Caracterização química, citotoxicidade e ação antimicrobiana de extratos vegetais sobre micro-organismos superinfectantes do meio ambiente bucal

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, CITOTOXICIDADE E AÇÃO ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS VEGETAIS SOBRE MICRO-ORGANISMOS SUPERINFECTANTES DO MEIO AMBIENTE BUCAL. MARIA REGINA MACEDO COSTA. NATAL/RN 2016.

(2) Maria Regina Macedo Costa. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, CITOTOXICIDADE E AÇÃO ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS VEGETAIS SOBRE MICRO-ORGANISMOS SUPERINFECTANTES DO MEIO AMBIENTE BUCAL. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde Orientador: Kenio Costa de Lima. NATAL/RN 2016.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS Costa, Maria Regina Macedo. Caracterização química, citotoxicidade e ação antimicrobiana de extratos vegetais sobre micro-organismos superinfectantes do meio ambiente bucal / Maria Regina Macedo Costa. - 2016. 153f.: il. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2016. Orientador: Prof. Dr. Kenio Costa de Lima. 1. Microbiologia - Tese. 2. Fitoterapia - Tese. 3. Cromatografia em Camada Delgada - Tese. 4. Toxicidade - Tese. I. Lima, Kenio Costa de. II. Título. RN/UF/BSCCS. CDU 615.011. iii ii.

(4) MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito. iii.

(5) Maria Regina Macedo Costa. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, CITOTOXICIDADE E AÇÃO ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS VEGETAIS SOBRE MICRO-ORGANISMOS SUPERINFECTANTES DO MEIO AMBIENTE BUCAL. Aprovada em: __/__/____. Banca examinadora:. Presidente da Banca: Prof. Dr. Kenio Costa de Lima. Membros da Banca: ________________________________________ Prof. Dr. Kenio Costa de Lima ________________________________________ Profa. Dra. Aurigena Antunes de Araújo ________________________________________ Profa. Dra. Ruthineia Diógenes Alves Uchoa Lins ________________________________________ Profa. Dra. Jozinete Vieira Pereira ________________________________________ Profa. Dra. Edja Maria Melo de Brito Costa. MEMBROS SUPLENTES ________________________________________ Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves ________________________________________ Prof. Dr. Fábio Roberto Dametto ________________________________________ Profa. Dra. Ana Carolina Lyra de Albuquerque ________________________________________ Profa. Dra. Francinalva Dantas de Medeiros. iv.

(6) DEDICATÓRIA. A Deus, Senhor e Salvador da minha vida, que conhece cada um dos meus sonhos Quer deitada ou quer andando Sabe todos os meus passos E antes que haja em mim palavras em tudo me conhece “Porque Dele por Ele e para Ele são todas as coisas. Glória, pois, a Ele eternamente” Romanos 11:36. Aos meus pais, José Macêdo Costa e Rejane Costa Macêdo, graduados em paciência, especialistas em amor incondicional, mestres em doação e doutores na arte de encurtar a distância entre o sonho e a vida sonhada. Não há vida de fé que não te coloque em provas durante a jornada...mas não há provas que não nos tenhamos vestidos da Graça. VOCÊS SÃO O MELHOR DE DEUS PARA MIM. Eduardo Roberto de Lucena... Deus mudou o teu caminho até juntares ao meu e guardou tua vida, separando-a para mim. Para onde tu fores, irei; onde tu repousares, repousarei.... v.

(7) AGRADECIMENTOS. Ao Prof. Dr. Kênio Costa de Lima, o orientador, amigo e anjo. Antes de conhecê-lo eu achava que sabia que professora eu gostaria de ser...mas através do seu exemplo e excelência pude compreender o educador que todo aluno merece ter. E diariamente, nosso conviver, me faz convicta de que a docência e a responsabilidade acadêmica dependem da aplicação dos nossos dons... No tempo, no espaço, mas sobretudo no interior da alma...alheia. Que Deus me permita sempre o honrar. Professor, depois de pai, é o nome mais nobre e doce que um homem pode dar a outro. És único para mim. Às Profa. Dra. Maria do Socorro Vieira Pereira e Profa. Dra. Andressa Feitosa Bezerra de Oliveira por me iniciarem no Programa Voluntário de Iniciação Científica e Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica desde o segundo período da minha graduação, me permitindo iniciar a pesquisa e compartilhando o vasto conhecimento. Muito obrigada por sempre enxergarem em mim uma docente em potencial, por inúmeras oportunidades, amizade e imensa generosidade.. Ao Prof Dr. Fábio Correia Sampaio e Prof Dr. Franklin Delano Soares Forte pelo aprendizado e incentivo, me permitindo através das monitorias e projetos de extensão me dedicar, ao que eu já sabia... Era a melhor porção que Deus tinha para mim (docência).. .À todos os professores e todos os funcionários do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte pela receptividade, pelo carinho, pelo favor, pelas experiências compartilhadas...por tornar precioso e leve os quase 1500 trechos de estrada. Por permitirem que essa seja a minha segunda casa e muito mais do que pedi ou jamais pensei. Não estaria comemorando essa Graça sem a colaboração e apoio de cada um deste departamento.. vi.

(8) Aos queridos e sempre presentes Ângela Maria de Medeiros, Jânio Rodrigues Rêgo, Pedro Henrique Sette de Souza, Laércio Almeida de Melo, Meily de Mello Sousa, Yan Nogueira Leite de Freitas, Victor de Farias, Valdison Ribeiro... pelo carinho, dedicação, conforto em momentos dolorosos, por se alegrarem com minhas vitórias, pelo oportunidade de aprender e pelo privilégio da amizade.. À aluna Isabelle Helena Gurgel de Carvalho pela disponibilidade, pela companhia nas noites de laboratório, pelas mãos estentidas, pela dedicação e pela grata e feliz amizade. Através da sua vida agradeço a cada um (graduação e pós graduação) que se apaixonou pela Microbiologia e Fitoterapia, se doou aos experimentos, a pesquisa e muito também me ensinaram.. À colaboração dos Laboratório de Microbiologia (DOD-UFRN), Laboratório de Farmacognosia (UFRN), Laboratório de Biotecnologia de polímeros naturais (UFRN), Laboratório de Pesquisa em Petróleo (UFRN), Laboratório de Microbiologia Clínica (UFRN), Laboratório de Cultura de Células (UFRN), Laboratório de Microbiologia (Universidade Estácio de Sá- Rio de Janeiro/RJ), e Laboratório de Microbiologia (UFRN) e professores, alunos e funcionários ligados aos mesmos.. À todos os membros da Primeira Igreja Batista de Intermares, por tantos anos de convivência, pelos joelhos dobrados e pelo levantar em oração pela minha vida. Quando o sonho é divino, o Rei manda a provisão. Amo vocês. Às minhas “mães” Dilá e Lúcia (Dinda) e aos meus “pais” Jorge e Rogério (Dindo), pelo profundo amor... em espírito e em oração estamos sempre juntos.. À todos os meus alunos, aos que ainda virão... aos meus amados afilhados (93, 100, 101)... Não houve obstáculos na minha graduação (sim, eu já esperava por vocês) e na pós graduação que pudesse ser difícil a superar quando eu sabia que teria brevemente pessoas a cuidar, ensinar, transformar. vii.

(9) e ser transformada. Vocês são resposta, promessa, saudade! Vocês são meus sábios professores, meu conto de fadas, meu final feliz!. Aprendi com vocês que é possível amar a todos como se apenas UM houvesse. Meu trabalho...Meu ministério.. À todos aqueles (incontáveis) que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho e sobretudo para a minha formação pessoal e acadêmica.. MEUS SINCEROS AGRADECIMENTOS. viii.

