 2, 4, 6, e 24 horas de incubação e semeadas em placas de petri com Agar Mueller Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Cada procedimento foi realizado em duplicata.
A leitura foi efetuada após incubação por 48 horas a 37ºC pelo método padrão de contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) nos tempos determinados.
2.7 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA)
A Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) do extrato de S. mombin foi determinada de acordo com Gerbara, Zardetto e Mayer (1996), utilizando concentrações correspondentes ao extrato bruto e diluído até 1:512. A partir do crescimento microbiano, as cepas foram subcultivadas a 37ºC em caldo Mueller-Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Foram distribuídos 1,8 mL do subcultivo em tubos de hemólise e, em seguida, adicionado 0,2mL
da solução correspondente às diluições do extrato. A leitura foi realizada após 24 horas através da observação visual da aderência dos microrganismos às paredes do tubo, após agitação do mesmo. Cada ensaio foi realizado em duplicata frente a cada linhagem selecionada. O mesmo procedimento foi utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA.) e Nistatina 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brasil).
A CIMA foi definida como a menor concentração do agente que impediu a aderência ao tubo de vidro.
2.8 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de Spondias mombin sobre fibroblastos da linhagem 3T3
Foram utilizadas fibroblastos da linhagem 3T3 cedidas pelo Laboratório de Biotecnologia de polímeros naturais (BIOPOL, Departamento de Bioquímica, UFRN).
Inicialmente as células 3T3 foram cultivadas em frascos de 75 cm2 com 7 mL meio de cultura Eagle modificado Dulbecco (DMEM) e foram divididos em 2 grupos, de acordo com o tratamento utilizado: (i) grupo controle: cultivado apenas em meio básico; (ii) grupo de Spondias mombin : cultivado em meio básico adicionado do extrato em concentrações definidas pelos testes supracitados.
A citotoxicidade do extrato foi analisada nos intervalos de 24h e 48 h depois do cultivo celular através do ensaio do MTT (avaliação da atividade mitocondrial por redução do MTT). O MTT avalia a atividade metabólica das células quantificando a redução do MTT por desidrogenases associadas ao NADPH e NADH, resultando na produção de cristais de formazam. Para isso, as células foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 × 103
células/poço. Decorrido o tempo experimental, as células foram incubadas com 100 μL de meio de cultura contendo 1mg/mL de MTT por 4 horas e, em seguida, o produto colorimétrico (formazam) foi solubilizado com 100 μL de álcool etílico absoluto. A leitura da placa foi realizada em um leitor de ELISA em um comprimento de onda de 570 nm (μQuan Biotek®, Instruments, USA).
3.Results
3.1 Reações de identificação
Na prospecção fitoquímica foram observados a presença de compostos fenólicos, flavonoides, taninos e saponinas.
3.2 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Na análise por CCD após a revelação com o Reagente Natural A, quatro bandas com coloração amarela foram observadas, indicando a presença de flavonoides, sendo ainda verificada uma banda de coloração azul, sugestiva de ácido fenólico. A análise ainda confirmou através da comparação do Fator de retenção (Rf), coloração e Co-CCD com padrões de referência a presença do ácido elágico, quercetina e canferol no EH das folhas de S. mombin.
3.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
O extrato de S. mombin apresentou atividade antimicrobiana sobre todos os micro-organismos testados e os halos de inibição variaram entre 8 e 30 mm. O extrato apresentou efeito antibacteriano até a diluição de 1:512 (CIM-0,97 mg/mL) para E. faecalis ATCC, S. aureus ATCC e P. aeruginosa ATCC; 1:32 (CIM-15,65 mg/mL) para E. faecalis AB; e ação antifúngica até a diluição 1:128 (CIM-3,90 mg/mL) para C. albicans ATCC e 1:2 (CIM-250 mg/mL) para C. albicans (AB). S. mombin apresentou desempenho médio superior à clorexidina e estatisticamente significativo até a diluição 1:512 (0,97 mg/ mL) e 1:256 (1,95 mg/mL) sobre E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC, respectivamente. E para C. albicans ATCC e S. aureus ATCC o extrato apresentou ação bacteriostática em uma maior diluição/menor concentração do que os grupos controles.
O efeito bactericida e fungicida do extrato de S. mombin foi observado sobre E. faecalis (ATCC e AB) quando o extrato se encontrava bruto nas duas primeiras horas de contato com a bactéria e .após vinte e quatro horas de contato com C. albicans (ATCC e AB).
3.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA)
O extrato de S. mombin apresentou efeito antiaderente sobre todas as bactérias testadas, com destaque para P. aeruginosa ATCC e E. faecalis (ATTC e AB) até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL). A clorexidina apresentou efeito antiaderente até a diluição 1:512 apenas para E. faecalis.
3.6 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de Spondias mombin sobre fibroblastos da linhagem 3T3
O extrato de S. mombin apresentou citotoxicidade nas concentrações testadas (250 mg/mL, 1,95 mg/mL e 0,97 mg/mL), representada pela baixa densidade óptica comparada ao grupo controle (cultivo em meio básico), indicando ausência de proliferação celular.
4. Discusson
A crescente resistência entre os micro-organismos aos medicamentos, suscitou a pesquisa por métodos alternativos para tratamento através da obtenção de drogas com menos efeitos colaterais e toxicidade.
. A etnofarmacologia associada com o estudo químico tornou-se uma ferramenta importante na bioprospecção. Muitos estudos têm associado às informações sobre o uso tradicional de plantas medicinais a fitoquímica e estudos farmacológicos para o desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos fitoterápicos (Medeiros et al., 2013).
Nesse sentido, este trabalho buscou caracterizar quimicamente e avaliar a atividade bacteriostática, fungistática, antiaderente, bactericida e fungicida do extrato de folhas de S. mombin e seu potencial efeito citotóxico.
