A prática regular de exercícios físicos, em particular os de resistência/força com pesos, em combinação com adequada ingestão de nutrientes, principalmente de proteínas, é uma eficiente combinação para estimular e promover o crescimento muscular (BIOLO et al., 1995; 1997). Esse efeito é consequência do balanço proteico, que se torna positivo em virtude de aumento na taxa de síntese proteica excedendo a taxa de degradação.
Os mecanismos moleculares de síntese e degradação proteica envolvem uma rede de vias moleculares sinalizadoras, compostas de diferentes quinases e fosfatases que, quando fosforiladas ou defosforiladas, ativam vias específicas, resultando em processos de síntese ou degradação. Entre essas vias, a que envolve o fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), conhecida como IGF-1-Akt/proteína quinase B (IGF-1-Akt/PKB), é considerada a principal via metabólica que regula a síntese proteica (ROMMEL et al., 2001; SCHIAFFINO; MAMMUCARI, 2011). Tal via envolve uma proteína celular conhecida como mTOR, uma serina/treonina quinase que integra diferentes vias sinalizadoras com o objetivo de controlar, entre outros processos, a tradução do mRNA para a síntese de proteínas (BODINE et al., 2001; GLASS, 2005). A via IGF-1-Akt1 compartilha grande parte de seus componentes com a via insulina-Akt2 e ambas realizam intersecções em várias etapas.
Os fatores de crescimento, como, por exemplo, o IGF-1, uma vez ligado em seu respectivo receptor na membrana celular, promove a fosforilação e ativação do substrato receptor da insulina (IRS), que, por sua vez, ativa outra molécula sinalizadora, a phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) (BACKER et al., 1993). Um dos alvos da PI3K é a proteína quinase B (PKB), que ativa então a mTOR direta ou indiretamente. O efeito indireto é mediado pela inibição na formação do complexo TSC1/TSC2. A ativação direta ocorre pela ação da proteína Ras homologue enriched in brain (RHEB). A mTOR forma dois complexos proteicos diferentes, mTORC1 e mTORC2. A mTORC2 é necessária para a fosforilação e ativação da Akt. A mTORC1 fosforila a quinase S6 (S6K) que, por sua vez, fosforila a proteína ribossomal S6, entre outros fatores envolvidos no processo de síntese proteica. A mTORC1 também ativa o
fator de iniciação eucariótico 4E (eIF4E), fosforilando e inibindo a proteína de ligação 4EBP-1, conforme mostrado na FIG. 4.
FIGURA 4 – Sinalização celular da síntese e degradação proteico- muscular controlada pela via IGF-1-Akt/PKB
IGF1 (Insulin Growth Factor-1), IGF1rec (Insulin Growth Factor-1 receptor), IRS (Insulin Receptor Substrate), PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase), PDK1 (3-
phosphoinositide dependent protein kinase-1), Akt (Protein Kinase B, PKB), mTOR
(mammalian Target of Rampamycin), mTORC1 (mTOR Complex 1), mTORC2 (mTOR Complex 2), S6K1 (Ribosomal protein S6 kinase 1) 4EBP1 (4E-binding
protein 1) Foxo (Forkhead box O), MAFbx (Muscle Atrophy F-box protein), MURF-1
(muscle RING finger-1 protein), LC3 (protein light chain 3). As linhas vermelhas indicam retroalimentação. Linhas pontilhadas indicam efeito indireto.
Fonte: Schiaffino e Mammucari (2011).
Embora o IGF-1 e a insulina sejam os principais ativadores da via sinalizadora que envolve a mTOR, consistentes evidências na literatura indicam que a disponibilidade de aminoácidos, especialmente a leucina, pode também regular a via
IGF-1-Akt/PKB (ANTHONY et al., 2001; JEFFERSON; KIMBALL, 2003; KIMBAL, 2002), mesmo os mecanismos responsáveis por essa ativação não estando completamente elucidados (DELDICQUE; THEISEN; FRANCAUX, 2005), conforme mostrado na FIG. 5.