(10) “OS JOVENS SE CANSAM E SE FATIGAM, E OS MOÇOS DE EXAUSTOS CAEM, MAS OS QUE ESPERAM NO SENHOR RENOVAM AS SUAS FORÇAS, SOBEM COM ASAS COMO ÁGUIAS, CORREM E NÃO SE CANSAM, CAMINHAM E NÃO SE FATIGAM...” (ISAÍAS,40:30-31). POR ISSO MESMO, EMPENHEM-SE PARA ACRESCENTAR À SUA FÉ A VIRTUDE; À VIRTUDE O CONHECIMENTO; AO CONHECIMENTO O DOMÍNIO PRÓPRIO; AO DOMÍNIO PRÓPRIO A PERSEVERANÇA; À PERSEVERANÇA A PIEDADE; À PIEDADE A FRATERNIDADE; E À FRATERNIDADE O AMOR... PORQUE, SE ESSAS QUALIDADES EXISTIREM E ESTIVEREM CRESCENDO EM SUAS VIDAS, ELAS IMPEDIRÃO QUE VOCÊS, NO PLENO CONHECIMENTO DE NOSSO SENHOR JESUS CRISTO, SEJAM INOPERANTES E IMPRODUTIVOS. (2 PEDRO 1:5-8). ix ix.

(11) RESUMO A presente pesquisa teve como objetivo avaliar in vitro a ação antimicrobiana dos extratos da raiz de Solanum paniculatum (jurubeba), da folha de Spondias mombin (cajá) e do fruto de Lycium barbarum (gojiberry) sobre microorganimos superinfectantes do meio ambiente bucal, bem como analisar fitoquimicamente os materiais vegetais e seus potenciais efeitos citotóxicos. O screening fitoquímico dos extratos foi investigado por reações químicas e Cromatografia em Camada Delgada (CCD). Nas análises por CCD foram utilizadas placas de sílica gel 60; AcOEt:Ácido fórmico:MeOH:Água (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v), BuOH:Ácido fórmico:Água (3:1:1, v/v/v), Clorofórmio:MeOH (8:2, v/v), tolueno:acetato de etila:ácido fórmico (5:2,5:0,25, v/v/v), acetato de etila:n-propanol:ácido acético: água (4:2:2:0,6, v/v/v/v), como fases móveis; e para detecção dos metabólitos secundários, usou-se vanilina sulfúrica, solução FeCl3 1 %, Reagente Natural A 0,5%, Reagente Natural A 0,2%/UV 365 nm, KOH a 5%(v/v), e Dragendorff. Posteriormente, foi determinada a Concentração Inibitória Mínima, Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) Cinética bactericida (CF) e fungicida (CF) dos extratos sobre Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans (cepas ATCC e isolados clínicos). Ao nível de 5% de significância aplicou-se o teste t-Student ou de Mann-Whitney (p<0,05). Cada ensaio foi realizado em duplicata e utilizou-se como controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12% e nistatina 100.000 U.I. O potencial citotóxico dos extratos foi avaliado através da viabilidade celular de fibroblastos da linhagem 3T3. As análises por CCD sugeriram a presença de ácidos fenólicos, taninos, saponinas, alcaloides, flavonoides, ácido elágico, quercetina, canferol, cumarinas e carboidratos. Todos os extratos apresentaram ação bacteriostática e fungistática. S. paniculatum apresentou desempenho médio superior ao controle positivo e estatisticamente significativo até a diluição 1:16 (31,25 mg/mL) sobre P. aeruginosa ATCC. S. mombin apresentou desempenho médio superior à clorexidina e estatisticamente significativo até a diluição 1:512 (0,97 mg/ mL) e 1:256 (1,95 mg/mL) sobre E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC, respectivamente. Lycium barbarum apresentou desempenho médio superior ao controle positivo e estatisticamente significativo até a diluição 1:4 (125 mg/mL) e 1:16 (31,25 mg/mL) sobre Enterococcus faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC, respectivamente. S. paniculatum apresentou ação bactericida e fungicida sobre E. faecalis (ATCC e AB) e C. albicans (ATCC e AB) e efeito antiaderente sobre todos os micro-organismos testados até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL), exceto para S. aureus ATCC (1:8) e P. aeruginosa ATCC (1:2). S. mombin apresentou ação bactericida sobre E. faecalis (ATCC e AB), fungicida sobre C. albicans (ATCC e AB) e ação antiaderente sobre todas as bactérias testadas, com destaque para P. aeruginosa ATCC e E. faecalis (ATTC e AB) até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL). Lycium barbarum não apresentou ação bactericida e fungicida, entretanto apresentou efeito antiaderente até a diluição 1:32 (15,65 mg/mL) sobre P. aeruginosa ATCC. Os extratos apresentaram citotoxicidade em cultura de células nas concentrações testadas (100 mg/ mL, 31,25 mg/mL, 15,65 mg/mL, 7,81 mg/mL, 6,67 mg/mL, 1,95 mg/mL e 0,97 mg/mL) suscitando a necessidade de testes que indiquem quantas vezes os produtos são mais eficazes frente a determinados alvos do. x.

(12) que sobre células humanas. Conclui-se que S. paniculatum, Spondias mombin e Lycium barbarum apresentaram significativa ação antimicrobiana, justificada pelos achados farmacológicos, estimulando a pesquisa de substâncias naturais bioativas, alvo-específicas, para tratamento de infecções bucais persistentes ou refratárias.. Palavras-chave: Microbiologia; delgada; Toxicidade. Fitoterapia;. xixi. Cromatografia. em. camada.

(13) ABSTRACT This study aimed to evaluate the in vitro antimicrobial activity of the root extract of Solanum paniculatum (jurubeba), the leaf of Spondias mombin (hog or java plum) and the fruit of Lycium barbarum (gojiberry) on superinfecting microorganisms in the oral environment, as well as phytochemically analyze plant material and potential cytotoxic effects. The phytochemical screening of the extracts was carried out by chemical reactions and Thin Layer Chromatography (TLC). In the analysis by TLC silica gel 60 plates were used; EtOAc: formic acid: MeOH: Water (10: 0.5: 0.6: 0.2 v / v / v / v), BuOH: formic acid: water (3: 1: 1, v / v / v ) Chloroform: MeOH (8: 2, v / v) toluene: ethyl acetate: formic acid (5: 2.5: 0.25 v / v / v) and ethyl acetate: n-propanol: acid acetic acid: water (4: 2: 2: 0.6 v / v / v / v) as mobile phase; and for detection of secondary metabolites the following were used: vanillin sulfuric acid, FeCl 3 solution of 1%, 0.5% Natural Reagent A, Reagent A 0.2% Natural UV / 365 nm KOH 5% (v / v) and Dragendorff . Subsequently, the minimum inhibitory concentration, Minimum Inhibitory Concentration of Adherence (MICA) Bactericidal Kinetics (BK) and fungicidal (FC) were determined from the extracts of Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans (ATCC and clinical isolates). The t-Student test or Mann-Whitney test was applied with 5% significance (p <0.05). Each assay was performed in duplicate and chlorhexidine digluconate at 0.12% and nystatin 100,000 I.U. were used as positive controls. The cytotoxic potential of the extracts was assessed by cell viability from fibroblasts from the 3T3 cell line. Analysis by TLC suggested the presence of phenolic acids, tannins, saponins, alkaloids, flavonoids, ellagic acid, quercetin, kaempferol, coumarins and carbohydrates. All extracts showed bacteriostatic and fungistatic action. S. paniculatum demonstrated a higher mean performance than the positive control and was statistically significant up till the dilution 1:16 (31.25 mg / mL) of P. aeruginosa ATCC. S. mombin had a mean performance superior to chlorhexidine and was statistically significant at the dilutions 1: 512 (0.97 mg / mL) and 1: 256 (1.95 mg / mL) of E. faecalis ATCC and P. aeruginosa ATCC, respectively. Lycium barbarum showed a mean performance higher than the positive control and was statistically significant at the 1:4 dilution (125 mg / mL) and 1:16 (31.25 mg/mL) of Enterococcus faecalis ATCC and P. aeruginosa ATCC, respectively. S. paniculatum presented bactericidal and fungicidal action on E. faecalis (ATCC and OE) and C. albicans (ATCC and OE) and non-stick effect on all microorganisms tested until the dilution 1: 512 (0.97 mg/mL), except for S. aureus ATCC (1:8) and P. aeruginosa ATCC (1: 2). S. mombin showed bactericidal action against E. faecalis (ATCC and OE) and C. albicans (ATCC and OE) and non-stick action on all tested bacteria, especially P. aeruginosa ATCC and E. faecalis (ATTC and OE) until the dilution 1: 512 (0.97 mg/mL). Lycium barbarum showed no bactericidal and fungicidal action, but showed non-stick effect until the 1:32 dilution (15.65 mg/mL) of P. aeruginosa ATCC. The extracts showed cytotoxicity in cell culture at the concentrations tested (100 mg / mL, 31.25 mg / mL, 15.65 mg / mL, 7.81 mg / mL, 6.67 mg / mL, 1.95 mg / mL and 0.97 mg / mL) indicating the need for tests that indicate how much more the tested products are effective against the determined targets than the human cell. It can be concluded that S. paniculatum, Spondias mombin and Lycium barbarum showed significant antimicrobial action,. xii.