Os resultados evidenciaram através de uma prospecção fitoquímica prévia, a presença de alguns metabólitos secundários, dentre eles: compostos fenólicos, flavonoides, taninos e saponinas, em concordância aos achados de Silva et al. (2012) e Corthout et al. (1992). Tendo em vista que diversos estudos têm comprovado a efetividade dos compostos fenólicos, flavonoides e taninos como agentes antimicrobianos e antioxidantes (Nascimento et al., 2000; Elzaawely et al., 2005; Kumar, 2013; Corthout et al., 1994), pode-se sugerir que a grande atividade antibacteriana apresentada por S. mombin deve-se à presença desses metabólitos em sua composição.
Foi constatada ainda a presença de ácido elágico e quercetina. A presença desses metabolitos no extrato de S. mombin já foi relatado por Silva et al. (2012), que acreditam que a existência dos mesmos garante ao referido extrato suas atividades antibacteriana e antioxidante. Além de possuir atividade antibacteriana (Cushnie; Lamb, 2005), a literatura relata que a quercetina exibe atividade antioxidante, atividade de proteção do DNA (Undeger et al., 2004) e efeito anti-humoral (Ren et al., 2003), enquanto que o ácido elágico apresenta atividades antioxidante (Hassoun et al.,1997, 2004; Hayes et al., 2010), anticancro (Whitley et al., 2003), antimutagênica (Loarca-Piña et al., 1998) e antiproliferativa (Seeram et al., 2005).
Uma vez identificados metabólitos secundários com atividade antimicrobiana já conhecida, foi avaliada in vitro a atividade antibacteriana e antifúngica do extrato.
S. mombin apresentou desempenho médio superior à clorexidina e estatisticamente significativo (p 0,001) até a diluição 1:512 (0,97 mg/ mL) e 1:256 (1,95 mg/mL) sobre E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC, respectivamente.
Embora Silva et al. (2012) não tenham encontrado atividade antimicrobiana no extrato de S. mombin sobre P. aeruginosa, Sethi, Ramasamy (2012) e Abo et al. (1999) a encontraram, corroborando assim os resultados deste estudo, que comprovaram a atividade do extrato de S. mombin sobre essa bactéria.
De um modo geral, as cepas isoladas clinicamente apresentaram menos susceptibilidade ao extrato quando comparadas com as ATCC, que possuem perfil conhecido. Entretanto, para se avaliar a atividade antimicrobiana de um
novo produto se faz necessário a inclusão de cepas de origem clínica, pois apresentam diferentes perfis de susceptibilidade, assegurando maior fidelidade na avaliação.
S. mombin apresentou ação bactericida sobre E. faecalis (ATCC e AB) e C. albicans (ATCC e AB) e ação antiaderente sobre todas as bactérias testadas, com destaque para P. aeruginosa ATCC e E. faecalis (ATTC e AB) até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL), confirmando a expressiva atividade antimicrobiana do extrato sobre micro-organismos superinfectantes do ambiente bucal.
No que diz respeito à citotoxicidade, as celulas 3T3 são comumente utilizadas para se avaliar a toxicidade de compostos. Os dados mostraram que através desse método e nas concentrações testadas, o extrato apresentou citotoxicidade, uma vez que a densidade óptica obtida foi inferior ao do controle positivo. Quando o extrato se encontrava na concentração de 250 mg/mL, o valor da densidade óptica foi similar ao grupo controle. Entretanto, essa leitura não representa um aumento na proliferação celular, uma vez que antes de introduzir o MTT, as células apresentavam morfologia diferente. Pode-se aventar que provavelmente houve alguma reação do MTT com o corante da amostra.
No trabalho realizado por Cabral et al (2016), foi observado que o extrato hidroetanólico das folhas de S. mombin não apresentaram toxicidade. Foi observado, inclusive, um aumento no metabolismo mitocondrial dos fibroblastos 3T3, com uma proliferacao de 25 -100% a mais que o controle, podendo inferir que essa amostra possue atividade mitogênica, contrariando o nosso estudo.
Na literatura não há outros relatos de viabilidade celular com fibroblastos 3T3 para a espécie S. mombin. Devido a esses resultados referentes à toxicidade contraditórios, outros testes tais quais como o de citoxicidade em hemácias e de índice de seletividade (indica quantas vezes o produto testado é mais eficaz frente a determinados alvos do que a células humanas) podem ser indicados para nosso objetivo e futura aplicabilidade clínica em canais radiculares e sítios periodontais e perimplantares.
Os resultados dessa pesquisa demonstraram que S. mombin apresentou expressiva atividade bacteriostática, fungistática, antiaderente, bactericida e
fungicida sobre todos os micro-organismos associados a infecções persistentes, justificado pelos achados farmacológicos. O extrato apresentou citotoxicidade sendo necessários outros testes que o avaliem seletivamente permitindo a extrapolação para o uso clínico odontológico.
Conflict of interests
The authors declare no conflicts of interests.
Acknowledgment
No financial support was received during the current study.
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5.3 O artigo “Phytochemical screening, cytotoxicity and antibacterial action of Lycium barbarum L. on microorganisms involved in persistent oral infections” será enviado para o periódico “Journal of Ethnopharmacology” que possui fator de impacto 3.055 e Qualis A1 da CAPES para a área Medicina II.
Phytochemical screening, cytotoxicity and antibacterial action of Lycium barbarum L. on microorganisms involved in persistent oral infections
Maria Regina Macêdo-Costaa*, Isabelle Helena Gurgel de Carvalhoa, Manoel André de Souza Netob, Julia Morais Fernandesb, Silvana Maria Zucolotto Langassnerb, Kenio Costa de Limaa
a Department of Dentistry of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Av.