PCR em tempo real

Os efeitos do exercício de resistência na presença ou ausência das PSL como fonte proteico-dietética sobre a expressão gênica da mTOR, MuRF-1 e MAFbx são apresentadas nos GRÁF. 7 e 8. O exercício afetou a expressão da mTOR de forma diferente, de acordo com o tipo de proteína ingerida pelos animais. Ratos CE apresentaram redução na expressão da mTOR, o que não foi visto nos animais do grupo WE, que exibiram expressão semelhante à dos grupos CS e WS (GRÁF. 7).

A expressão gênica das E3 ligases MuRF-1 e MAFbx foram diferentemente alteradas pela presença do exercício e PSL. Expressão gênica da MuRF-1 foi significativamente reduzida nos animais exercitados (GRÁF. 8). Por outro lado, a

A ti vi da de da C at al ase he pá ti ca (U /m g p ro te in ) 0 10 20 30 40 50

CS

CE

WS

WE

expressão da MAFbx não foi afetada pelo exercício, mas significativamente reduzida nos animais que ingeriram as PSL (WS e WE) (GRÁF. 7).

GRÁFICO 7 – Expressão gênica da mTOR de ratos sedentários (barras pretas) ou exercitados (barras cinzas) alimentados com dieta controle (CS e CS) ou PSL (WS e WE).

Os resultados estão expressos como média ± DP; n=4-6 por grupo; valores estatisticamente diferentes estão marcados com letras diferentes apenas quando interação significativa fora observada.

m T O R ( % d o c on tr ol e) 0 25 50 75 100 125 150 175 200

CS

CE

WS

WE

GRÁFICO 8 – Expressão gênica da MuRF-1 de ratos sedentários (barras pretas) ou exercitados (barras cinzas) alimentados com dieta controle (CS e CS) ou PSL (WS e WE)

Os resultados estão expressos como média ± DP; n=4-6 por grupo.

M u R F -1 ( % d o con tr ol e) 0 25 50 75 100 125

CS

CE

WS

WE

GRÁFICO 9 – Expressão gênica da MAFbx de ratos sedentários (barras pretas) ou exercitados (barras cinzas) alimentados com dieta controle (CS e CS) ou PSL (WS e WE)

Os resultados estão expressos como média ± DP; n=4-6 por grupo; valores estatisticamente diferentes estão marcados com letras diferentes apenas quando interação significativa fora observada. M A F b x (% d o con tr ol e) 0 25 50 75 100 125 150

CS

CE

WS

WE

6 DISCUSSÃO

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a utilização das PSL como fonte proteico-dietética sobre o crescimento muscular, a atividade antioxidante e a expressão gênica de proteínas do metabolismo proteico-muscular de ratos exercitados. As fontes proteicas utilizadas, caseína (controle) e PSL, tiveram sua composição centesimal determinada para que as dietas confeccionadas apresentassem composição centesimal semelhante, com alterações apenas na fonte proteica. Apesar de tais informações estarem presentes na rotulagem nutricional dos mesmos, o fato de se estar trabalhando sob condições experimentais controladas, pequenas diferenças na composição dos produtos poderia inferir, mesmo que minimamente, nos resultados encontrados.

Observou-se que os valores encontrados na análise do produto comercial composto de PSL foram diferentes daqueles declarados na rotulagem nutricional. O teor de proteínas, apesar de abaixo dos valores de rotulagem, encontram-se na

tolerância de 20% estabelecida na RDC no _{360 da ANVISA (2003), fato não ocorrido}

para o teor de sódio, muito superior aos valores declarados no rótulo, acima da tolerância de 20%. Em relação à caseína, valores obtidos nas análises revelam adequação aos disponíveis na rotulagem nutricional.

Exercícios de alta intensidade podem levar à exacerbada produção de ROS, podendo causar distúrbio no balanço pró/antioxidante, e possivelmente ao estado de estresse oxidativo. Consequentemente, tem sido reportado que nessas condições o exercício pode produzir disfunções teciduais importantes, como a deficiência na contração muscular e na produção da força motora (JACKSON, 2009; POWERS: JI; LEEUWENBERG, 1999; REID; KHAWLI; MOODY, 1993).