(14) justified by the pharmacological findings, thus stimulating the need for further research of target-specific, bioactive natural substances in the treatment of persistent or refractory oral infections. Keywords: Microbiology; Phytotherapy; Thin layer chromatography; Toxicity. xiii.

(15) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. AB: Ambiente Bucal ATCC: American Type Culture Collection BHI: Brain Heart Infusion C. albicans: Candida albicans CCD: Cromatografia em Camada Delgada CB: Cinética Bactericida CIM: Concentração Inibitória Mínima CIMA: Concentração Inibitória Mínima de Aderência E. faecalis: Enterococcus faecalis OMS: Organização Mundial de Saúde PPGCSa: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde P. aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa SUS: Sistema Único de Saúde S. aureus: Staphylococcus aureus UFC: Unidade Formadora de Colônia UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte TCLE: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido UFRJ: Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte. xiv.

(16) LISTA DE FIGURAS. Figura 01: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da 27 atividade antimicrobiana dos extratos sobre cada amostra ensaiada Figura 2: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da Cinética Bactericida e Fungicida dos extratos testados para cada amostra. 29. ensaiada Figura 3: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência dos extratos sobre cada amostra. 31. ensaiada Figura 1 (Artigo 5.1): TLC of ethanolic extract of S. paniculatum roots.. 57. Figura 1 (Artigo 5.3): Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da 92 fase móvel A Figura 2 (Artigo 5.3): Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da 92 fase móvel B Figura 1 (Artigo 5.4): Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da 110 fase móvel A Figura 2 (Artigo 5.4): Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da 110 fase móvel B. xv.

(17) LISTA DE TABELAS. Tabela 1: Preliminary phytochemical screening of S. paniculatum roots. xvi. 57.

(18) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO. 19. 2. JUSTIFICATIVA. 22. 3.. OBJETIVOS. 23. 3.1. OBJETIVO GERAL. 23. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 23. MÉTODOS. 24. 4 4.1. PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE SOLANUM PANICULATUM LINN. 24. (JURUBEBA), SPONDIAS MOMBIN (CAJÁ) E LYCIUM BARBARUM LINN (GOJIBERRY) 4.1.1 4.1.2. Local de execução e Obtenção do material Obtenção dos extratos da raiz de Solanum paniculatum e folhas de. 24 24. Spondias mombin e frutos de Lycium barbarum e determinação de sua concentração CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA. 25. 4.2.1. Triagem Fitoquímica. 25. 4.2.2. Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD). 25. 4.2. 4.3. ENSAIOS IN VITRO DOS EXTRATOS DE SOLANUM PANICULATUM. 26. LINN., SPONDIAS MOMBIN E LYCIUM BARBARUM 4.3.1. Determinação da Concentração Inibitória Mínima dos extratos de. 26. Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum 4.3.2. Determinação da Cinética Bactericida e Fungicida do extrato de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum. 28.

(19) 4.3.3. Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência dos 30 extratos de. Solanum. paniculatum. Linn,. Spondias mombin. e Lycium barbarum 4.3.4. Avaliação do potencial citotóxico dos extratos de Solanum paniculatum,. Spondias mombin. e Lycium. barbarum. 32. sobre. fibroblastos da linhagem 3T3 4.3.5. Análise Estatística. 33. 5. ARTIGOS PRODUZIDOS. 34. 6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES. 111. 7. REFERÊNCIAS. 114. 8. APÊNDICE. 117. 9. ANEXO. 150. xviii.

(20) 19 1 INTRODUÇÃO. No cenário atual, deparamo-nos com informações diárias que refletem a necessidade de continuar a busca por inovações terapêuticas para o cuidado em saúde. Veem-se rotineiramente infecções nosocomiais causadas por superbactérias, com consequências catastróficas. Em acréscimo, a indústria farmacêutica mundial tem diminuído o seu investimento na descoberta de novas drogas antimicrobianas ou para doenças negligenciáveis, acarretando a falta de inovação terapêutica neste seguimento, o que poderá levar a uma dificuldade no tratamento das afecções em médio e longo prazo1. Nesse sentido, a humanidade tem continuadamente se beneficiado de produtos de origem natural, ou derivados, para a prevenção e/ou tratamento de um amplo espectro de doenças que afetam os seres humanos. A descoberta de metabólitos secundários de plantas, produtos de algas marinhas, peptídeos antimicrobianos produzidos por fungos, e tantas outras fontes, serve de base para o desenvolvimento da indústria farmacêutica e, consequentemente, cria novas modalidades e alternativas terapêuticas, sobretudo para a Odontologia. No que diz respeito ao ambiente bucal, trata-se de um reservatório que pode abrigar uma composição heterogênea de micro-organismos, inclusive, os considerados superinfectantes desse ambiente, comumente associados a infecções oportunistas e persistentes, tais como: micro-organismos entéricos, pseudomonados, do gênero estafilococos e leveduras. Enterococcus faecalis é uma bactéria gram-positiva que faz parte da microbiota do trato gastrointestinal e urinário2 . E. faecalis é responsável por mais de 90% dos casos de infecções causadas por bactérias do gênero Enterococcus3, incluindo endocardite bacteriana, infecções no trato urinário 4, além de infecções endodônticas5,6,7, podendo estar associada à cárie e a doença periodontal2,7,8. Os microrganismos do gênero estafilococos não são considerados parte da microbiota residente bucal humana, mas podem atuar como agentes patogênicos oportunistas em pacientes submetidos a tratamento sistêmico prolongado com agentes antimicrobianos ou imunossupressores9,10. Candida spp. podem ser consideradas leveduras comensais do ambiente bucal. C. albicans é a espécie predominante, representando 60 a.

(21) 20 70% de todos os isolamentos11,12,13 em boca. As razões para o estabelecimento de infecções causadas por esse micro-organismo têm sido associadas à imunossupressão, lesões nas mucosas, má higiene bucal e tratamento a longo prazo com antibióticos ou corticóides14,15. Pseudomonas aeruginosa trata-se de um bacilo gram negativo, responsável por 70% das infecções por pseudomonas no ser humano; a exemplo do S. aureus, é uma bactéria oportunista e possui diversos fatores de patogenicidade, tais como: capacidade de se organizar em biofilme, produção de enzimas extracelulares e toxinas, mecanismos de quorum sensing e resistência a muitos antimicrobianos16,17 . Consi*derando persistentes. ou. o. aumento. refratárias. da. ocorrência. relacionadas. de. com. infecções. bucais. micro-organismos. superinfectantes do meio ambiente bucal, é requerido o desenvolvimento de soluções naturais alternativas e economicamente. viáveis, substituindo. antimicrobianos usualmente utilizados. No Brasil, existem várias espécies de plantas nativas potencialmente medicinais, tais como Solanum paniculatum Linn. Essa espécie é conhecida popularmente por “jurubeba” e está listada na Farmacopeia Brasileira18 e pertence a "Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde (Renisus)”19 por apresentar potencial em gerar produtos de interesse do Ministério da Saúde. A raiz de jurubeba é considerada a parte mais ativa da planta. No que se refere a aspectos científicos, são constatadas ação antibacteriana, antifúngica, antiviral, moluscicida, anticancerígena, antiinflamatória,. antioxidante,. diurética,. antidiarreica,. hepatoprotetora,. gastroprotetora e antiulcerogênica20-25 . Spondias mombin, popularmente conhecida como “cajá”, é amplamente utilizada na medicina popular por apresentar componentes com atividade antiinflamatória26, embora também seja utilizada no tratamento da diarreia aguda, do diabetes mellitus e da anemia27. Os frutos de Lycium barbarum Linn, também chamado de “gojiberry” ou “wolfberry”, é um tradicional fitoterápico de origem chinesa que tem sido utilizado por mais de 2300 anos na Ásia Oriental28 No que se refere a evidências científicas, possui relatos de ação antioxidante, imunomodulador,.