FIGURA 5 – Hipóteses para a ativação da mTOR por aminoácidos (AA)
Os aminoácidos (AA) poderiam ativar uma quinase específica (mTORK) (1) ou inibir uma proteína fosfatase, como a proteína fosfatase 2A (PP2A), que, quando ativada, defosforila e inativa a mTOR ou alguma proteína-alvo da mTOR na via (2). Os AAs podem interagir com proteínas associadas à mTOR, como a proteína raptor, ou inibir proteínas reguladoras da fosforilação da mTOR, como a proteína quinase AMP ativada (AMPK), ou a formação do complexo TSC1/TSC2 (3). Outra hipótese é de que os AAs podem ativar a mTOR diretamente (4). Fonte: Deldicque, Theisen e Francaux (2005).
Apesar de os aminoácidos serem considerados ativadores potenciais de vias sinalizadoras que culminam com a síntese proteica, é descrito também que fontes proteicas dietéticas podem afetar a fosforilação da mTOR em diferentes magnitudes (ANTHONY et al., 2007; BLOMSTRAND et al., 2006). Neste contexto, as PSL merecem
atenção especial. De fato, elas são conhecidas por favorecerem mais fosforilação da mTOR que outras fontes proteicas, como a soja, por exemplo (ANTHONY et al., 2007), assim como prolongar sua ativação induzida pelo exercício de resistência (HULMI et al., 2009), resultando em maior síntese de proteína miofibrilar (MPS) (MOORE et al., 2009; 2011). Os estudos citados demonstraram o efeito das PSL sobre a ativação/fosforilação da mTOR e mesmo sobre a MPS, entretanto, em nenhum desses trabalhos a combinação exercício de resistência e ingestão das PSL foi capaz de promover significante ganho na massa muscular em comparação ao exercício apenas. Isso sugere que outros mecanismos celulares também podem estar envolvidos, e não apenas a ativação da mTOR, no efeito das PSL em promover crescimento muscular.
Ao mesmo tempo em que o exercício estimula o aumento na taxa de síntese proteica, pode haver concomitante aumento na taxa de degradação (PHILLIPS, 2004), sendo o crescimento muscular o resultado desse balanço. O músculo-esquelético, assim como outros tecidos, contém pelo menos cinco vias metabólicas proteolíticas,
que incluem a via lisossomal, a via Ca2+ dependente, o sistema ubiquitina-
proteassoma (UPS) e os sistemas que envolvem as caspases e as metaloproteinases
(VENTADOUR; ATTAIX, 2006). As vias lisossomal e Ca2+ dependente são conhecidas
por não apresentarem forte impacto sobre a atrofia muscular, uma vez que, com exceção da catepsina L, não são fortemente ativadas em casos de atrofia muscular e parecem não degradar proteínas contráteis (ATTAIX et al., 2003). Da mesma forma, pouco se conhece sobre o significativo efeito das caspases e metaloproteinases no processo de degradação proteico-muscular, podendo a caspase-3 catalisar etapas inicias do processo de degradação da actina (LECKER; GOLDBERG; MITCH, 2006). Por outro lado, consistentes evidências informam que o UPS represente o principal mecanismo pelo qual ocorre a degradação de proteínas musculares (ATTAIX et al., 2003; LECKER; GOLDBERG; MITCH, 2006; PRICE, 2003).
Basicamente, o UPS envolve duas etapas sucessivas. Primeiramente a proteína- alvo é poliubiquitinada e então reconhecida pela subunidade 26S do proteassoma, que degrada a proteína em peptídeos. As proteínas que serão degradadas são assim identificadas pela adição de moléculas de ubiquitina, um processo coordenado por um conjunto triplo de enzimas (FRANCH; PRICE, 2005). A ubiquitina é primeiramente ligada à enzima de ativação da ubiquitina (E1) em uma reação dependente de trifosfato de adenosina (ATP). Em seguida, a ubiquitina é transferida da E1 para a
enzima de conjugação da ubiquitina (E2), via a formação de uma ligação tioester entre a ubiquitina e um resíduo de cisteína da E2. Então, a molécula de ubiquitina é conjugada à proteína-alvo pela ação da ubiquitina-ligases E3, via uma ligação peptídica entre o grupo amino do resíduo de lisina da proteína-alvo e a porção c- terminal de um resíduo de glicina da ubiquitina (PASSMORE; BARFORD, 2004). O processo é repetido até que um mínimo de quatro moléculas de ubiquitina seja ligado covalentemente à proteína-alvo.