Na literatura não está bem esclarecido se o estresse oxidativo pode ocasionar alteração da síntese proteico-muscular induzida pelo exercício de resistência com pesos, tampouco se as PSL podem afetar positiva ou negativamente essas adaptações. Ao avaliar o efeito do exercício e das PSL sobre os biomarcadores da oxidação proteica e lipídica nos tecidos muscular e hepático, verifica-se que as PSL preveniram a oxidação proteico-muscular induzida pelo exercício com pesos, conforme pode ser demonstrado pelas concentações de PC (GRÁF. 1).

Os exercícios com pesos são conhecidos por levarem à oxidação de proteínas plasmáticas (DEMINICE et al., 2010; HUDSON et al., 2008; LIU et al., 2005; RAMEL; WAGNER; ELMADF, 2004). Hudson et al. (2008) referiram aumento na concentração plasmática de PC imediatamente após e 60 minutos após sessão de exercícios com pesos em indivíduos treinados. Bloomer et al. (2007) também ressaltaram o mesmo aumento depois de uma única sessão de exercício em indivíduos de mesma natureza. Entretanto, esses autores não mensuraram a concentração muscular de PC, em que um aumento pode refletir possíveis danos às estruturas celulares (JACKSON, 2009; POWERS; JI; LEEUWENBURGH, 1999; REID; KHAWLI; MOODY, 1993).

Embora o estresse mecânico, como o produzido pela contração muscular, seja considerado uma das principais causas do dano muscular induzido pelo exercício, é possível que o estresse oxidativo também possa induzir o aparecimento desse dano (ARMSTRONG 1990), podendo alterar o metabolismo proteico-muscular em resposta a estímulos anabólicos (MARZANI et al., 2008; MOSONI et al., 2010).

Em contraste ao que fora constatado no músculo gastrocnêmio, o exercício reduziu os níveis de PC no fígado dos ratos controles (CE) e as PSL foram capazes de manter níveis similares de PC em animais sedentários ou mesmo exercitados (GRÁF. 2). Esses resultados sugerem que as PSL podem prevenir o dano oxidativo em proteínas musculares causado pelo exercício físico e inibir a oxidação de proteínas hepáticas, independentemente do exercício.

De forma semelhante, os níveis de TBARS, um biomarcador conhecido da lipoperoxidação (DRAGSTED, 2008), também se elevam constantemente após exercícios dessa natureza (LIU et al., 2005). No entanto, no presente estudo, o exercício de resistência com pesos não aumentou as concentrações musculares e hepáticas de TBARS em ambos os grupos exercitados (GRÁF. 3 e 4), ao passo que o tratamento com as PSL reduziu essas concentrações, significando que as PSL mediaram também proteção muscular e hepática contra a lipoperoxidação, independentemente do exercício.

Concomitantemente aos efeitos promovidos pelo exercício e pelas PSL sobre a oxidação de proteínas e lipídeos musculares e hepáticos, os resultados mostraram que o protocolo de exercício de resistência com pesos gerou diferenças significativas no ganho de peso corporal e nos músculos gastrocnêmio e ELD dos animais recebendo dieta controle ou com as PSL (TAB. 3). Ratos exercitados do grupo-

controle (CE) apresentaram, após oito semanas de treinamento, menos ganho de peso corporal e muscular, fato comumente observado em animais submetidos a programas de exercícios de resistência (BARAUNA et al., 2005; MORIFUJI et al., 2005b).

Interessantemente, as PSL, quando oferecidas em conjunto ao treinamento, resultaram em animais com ganhos de peso corporal e musculares similares aos dos grupos CS e WS, mas estatisticamente superiores aos do grupo CE. Diferenças na composição aminoacídica das proteínas (caseína e PSL) não podem exclusivamente explicar os distintos ganhos de peso corporal e muscular, uma vez que a caseína também fornece os requerimentos mínimos aminoacídicos da dieta de roedores (QUADRO 4). Além disso, o fato de o ganho de peso ter sido estatisticamente similar entre os grupos CS e WS corrobora essa afirmativa.