(22) 21 antitumoral, neuroprotetor, radioprotetor29,30, antidiabetes, anti-osteoporose, antifatiga28 e antifúngica e antibacteriana31. Nesse sentido, torna-se de grande valia a realização deste estudo, para a determinação da ação antimicrobiana, antiaderente, bactericida e fungicida dos extratos de Solanum paniculatum Linn (jurubeba), Spondias mombin (cajá) e Lycium barbarum Linn (gojiberry). Ademais, é de fundamental importância a investigação dos seus perfis fitoquímicos e citotoxicidade, favorecendo a aplicação segura de substâncias naturais bioativas sobre micro-organismos associados com infecções persistentes ou refratárias..

(23) 22 2 JUSTIFICATIVA. A utilização de plantas na prevenção e tratamento de doenças infecciosas bucais e como agente antibiofilme, continua a ser valorizada em muitas partes do mundo, é recomendado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) (1987), e em nosso país muitos estudos têm sido desenvolvidos visando avaliar o uso popular de plantas na Odontologia, tornando possível a identificação de espécies vegetais com potencial atividade biológica. Pesquisas sobre novos agentes antimicrobianos são o resultado da colaboração interdisciplinar baseada no conhecimento empírico oriundo de “raizeiros”, “mateiros”, “rezadeiras”, erveiros, curandeiros, pajés e outros; aliada à etnofarmacologia, botânica, química dos compostos naturais, Microbiologia, Farmacologia e clínica. Muitos extratos e seus compostos fitoquímicos, exibem in vitro e in vivo propriedades antimicrobianas estimulando a pesquisa de substâncias naturais bioativas para tratamento de infecções bucais associadas a micro-organismos endógenos e superinfectantes do ambiente bucal. Além disso, tomando como base o conceito de Atenção Primária de Saúde, a Fitoterapia se configura como uma ótima alternativa terapêutica e de grande aceitação social, estando, portanto, este recurso em consonância com os pressupostos do Sistema Único de Saúde. A utilização das plantas medicinais, nos Programas de Atenção Básica, só viria a melhorar a assistência à saúde, sobretudo em Odontologia na medida em que tal uso é acorde com os princípios da Estratégia de Saúde da Família, visando à integralidade das ações e a utilização de uma tecnologia prática e acessível a todas as famílias e comunidades, com um custo reduzido, não levando a descontinuidade das ações. Logo, justifica-se a realização do presente estudo e o investimento no desenvolvimento de soluções naturais alternativas e economicamente viáveis, inclusive, para o tratamento de infecções bucais persistentes ou refratárias. Além disso, vislumbra-se a possibilidade concreta de inserção da prática de uso de fitoterápicos e das plantas medicinais como recurso terapêutico nas Unidades Básicas de Saúde ofertada pelo Sistema Único de Saúde (SUS), mormente representada pela Estratégia de Saúde da Família..

(24) 23 3 OBJETIVOS. 3.1 Objetivo Geral. A presente pesquisa teve como objetivo avaliar a ação antimicrobiana, bactericida, fungicida e antiaderente, dos extratos vegetais de Solanum paniculatum Linn (jurubeba), Spondias mombin (cajá) e Lycium barbarum Linn (gojiberry) sobre micro-organismos superinfectantes do meio ambiente bucal, bem como investigar os seus perfis químicos e citotoxicidade.. 3.2 Objetivos Específicos. 3.2.1 Realizar um screening fitoquímico dos extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum Linn através de reações químicas e Cromatografia em Camada Delgada (CCD). 3.2.2 Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM), Cinética Bactericida (CB) e Fungicida (CF) dos extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum Linn frente Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans, ATCC e isolados do ambiente bucal. 3.2.3 Determinar a Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) dos extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum. Linn. frente. Enterococcus. faecalis,. Staphylococcus. aureus,. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans, ATCC e isolados do ambiente bucal. 3.2.4 Avaliar o potencial citotóxico dos extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum Linn sobre fibroblastos da linhagem 3T3..

(25) 24 4 MÉTODO. 4.1 PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE SOLANUM PANICULATUM LINN (JURUBEBA), SPONDIAS MOMBIN (CAJÁ) E LYCIUM BARBARUM LINN (GOJIBERRY). 4.1.1 Local de execução e Obtenção do material As raizes de Solanum paniculatum foram coletadas na cidade do Natal – RN (Tabua- RN S 5º 51’ 30” W 5º 51’ 30”). A preparação do extrato de S. paniculatum. Linn.. foi. conduzida. no. Laboratório. de. Farmacognosia,. Departamento de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, UFRN. As folhas de Spondias mombin foram coletadas em uma fazenda particular na região de Tábua em Dom Marcolino Dantas/ RN (Tabua- RN S S° 28’ 14’’ W 35° 27’ 37’’). A preparação do extrato de Spondias mombin foi conduzida no Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, UFRN. Os frutos secos de Lycium barbarum foram obtidos em loja especializada na cidade do Rio de Janeiro-RJ. A preparação do extrato de Lycium barbarum Linn foi conduzida no Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, UFRN.. 4.1.2 Obtenção dos extratos da raiz de Solanum paniculatum Linn, folhas de Spondias mombin e frutos de Lycium barbarum Linn, e determinação de sua concentração. As raízes secas de Solanum paniculatum foram submetidas à maceração (1:2 p/ v, planta / etanol) durante 72 h à temperatura ambiente para se obter o extrato etanólico de S. paniculatum. O macerado foi filtrado a vácuo, obtendo-se o extrato etanólico (EE) das raízes de S. paniculatum e seco sob pressão reduzida, com auxílio do Rotaevaporador (Buchi R-210 Rotavapor®, Nova Castel, DE). Para os testes biológicos o EE foi liofilizado. As folhas de S. mombin foram submetidas à secagem na sombra, sob temperatura ambiente durante duas semanas. Após secas, foram trituradas em.

(26) 25 um moinho de facas. O extrato foi preparado por maceração utilizando etanol: H2O (70:30), durante um período de sete dias, obtendo-se assim o extrato hidroetanólico das folhas (EH). O extrato foi filtrado e eliminado todo solvente orgânico com auxílio de um rotaevaporador (Buchi R-210 Rotavapor®, Nova Castel, DE) à temperatura de 45° C. Para os testes biológicos o EH foi liofilizado. O extrato dos frutos secos de Lycium barbarum foi preparado por maceração por 7 dias com álcool etílico 70 %, na proporção 1:5 (droga vegetal: solvente, p/v). O macerado foi filtrado a vácuo, obtendo-se o extrato hidroetanólico (EH) dos frutos de L. barbarum. O EH foi seco sob pressão reduzida com auxílio de um evaporador rotatório (Buchi R-210 Rotavapor®, Nova Castel, DE) a temperatura não superior a 45º C, obtendo-se o extrato seco de L. barbarum. Para os testes biológicos o EH foi liofilizado.. 4.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA. 4.2.1 Triagem Fitoquímica. As reações de identificação dos grupos fitoquímicos foram realizadas por métodos clássicos, descritos por Carvalho, Gosmann e Schenkel (2007); Zuanazzi e Montanha, (2007); Santos e Mello (2007). Os resultados foram observados por meio do desenvolvimento de coloração e formação de precipitado. Os metabólitos secundários investigados foram: compostos fenólicos (reação de cloreto férrico); flavonoides (reação de Schinoda ou cianida), taninos (reação de gelatina) e alcaloides (reações de precipitação com os reagentes Mayer, Bertrand, Wagner e Dragendorff). O procedimento foi realizado conforme Langassner e Giordani (2013).. 4.2.2 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD). As condições cromatográficas utilizadas na análise por CCD foram:: i. adsorvente: cromatoplacas de alumínio de gel de sílica 60 F254; ii: fase móvel: foram escolhidos sistemas eluentes específicos, de acordo com os metabólitos secundários de interesse e otimizados de acordo com o resultado obtido e iii:.