Essa clássica formação é então reconhecida pela subunidade 26S de proteassoma como um sinal para a degradação da proteína-alvo. As ubiquitina-ligases E3 são consideradas enzimas-chaves nesse processo, atuando como componentes de reconhecimento do substrato (FRANCH; PRICE, 2005). Entre as diversas E3 ligases existentes (mais de 1.000 tipos), apenas baixo número é transcrito no processo de degradação muscular, com destaque para as ligases, atrogin-1/muscle atrophy F-box protein (MAFbx) e a muscle RING finger-1 protein (MuRF-1), que são conhecidas por serem superexpressas unicamente no músculo em diferentes estados catabólicos (BODINE et al., 2001).
Ambas as proteínas - MAFbx e MuRF-1 - são reguladas por fatores transcricionais da família Forkhead box O (FoxO), que, por sua vez, também estão, assim como a mTOR, sob regulação da via Akt/PKB. Entretanto, a ativação da via Akt/PKB promove a fosforilação dos fatores transcriptacionais da família FoxO, inibindo a degradação proteica. Já a defosforilação do fator FoxO promove sua translocação para o núcleo celular, o que resulta em aumento na expressão das ligases MAFbx e MuRF-1 (LATRES et al., 2005). Semelhantemente, outros fatores, como o estresse oxidativo, por exemplo, parecem induzir a ativação do fator FoxO, conforme mostrado na FIG. 6.
FIGURA 6 – Múltiplos fatores e vias que afetam a sinalização IGF-1- Akt/PKB, destacados em vermelho
Em sentido anti-horário: IGFBPs (IGF binding proteins), ILK (Integrin-linked
kinase), ActRIIB (Acvtin type-2 receptor), Smad 2/3 (mothers against decapentaplegic homolog 2/3 proteins), PLD1 (Phospholipase D), AMPK (AMP- activated protein kinase), TWEAK (TNF-related weak inducer of apoptosis), TNFα
(Tumor necrosis factor alpha), TNFrec (TNF receptor), NFκβ (Nuclear Factor
kappa of activated B cells), PGC1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha), PTEN (Phosphatase and tensin homolog), JNK (c-Jun N-terminal kinase). Fonte: Schiaffino e Mammucari (2011).
O conhecimento acerca dos fatores que regulam a atividade da MAFbx e MuRF- 1 está, mesmo que parcialmente, elucidado, continuando as proteínas-alvo dessa ativação ainda sob intensa investigação (FOLETTA et al., 2011). Análises com leveduras híbridas identificaram o fator de iniciação eIF3-f e o fator de regulação miogênica (MyoD) como substratos da MAFbx, sendo ambas subsequentemente ubiquitinadas e degradas no músculo-esquelético (LAGIRAND-CANTALOUBE et al., 2008; 2009). O fator eIF3-f parece ser um efetor-chave da MAFbx, cujo aumento ou
diminuição de seus níveis está diretamente associado à hipertrofia ou atrofia muscular, respectivamente (LAGIRAND-CANTALOUBE et al., 2008). A MyoD é reconhecida por promover a formação e diferenciação dos miotubos. E a superexpressão da MAFbx resulta na ubiquitinação da MyoD, inibindo a miogenese (LAGIRAND-CANTALOUBE et al., 2009). Além disso, a miogenina parece ser um substrato da MAFbx (JOGO; SHIRAISH; TAMURA, 2009).
Por outro lado, estudos sugerem que a MuRF-1 interage preferencialmente com proteínas estruturais, como a titina (CENTNER et al., 2001), e com proteínas da cadeia pesada da miosina (MHC) (COHEN et al., 2009; FIELITZ et al., 2007). Da mesma forma que o conhecimento científico acerca dessa complexa rede de proteínas que compõem essa via de degradação é ainda incompleto, não estão completamente descritos se fatores nutricionais dietéticos, como os aminoácidos, e mesmo as proteínas afetam essa regulação, especialmente em condições sabidamente conhecidas por alterarem o metabolismo proteico-muscular, como no exercício.
Isto posto, considerando-se a literatura pertinente acerca de suas características e propriedades e seus possíveis efeitos como coadjuvante no processo de crescimento muscular e as lacunas existentes na literatura, o objetivo deste trabalho foi avaliar a utilização das PSL como fonte proteico-dietética sobre o crescimento muscular de ratos submetidos a um programa de treinamento de resistência com pesos, assim como avaliar se o crescimento muscular gerado pelo exercício pode ser mediado também pelas propriedades antioxidantes das PSL.