De fato, a caseína é uma proteína de alto valor nutricional, sendo utilizada como referência para a avaliação biológica de proteínas (PELLET; YOUNG, 1980). Em contrapartida, as PSL exibem deficiência na concentração dos aminoácidos fenilalanina e metionina. Porém, estudos prévios de nosso laboratório demonstraram que produtos comerciais compostos de PSL preenchem os requerimentos biológicos de forma mais eficiente que a caseína (HARAGUCHI et al., 2010a). Somada à sua alta digestibilidade, coeficiente de utilização proteica e razão proteica líquida, os biopeptídeos presentes nas PSL podem afetar significativamente a utilização das proteínas para o crescimento, o que pode parcialmente explicar também as diferenças no ganho de peso corporal e muscular entre os grupos CE e WE.

Estudos têm comprovado que os aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA), particularmente a leucina, são ativadores independentes da síntese proteico- muscular (ANTHONY et al., 2001; JEFFERSON; KIMBALL, 2003; KIMBALL et al., 2002). Em comparação com a caseína, as PSL caracterizam-se por serem mais rapidamente digeridas e absorvidas, levando à elevação plasmática da leucina de forma rápida e aguda, com mais intensidade que a caseína, podendo favorecer a síntese proteica após o exercício de resistência (TANG et al., 2009). Além disso, a rápida elevação plasmática de aminoácidos insulinotrópicos favorecem a secreção de insulina pelas células beta do pâncreas, estimulando assim a captação celular de aminoácidos ativadores da síntese protéica, como a leucina.

Realmente, a literatura tem referenciado que as PSL apresentam a capacidade de estimular a síntese proteica e o desenvolvimento de força durante o exercício de

força (HAYES; CRIBB, 2008; TIPTON et al., 2007), porém os mecanismos associados a esses efeitos não estão ainda totalmente elucidados. Observações in loco durante a realização das sessões de exercício, apesar de subjetivas, evidenciaram os efeitos favoráveis das PSL na adaptação ao treinamento, como na evolução de cargas levantadas e na desenvolutura dos saltos.

De forma alternativa, é descrito que o estresse oxidativo induzido pelo exercício de resistência pode gerar, entre outras consequências, alterações em proteínas e lipídeos celulares, assim como no DNA (LIU et al., 2005; POWERS; JI; LEEUWENBURGH, 1999; UCHIYAMA et al., 2006), resultando em diminuição da função biológica celular e, possivelmente, no efeito anabólico de nutrientes, como o da leucina (MARZANI et al., 2008; MOSONI et al., 2010). Marzani et al. (2008) enfatizaram que a suplementação com complexo antioxidante composto da mistura de rutina, zinco, selênio e vitaminas A e E recuperou a capacidade da leucina em estimular a síntese proteica em músculos de ratos idosos.

Estudos in vitro têm demonstrado que o estresse oxidativo pode prejudicar tanto a ativação da via sinalizadora transportadora de glicose induzida pela insulina, como ativar a via sinalizadora do controle celular em resposta a citocinas e estresse (MADDUX et al., 2001). Entretanto, ainda não está descrito o exato mecanismo pelo qual os RONS poderiam prejudicar a síntese proteico-muscular.

Marzani et al. (2008) falharam em demonstrar que a diminuição do efeito anabólico da leucina em ratos idosos estava associada a alterações oxidativas na proteína S6K, uma proteína ribossomal ativada pela mTOR. Além disso, esses autores não informaram efeito evidente da suplementação com o composto antioxidante sobre a massa muscular dos animais avaliados. Esse estudo não investigou esses parâmetros em associação com o exercício físico.