(27) 26 reveladores: vanilina sulfúrica (como revelador universal); cloreto férrico (detecção. de. compostos. fenólicos);. Reagente. Natural. A. 0,5. %. (difenilboriloxietilamina), (detecção específica de flavonoides)/seguido de observação sob luz ultravioleta em 365 nm; e Reagente de Drangendorf (detecção de alcaloides) (Wagner; Bladt, 2001).. 4.3 ENSAIOS IN VITRO DOS EXTRATOS DE SOLANUM PANICULATUM LINN, SPONDIAS MOMBIN E LYCIUM BARBARUM LINN. 4.3.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima dos extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum Linn. A atividade antimicrobiana em placas foi realizada segundo a metodologia adaptada de Bauer e colaboradores (1966) para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). As linhagens microbianas foram cultivadas em caldo nutritivo (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) e incubadas a 37°C por 18-20 horas. Em placas de petri contendo Agar Mueller Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) foi introduzida solução salina inoculada com cada crescimento microbiano e foram confeccionados cinco orifícios padronizados de aproximadamente seis mm de diâmetro em cada placa. Foram introduzidos 50µL da substância teste (EB até a diluição em água destilada 1:512) nos orifícios, e as placas foram incubadas a 37°C por 24 horas. Cada ensaio foi realizado em triplicata sobre cada linhagem. O mesmo procedimento foi utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA) e nistatina 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brasil). Foi considerada CIM, a menor concentração dos extratos capaz de inibir o crescimento microbiano, representado pela presença de um halo de inibição, aferido em mm com auxílio do paquímetro (Digimess®, São Paulo, Brasil)..

(28) 27 Figura 1 - Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da atividade antimicrobiana dos extratos sobre cada amostra ensaiada..

(29) 28 4.3.2 Determinação da Cinética Bactericida e Fungicida do extrato de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum. A curva microbiana frente aos extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum foi avaliada pelo método de Peyret et al. (1990). As amostras foram inoculadas em caldo nutritivo (BHI- DIFCO®, Michigan, Estados Unidos), incubadas a 37º C por 18 a 20 horas e subcultivadas em Caldo Mueller Hinton – (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) por 1 hora, obtendo-se um inoculo de 106 UFC/mL. A 9mL da cultura microbiana, foi adicionado 1mL de cada extrato (bruto e na CIM), e ao tubo controle foi adicionado 1mL de água destilada e esterilizada. Os tubos foram mantidos na estufa a 37º C por 24 horas, e alíquotas foram retiradas após 2, 4, 6, 8, 10 e 24 horas de incubação e semeadas em placas com Agar Mueller Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Cada ensaio foi realizado em duplicata. A leitura das placas foi efetuada após incubação por 48 horas a 37ºC, pelo método padrão de contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) placas, observando o potencial bactericida e fungcida dos extratos por um determinado tempo. O tempo de morte de bactérias e levedura foi expresso em Log10..

(30) 29 Figura 2: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da Cinética Bacteriana e Fungicida dos extratos testados para cada amostra ensaiada.. 18-20 h. Plaqueamento em Agar Mueller Hinton. 1mL de extrato + 9mL do subcultivo. 1mL de água destilada + 9mL do subcultivo. Plaqueamento em Agar Mueller Hinton. Plaqueamento em Agar Mueller Hinton. 2, 4, 6 e 24 h. 2, 4, 6 e 24 h. 48 h.

(31) 30 4.3.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência dos extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum Linn. A Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) das bactérias e leveduras ao vidro, foi determinada de acordo com Gerbara, Zardetto e Mayer (1996). A partir dos crescimentos bacterianos e fúngicos, as linhagens foram sub-cultivadas a 37ºC em caldo Mueller-Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos), obtendo-se um inoculo de 106 UFC/mL. Foram distribuídos 1,8 mL dos subcultivos em tubos de hemólise e, em seguida, adicionado 0,2mL da soluções correspondentes às escalas (diluições) dos extratos. A incubação foi feita a 37°C por 24 horas, com os tubos inclinados a 30°. A leitura foi realizada através da observação visual da aderência das bactérias e leveduras às paredes do tubo, após agitação do mesmo. Cada ensaio foi realizado em duplicata frente a cada linhagem selecionada. O mesmo procedimento foi utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA) e nistatina 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brasil). A CIMA foi definida como a menor concentração do agente que impediu a aderência ao tubo de vidro..

(32) 31 Figura 3: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência dos extratos sobre cada amostra ensaiada.. CONTROLE POSITIVO. CONTROLE NEGATIVO. Estufa (37ºC) 24h. Overnight em caldo BHI. Caldo MuellerHinton. 1,8 mL da cultura. 0,2 mL do extrato Incubação.

(33) 32 4.3.4 Avaliação do potencial citotóxico dos extratos de Solanum paniculatum, Spondias mombin e Lycium barbarum sobre fibroblastos da linhagem 3T3. Foram utilizadas fibroblastos da linhagem 3T3 cedidas pelo Laboratório de Biotecnologia de polímeros naturais (BIOPOL, Departamento de Bioquímica, UFRN). Nesse teste foi analisada a capacidade de celulas tratadas com os extratos em reduzir o composto MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difenil tetrazolio) a sais de formazam. Inicialmente as células 3T3 foram cultivadas em frascos de 75 cm 2 com 7 mL meio de cultura Eagle modificado Dulbecco (DMEM) e foram divididos em 4 grupos, de acordo com o tratamento utilizado: (i) grupo controle: cultivado em meio básico; (ii) grupo Solanum paniculatum: cultivado em meio básico adicionado do extrato em concentração avaliada pelos testes supracitados; (iii) grupo Spondias mombin: cultivado em meio básico adicionado do extrato em concentração avaliada pelos testes supracitados; (iv) grupo Lycium barbarum: cultivado em meio básico adicionado do extrato em concentração avaliada pelos testes supracitados. A citotoxicidade dos extratos foi analisada nos intervalos de 24h e 48 h depois do cultivo celular através do ensaio do MTT (avaliação da atividade mitocondrial por redução do MTT). O MTT avalia a atividade metabólica das células quantificando a redução do MTT por desidrogenases associadas ao NADPH e NADH, resultando na produção de cristais de formazam. Para isso, as células foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 × 103 células/poço. Decorrido o tempo experimental, as células foram incubadas com 100 μL de meio de cultura contendo 1mg/mL de MTT por 4 horas e, em seguida, o produto colorimétrico (formazam) foi solubilizado com 100 μL de álcool etílico absoluto. A leitura da placa foi realizada em um leitor de ELISA em um comprimento de onda de 570 nm (μQuan Biotek®, Instruments, USA)..

(34) 33 4.3.5 Análise Estatística. Os resultados obtidos no teste da Concentração Inibitória Mínima (difusão em ágar) foram coletados, organizados e apresentados em forma de tabelas com os seus respectivos valores das médias dos halos, indicando a inibição do crescimento microbiano. Posteriormente, foram transferidos para um banco de dados informatizado e calculados os parâmetros estatísticos que incluiram valores das respectivas medidas descritivas: mínimo, máximo, média e desvio padrão. O nível de confiança utilizado para a obtenção dos intervalos foi de 95%. Ao nível de 5% de significância foi utilizado o teste t-Student ou de Mann-Whitney na comparação da inibição microbiana mínima dos extratos em relação aos controles positivos. Para a Cinética Bactericida e Fungicida e a Concentração Inibitória Mínima de Aderência a análise foi descritiva, através do método padrão de contagem de UFC/mL e através da observação visual da aderência dos microrganismos às paredes do tubo de vidro, respectivamente. Na avaliação do potencial citotóxico, a reducao do composto MTT a formazana foi verificada por espectrofotometria e foi considerada diretamente proporcional a atividade mitocondrial e viabilidade celular. Os dados foram analisados mediante o emprego do programa SPSS (Statistical Package for Social Sciences), versão 22.0..

(35) 34 5 ARTIGOS PRODUZIDOS 5.1 O artigo “Phytochemical screening and antimicrobial effect of Solanum paniculatum L. on superinfecting microorganisms from an oral environment” foi enviado para o periódico “Complementary Therapies in Medicine” e encaminhado pela revista para o periódico “Journal of Ethnopharmacology”, que possui fator de impacto 3.055 e Qualis A1 da CAPES para a área Medicina II..

(36) 35 Phytochemical paniculatum. L.. screening on. and. antimicrobial. superinfecting. effect. microorganisms. of from. Solanum an. oral. environment. Maria Regina Macêdo-Costaa*, Julia Morais Fernandesb, Silvana Maria Zucolotto Langassnerb, Kenio Costa de Limaa. a Department of Dentistry of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Av. Salgado Filho, 59056-000 - Natal, RN – Brasil. b Department of Pharmacy of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, R. Gen. Gustavo Cordeiro de Farias, 59012- Natal, RN – Brasil.. 1 Corresponding author: Av. Oceano Atlântico 1041/ap 801, Ponta de Campina, Cabedelo, Paraíba, 58310-000, +55 83 99921-4856, E mail: mariareginamamacedo@yahoo.com.br.

(37) 36 E-mail addresses: mariareginamamacedo@yahoo.com.br (Maria Regina Macêdo-Costa), fernandesjm@outlook.com (Julia Morais Fernandes), szucolotto@hotmail.com (Silvana Maria Zucolotto Langassner), limke@uol.com.br (Kenio Costa de Lima)..

(38) 37 Abstract Objectives: The aim of the study was to assess the antimicrobial effect of Solanum paniculatum on Enterococcus faecalis and Candida albicans, as well as to characterize its phytochemical profile. Method: The phytochemical screening was investigated through chemical reactions and Thin Layer Chromatography (TLC). During the TLC analysis were used the mobile phases: AcOEt: formic acid: MeOH: water; (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v); BuOH: formic acid: water (3:1:1, v/v/v) and chloroform: MeOH (8:2, v/v). Sulfuric vanillin, 1% FeCl3 solution, 0.5% natural reagent and Dragendorff reagent were used to detect secondary metabolites. Subsequently, the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), Minimum Inhibitory Concentration of Adherence (MICA) and the Bactericidal and fungicidal Kinetics of S. paniculatum were determined. The student´s t-test was applied, with the level of significance set at p<0.05. Chlorhexidine digluconate and Nystatin were used as the positive controls. Results: The results were confirmed through chemical reactions: phenolic compounds; flavonoids; tannins and alkaloids. The TLC analysis suggested that flavonoids were the most common compounds. S. paniculatum exhibited a bacteriostatic and fungistatic effect and there was a statistically significant difference between the products in relation to the dilutions/concentrations: 1:64/ 7.81 mg/mL (E. faecalis ATCC); 1:32/15.65 mg/mL (E. faecalis - isolated from oral environment- OE); 1:128/ 3.90 mg/mL (C. albicans OE) and 1:64/3.90 mg/mL (C. albicans ATCC). S. paniculatum exhibited a greater anti-adherent effect (1:512/ 0.97 mg/mL) than the controls and a bactericidal and fungicidal effect when the crude extract was used. Conclusion: S. paniculatum exhibited a significant antimicrobial effect, confirmed by the pharmacological findings, and thus stimulates further research of bioactive natural substances for the treatment of persistent or refractory oral infections..

(39) 38 Keywords: Solanum paniculatum; Microbiology; Phytotherapy; Thin layer chromatography.

(40) 39 1.Introduction. Health professionals often need to treat infections caused by specific microorganisms that are usually not found in the site of interest, or by microorganisms that colonize a site that is generally sterile. The mouth is a natural microbiome that is essential to the normal physiological development of the host1. However, some microorganisms, such as Enterococcus faecalis and Candida albicans, have become opportunistic pathogens and are now considered the most resistant species in the mouth.2 They are also considered as superinfecting microorganisms in persistent periodontal, endodontic and peri-implant infections3-8. Enterococci are natural inhabitants of the intestinal and genital microbiota of humans. The odontological source of infection by enterococci is probably exogenous, given that they are only transitory colonizers of the oral environment and have the capacity to adhere and survive in dental biofilm. E. faecalis is one of the most commonly isolated species of enterococci. This species is a gram-positive anaerobic facultative coccus, which is often correlated with hospital infections.6,7 It exhibits several different pathogenicity factors, including: the capacity to survive long-term starvation; the ability to adapt and persist in a variety of adverse environments, without the support of other bacteria; the production of gelatinase, which provides thicker biofilm; the capacity to grow in an alkaline pH and survive at temperatures of 60°C for 30 minutes; the ability to suppress the action of lymphocytes and stimulate an inflammatory response, indirectly damaging tissues and generating a natural resistance to several antimicrobial drugs.6,7 Candida albicans is the most commonly isolated fungus in the oral environment. The prevalence of C. albicans ranges from 47% to 75% among the yeast species isolated in the mouth. The back of the tongue is the main habitat of yeasts, although these microorganisms can be found in the buccal mucosa, palate, saliva and on dental surfaces. Its pathogenicity factors include the following: the ability to adhere to hydroxyapatite coated with saliva; the capacity to bind with native or denatured collagen; the capacity to degrade.

(41) 40 dental collagen and induce inflammatory reactions; the ability to arrange itself as biofilm on biotic and abiotic surfaces and survive as a monoinfection.. 4, 6, 9.

(42) 41 Due to the prevalence of these multi-resistant strains, the search for new strategies to combat oral infections has been encouraged ,2 particularly in terms of strategies that involve the use of natural antimicrobials and phytochemicals. 10,11. In Brazil, several species of potentially medicinal native plants exist, including Solanum paniculatum. This species is commonly known as “jurubeba” and belongs to the Solanaceae family, which is found in several regions in Brazil.12 Stehman It is widely used as a remedy for bronchitis, coughs, arthritis, jaundice, hepatitis, fever and stomach problems. The plant is believed to possess. anti-viral,. anti-cancer,. anti-inflammatory,. hepatoprotective and antimicrobial properties.. 13-17. antioxidant,. diuretic,. The chemical constitution of. the species contains flavonoids, amides, steroids, lignans, steroidal saponins and. steroidal. alkaloids.14-19. This. species. is. listed. in. the. Brazilian. Pharmacopoeia20 and the "National Report on Medicinal Plants of Interest to the Single Health System (Renisus),” 21 due to its potential for use in products of interest to the Brazilian Ministry of Health. The aim of the present study was to phytochemically analyze and assess in vitro the antimicrobial, anti-adherent, bactericidal and fungicidal effects of root extract of Solanum paniculatum on Enterococcus faecalis and Candida albicans, which were provided by the ATCC and isolated from an oral environment (OE).. 2.Materials and Methods. 2.1 Preparation of the Solanum paniculatum extract. The roots of S. paniculatum were obtained in the Brazilian city of NatalRN, which has the following geographical coordinates: latitude 5º 51’ 30” S and longitude 5º 51’ 30” W. The botanical identification was performed by Prof. Dr. Maria Iracema Bezerra Loyola (Biology Department/UFRN). The voucher specimen was deposited in the Herbarium of the Biosciences Center of the Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN 5468). The dry roots were submitted to maceration (1:2 p/ v, plant / ethanol) for 72 h at room temperature to obtain the ethanolic extract of S. paniculatum.

(43) 42 (yield: 1, 0.80% in relation to the dry plant). The macerate was vacuum filtered to obtain the ethanolic extract (EE) of the roots of S. paniculatum and dried under reduced pressure from a.

(44) 43 Rota evaporator (Buchi R-210 Rotavapor®, Nova Castel, DE). The dry extract was then placed in distilled water, prior to lyophilization. 2.2 Phytochemical screening of the roots of Solanum paniculatum. The identification reactions for the phytochemical screening were performed using standard methods.22-24 The results were recorded based on the development of coloration and precipitate formation. The following secondary metabolites were investigated: phenolic compounds (reaction of ferric chloride); flavonoids (reaction of Shinoda or cyanide), tannins (reaction of gelatin) and alkaloids (precipitation reactions with Mayer, Bertrand, Wagner and Dragendorff reagents).. 2.3 Thin Layer Chromatography (TLC) Analysis. The chromatographic conditions used in the TLC analysis were as follows: i. adsorbent: F254 silica gel aluminum chromatoplates (Merck®, Darmstadt, Germany); ii: mobile phase: AcOEt: formic acid: MeOH: water (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v), BuOH: formic acid: water (3:1:1, v/v/v) and chloroform: MeOH (8:2, v/v) and iii: developers: vanillin sulfuric acid (bitter compounds, saponins and essential oil compounds); ferric chloride (detection of phenolic compounds); natural reagent A 0.5% (specific detection of flavonoids)/followed by observation under ultraviolet light (365 nm); Dragendorff reagent (detection of alkaloids). The retention factors (Rf), the color and the behavior of the points were compared with the chromatographic profiles of reference substances in the literature. 25. 2.4 Microbial strains. Samples of Enterococcus faecalis (ATCC 292012) and Candida albicans (ATCC 36802) were obtained from the culture collection of the Laboratory of the Universidade Estácio de Sá (UNESA) and the Laboratory of Mycology of the UFRJ (Rio de Janeiro/RJ). These samples were then reactivated in the Laboratory of Microbiology in the Dentistry Department of the CCS/UFRN..

(45) 44 Enterococcus faecalis (OE 44) was obtained from the culture collection of the Laboratory of Microbiology in the UNESA (Research Ethics Committee of the Hospital Universitário Clementino Fraga Filho protocol no. 140/04). Samples were collected from patients in endodontic clinics of the UFRJ and UNESA. Filter paper cones were introduced in the root canals. The material was transferred to Enterococcosel agar and incubated for 72 hours at 35°C. Subsequently, they were introduced to blood agar plates and incubated at 35°C for 72 hours. Pure colonies were submitted to tests to identify the enterococci species (Gram-staining, morphology of the colony, catalase test, growth in NaCl broth, arginine hydrolysis, use of pyruvate, motility, pigmentation production and carbohydrate fermentation). The identification was conducted using the PCR and specific E. faecalis primers. Candida albicans (OE 100) was obtained from the culture collection of the Laboratory of Microbiology in the Department of Clinical and Toxicological Analysis of the UFRN (Research Ethics Committee of the Hospital Universitário Onofre Lopes protocol no. 152/07). The clinical samples were collected from the saliva of patients, which was seeded in Sabouraud-dextrose agar. They were identified using germ tube evidence, hypertonic broth, tolerance to temperatures of 42ºC, micro-cultivation, the assimilation of carbohydrates, sugar fermentation and the PCR.. 2.5 Determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Antimicrobial activity on the plates (to determine the MIC) was analyzed in accordance with the adapted methodology of Bauer and collaborators.26 The microbial strains Enterococcus faecalis (ATCC 292012), Enterococcus faecalis (OE 44), Candida albicans (ATCC 36802) and Candida albicans (OE 100) were cultured in a nutrient broth (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan, USA) and then incubated at 37°C for 18-20 hours. Saline solution was inoculated with each microbial growth and was then added to petri dishes containing Mueller Hinton agar (DIFCO®, Michigan, USA). Five standardized holes (approx. six mm in diameter) were created in each plate. In total, 50μL of the test substance (crude extract up to a dilution of 1:512 in distilled water) was added to the holes and the plates were incubated at 37°C for 24 hours. Each.

(46) 45 trial was conducted in triplicate for each strain. The same procedure was used for the positive control, chlorhexidine digluconate 0.12% (Periogard®, ColgatePalmolive.

(47) 46 Company, New York, USA) and nystatin 100.000 U.I. (Micostatin®, BristolMyers, São Paulo, Brazil). The MIC was considered the lowest concentration of the extract capable of inhibiting microbial growth, represented by the presence of an inhibition halo, which was measured using a caliper (Digimess®, São Paulo, Brazil). Using these MIC results and a level of significance of 5%, the students ttest was conducted (p<0.05) to compare the antimicrobial activity of the extract and the positive controls.. 2.6 Determination of Bactericidal and Fungicidal Kinetics. The bactericidal and fungicidal potential of the S. paniculatum extract was assessed using an adapted version of the method described by Peyret and collaborators.27 The samples of Enterococcus faecalis (ATCC 292012), Enterococcus faecalis (OE 44), Candida albicans (ATCC 36802) and Candida albicans (OE 100) were inoculated in a BHI nutrient broth (DIFCO®, Michigan, USA), incubated at 37º C for 18 to 20 hours and sub-cultured in Mueller Hinton agar (BROTH) (DIFCO®, Michigan, USA) for one hour. To the 9mL of each microbial culture, we added 1mL of the extract (crude extract and the MIC). Subsequently, 1mL of distilled and sterilized water was added to the control tube. The tubes were stored at 37º C for 24 hours, with aliquots collected after 2, 4, 6 and 24 hours of incubation. These were then seeded in petri dished with Mueller Hinton agar (DIFCO®, Michigan, USA). Each procedure was performed in duplicate. Readings were taken after incubation for 48 hours at 37ºC using the standard method of counting colony forming units (CFU/mL) at specific times.. 2.7 Determination of the Minimum Inhibitory Concentration of Adherence (MICA).

(48) 47 The Minimum Inhibitory Concentration Adherence (MICA) of the S. paniculatum extract was determined as described by Gerbara, Zardetto and Mayer, 28 Enterococcus faecalis (OE 44), Candida albicans (ATCC 36802) and Candida albicans (OE 100) strains were sub-cultured at 37ºC in Mueller-Hinton agar (DIFCO®, Michigan, USA). Subsequently, 1.8 mL of the sub-culture was placed in hemolysis tubes and then 0.2mL of the corresponding solution was added to the extract dilutions. The readings were taken 24 hours later through visual observations of the adherence of the microorganisms to the walls of the tube (after shaking). Each trial was performed in duplicate against each strain selected. The same procedure was used for the positive control, the chlorhexidine digluconate 0.12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, New York, USA.) and nystatin 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brazil). The MICA was defined as the lowest concentration of the agent that impeded the adherence to the glass tube.. 3.Results. 3.1 Identification Reactions. Table 1 displays the results obtained in the preliminary phytochemical screening performed with root extracts of S. paniculatum. The phytochemical screening of the S. paniculatum extract confirmed the presence of phenolic compounds, flavonoids, tannins and alkaloids. . 3.2 Thin Layer Chromatography (TLC) Analysis. The digital prints of the extract were obtained from the TLC. When the mobile phase involved the use of AcOEt: formic acid: MeOH: water (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v) and BuOH: formic acid: water (3:1:1, v/v/v), both of which were developed with vanillin sulfuric acid + heating, yellow and violet colored bands were observed, suggesting the presence of flavonoids and saponins (steroids or terpenes), respectively. When the development was performed with ferric chloride, brown colored bands were visualized, suggesting.

(49) 48 the presence of phenolic compounds. Subsequently, natural reagent A (0.5%) was used and the samples were studied under UV light (365 nm), which confirmed the strong presence of bands characteristic of flavonoids in these fractions (Figure 1). When chloroform: MeOH (8:2, v/v) was used as the mobile phase and Dragendorff reagent was used for development, two orange-colored bands were visualized, suggesting the presence of alkaloids (Figure 1).. 3.3 Determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC). The S. paniculatum extract had an effect on all of the microorganisms tested, with inhibition halos ranging from 12 to 20 mm. The extract exhibited an antibacterial affect up to the dilution of 1:64 (7.81 mg/mL) for E. faecalis ATCC and an antifungal effect up to the dilution of 1:256 (1,95 mg/mL) for C. albicans (OE), which was the most sensitive microorganism to the extract. The positive controls were effective on all of the microorganisms and the inhibition halos ranged from 10 to 24 mm. A statistically significant difference was found between the products in relation to the dilutions/concentrations of 1:64/ 7.81 mg/mL (E. faecalis ATCC), 1:32/15.65 mg/mL (E. faecalis OE), 1:128/ 3.90 mg/mL (C. albicans OE) and 1:64/3.90 mg/mL (C. albicans ATCC).. 3.4 Determination of Bactericidal and Fungicidal Kinetics. The bactericidal and fungicidal effect of the crude extract of S. paniculatum was observed in the first two hours of contact between the extract and the sample of C. albicans (OE) and in the first six hours of contact between the extract and E. faecalis (ATCC and clinical isolate), as well as C. albicans ATCC.. 3.5. Determination of the Minimum Inhibitory Concentration of Adherence (MICA). The S. paniculatum extract exhibited an anti-adherent effect on all of the microorganisms tested up to the dilution of 1:512 (0.97 mg/mL). Chlorhexidine.

(50) 49 exhibited an anti-adherent effect up to a dilution of 1:512, while nystatin´s effect was recorded up to 1:4.. 4. Discussion. Studies of new antimicrobial agents are the result of interdisciplinary collaboration involving ethnopharmacological, botanical, chemical (natural compounds) microbiological, pharmacological and clinical data, as well as input from healers. Many extracts and their phytochemical compounds, particularly secondary metabolites, exhibit in vitro and in vivo antimicrobial properties that are recommended in the prevention and treatment of infectious diseases, including those that involve superinfecting microorganisms.. 29. Therefore, the present study sought to chemically characterize and assess the bacteriostatic, fungistatic, anti-adherent, bactericidal and fungicidal activity of an extract from the roots of S. paniculatum. To do so, the S. paniculatum extract was analyzed through preliminary phytochemical screening using TLC with different developers to identify the classes of secondary metabolites. The results obtained corroborate previous pharmacological studies. 15, 16,19 Allaker and Douglas (2009)30 described several plant constituents with antimicrobial properties and highlighted the presence of phenolic compounds, flavonoids and tannins. Recently, Xie et al. (2015)31,. 32. reported that the. antimicrobial effect of flavonoids against a wide range of pathogenic microorganisms could be due to the inhibition of the synthesis of nucleic acid, the inhibition of the function of the cytoplasmic membrane and the inhibition of the formation and fixation of biofilm. According to Silva et al (2005), 33 flavonoids are the most abundant active metabolites in the Solanum genus. Concerning collaborators (2005). the 34. active. mechanism. of. tannins,. Loguercio. and. suggested that they inhibit bacterial and fungal enzymes. and/or complex with the substrates of these enzymes. Tanins act on the cellular mechanisms of microorganisms, modifying their metabolism, and may mix with metal ions, decreasing the availability of the ions needed for the microbial metabolism (Scalbert, 1991).35 Nordin et al. (2013)36 reported that the.

(51) 50 adherence of Candida species was reduced by up to 80% after exposure to phenolic compounds. Saponins are polyphenolic compounds that were also found in the present study. The biological activity exhibited by these compounds has been widely described in the literature, leading to their use in the pharmaceutical industry.16 Saponins were also identified in the roots of this species as isojuripidine, isojurubidine, isopaniculidine and jurubidine.37-39 Recently, it has also been confirmed that a polyphenol found in green tea inhibits bacterial growth and the formation of the E. faecalis biofilm.40 Thus, the presence of phenolic and polyphenolic compounds in plant extracts can affect the organization of microbial biofilm. 2 Alkaloids are also an important class of secondary metabolites, and they exhibit several pharmacological properties, including antimicrobial, 41,42, antitumoral. 43. and anti-herpes effects.44 Alkaloids are notable in the Solanaceae. family, particularly tropane alkaloids.45 Many alkaloids have been identified in connection with the species S. paniculatum, including jurubeba, jurubebine, jubebine, and solanine.46,47 Once the secondary metabolites with previously known and studied antimicrobial activity had been identified, an in vitro assessment of antibacterial and anti-fungal activity was conducted. ATCC strains are standard strains, with well-known susceptibility profiles. However, in order to assess the antimicrobial activity of a new product, it was necessary to include strains with a clinical origin, as they exhibit different susceptibility profiles, thereby ensuring greater accuracy in the assessment of the antimicrobial action of the agents of interest. The S. paniculatum extract had a bacteriostatic and fungistatic effect on all of the strains tested. In the case of the Enterococcus faecalis isolated from the oral environment (CIM= 15.65 mg/mL), chlorhexidine exhibited significantly higher activity levels (p<0.05) in the dilution of 1:32. For the Enterococcus faecalis ATCC (CIM=7.81 mg/mL), chlorhexidine exhibited significantly higher activity levels (p<0.05) in the dilutions of 1:2 and 1:64. However, there were no statistically significant differences (p>0.05) between the products for the dilutions of 1:4 and 1:16, both of which produced the same effect. Note that for both the extract and the control, the samples isolated from the oral environment.

(52) 51 exhibited greater resistance to chemical agents, probably due to the fact that they were in an oral environment and had been exposed to antimicrobials and interacted with other species, thereby contributing to the increase in selective pressure and the acquisition of resistance mechanisms. Chlorhexidine digluconate (the gold standard) has been suggested for the irrigation of root canals, as well as periodontal and peri-implant sites, due to its wide spectrum of activity and substantiality. However, in the case of persistent or refractory infections, in which Enterococcus faecalis is often isolated and organized in biofilm, permanent infections can occur after conventional antimicrobial procedures.7,. 8. In addition, previous studies have. reported an increase in the resistance of strains to conventional synthetic chemical agents and this, allied to the high cost, the potential side effects and the limitations on use for prolonged periods, has led to the suggested use of natural products.30,48 In the present study, both chemical agents had an antimicrobial effect on Enterococcus faecalis in its planktonic form, although it was also necessary to perform experiments on microorganisms growing in the biofilm. Concerning Candida albicans isolated from the oral environment (MIC=1.95 mg/mL), nystatin exhibited significantly higher activity levels (p<0.05) in the dilution of 1:128. In the dilution of 1:256 (corresponding to MIC), no statistically significant difference was found between the products (p>0.05). For the ATCC strain of Candida albicans (MIC =3.90 mg/mL), nystatin exhibited significantly higher activity levels (p<0.05) up to a dilution of 1:64. In the dilution of 1:128 (MIC), only the extract exhibited a fungistatic effect. Nystatin and fluconazole are the most commonly used antifungals in dental practice.49-51 However, the use of these agents can be limited, due to microbial resistance to conventional synthetic agents, which leads to inefficient therapy.50 Studies have also shown that a mature biofilm of C. albicans increases the resistance of fungal cells when faced with antimicrobial agents. The search for new antifungal agents and the characterization of new targets, including resistant strains, has therefore been proposed. Antifungal agents ideally should exhibit broad spectrum activity and no toxicity for the host. In the present study, the fungistatic activity of the extract was higher when faced with the most prevalent yeast in the oral environment.. 4.

(53) 52 The bactericidal and fungicidal kinetics of the crude extract were also determined in relation to the MIC of S. paniculatum. The bactericidal/fungicidal effect of the crude extract of S. paniculatum (no dilution) was observed in the first two hours of contact with the C. albicans sample (isolated from the oral environment) and in the first six hours of contact with E. faecalis (ATCC and OE) and C. albicans ATCC. When the extract was diluted (MIC), it only had a bactericidal effect on E. faecalis ATCC. When determining the Minimum Inhibitory Concentration of Adherence (MICA), it was noted that the extract exhibited an anti-adherent effect, represented by the absence of microbial adherence to the glass tube, which simulated a surface of the oral environment. This was the case for all of the samples tested. An anti-adherent effect was confirmed up to the dilution of 1:512 (MICA: 0.97 mg/mL), which was similar to that observed for chlorhexidine against E. faecalis (ATCC and the clinical isolate) and higher than that recorded for nystatin against Candida albicans (ATCC and the clinical isolate). Macedo-Costa et al. (2014)24 also assessed the antibacterial effect of root extracts of S. paniculatum, although they assessed the effect on endogenous oral bacteria: Streptococcus mitis, S. mutans, S. sanguinis, S. oralis, S. salivarius and Lactobacillus casei. The extract exhibited an MIC of 7.81 mg/mL and a MICA value of 62.5 mg/mL. It was bactericidal at a concentration of 500 mg/mL in two hours of contact with S. mutans and in four hours for the MIC. The phytochemical analysis confirmed the presence of sulfur compounds, gums and lactones (alkaloids), with a notable presence of phenols (flavonoids and tannins), both of which were also found in the present study. In. these. experiments,. S.. paniculatum. exhibited. bacteriostatic,. fungistatic, anti-adherent, bactericidal and bacteriostatic activity in vitro on the microbial suspension of the monoculture and confirmed the strong presence of flavonoids, tannins, saponins and alkaloids, which provides a probable explanation for the pharmacological activity of the extract. However, in order to extrapolate these data for use in clinical dentistry against persistent infections, further studies that consider the antimicrobial effects of S. paniculatum on superinfecting microorganisms in monoculture biofilm and multi-species biofilm are required..