Na presente investigação, foi demonstrado claramente que os ratos exercitados do grupo WE apresentaram ganho de peso corporal e muscular estatisticamente superior ao dos animais do grupo CE, concomitante a uma forte redução nos produtos resultantes da oxidação proteica e lipídica tecidual, evidenciado pelos níveis de PC e TBARS. Esses resultados sugerem que as diferenças no ganho de peso corporal e muscular podem ter sido mediadas, em parte, pela redução do dano oxidativo local (no músculo) como no fígado. Possivelmente um

efeito sinérgico entre as propriedades antioxidantes e o conteúdo de leucina das PSL tenha afetado positivamente o crescimento muscular.

A quantificação do mRNA de proteínas sinalizadoras do metabolismo proteico- muscular, especificamente mTOR, MAFbx e MuRF-1, revelou que o exercício de resistência afetou a expressão gênica diferentemente quando em presença ou não das PSL. Já está descrito que o efeito anabólico da leucina reside na sua capacidade de ativar proteínas da via IGF-1-Akt/PKB, em especial a mTOR (ANTHONY et al., 2001; JEFFERSON; KIMBALL, 2003; KIMBALL et al., 2002). No presente estudo, o exercício e as PSL afetaram a expressão gênica da mTOR, resultando em ganhos distintos de peso corporal e muscular, de forma semelhante ao que fora observado com os produtos da oxidação. O exercício de resistência com pesos promoveu redução na expressão gênica da mTOR nos animais controles, ao mesmo tempo em que houve maior concentração de PC no músculo gastrocnêmio desses animais, assim como menos ganho de peso corporal e muscular. Por outro lado, as PSL inibiram a redução na expressão da mTOR induzida pelo exercício (GRÁF. 7), ao mesmo tempo em que preveniram a oxidação de proteínas musculares (GRÁF. 1) e geraram animais com ganho de peso corporal e muscular estatisticamente mais acentuados que os animais CE (TAB. 3).

Na literatura, o exercício de resistência em combinação com a ingestão de aminoácidos, especialmente a leucina, ou mesmo com a ingestão das PSL é conhecido por aumentar a ativação da mTOR (DREYER et al., 2008; MOORE et al., 2009; 2011). Seus efeitos sobre a expressão gênica, contudo, são menos conhecidos, assim como se essa expressão pode ser afetada pelo excesso de ROS. Recentemente, tem-se sugerido que exercícios de baixa e moderada intensidade produzem quantidade baixa a moderada de ROS, sendo essas substâncias, em quantidades moderadas, essenciais para a ativação de enzimas, compostos antioxidantes e fatores de crescimento (GOMEZ-CABRERA; DOMENECH; VINA, 2008; MAHADEV et al., 2001; RISTOW et al., 2009). Nessa condição, ROS poderia ativar proteínas da via IGF-1-Akt/PKB, inclusive a mTOR (HANDAYANINGSIH et al., 2011).

Exercícios de alta intensidade, assim como o utilizado no presente trabalho, exacerbam a produção de ROS, que aumenta a possibilidade de ocorrer ataque oxidativo em estruturas celulares, levando a possível estado de estresse oxidativo, com consequências para a contração muscular e a produção da força motora

(JACKSON, 2009; POWERS; JI; LEEUWENBERG, 1999; REID; KHAWLI; MOODY et al. 1993). Esse comportamento corrobora o princípio da “hormese”, efeito que se caracteriza pela relação do tipo dose-resposta, em que baixas doses de ROS são estimulatórias e alta dose, inibitória (CALABRESE; BALDWIN, 2003). Mesmo não sendo descrito que o estresse oxidativo pode inibir a expressão gênica da mTOR em células musculares, é possível que isso aconteça, como verificado em células neuronais PC12 de ratos e neurônios primários de murinos (CHEN et al., 2011). Esses

autores informaram que o H2O2 em doses >0,5 mmol/L para células PC12 e >1

mmol/L para os neurônios inibiram a fosforilação da mTOR, p70S6 kinase (S6K1) e da proteína de ligação 4EBP-1. Detectaram, também, que o pré-tratamento das células com o antioxidante N-acetil-L-cisteina (NAC) (5 mmoL/L) bloqueou o efeito

promovido pelo H2O2. Desta forma, os resultados do presente trabalho sugerem que,

por melhorarem a atividade antioxidante, as PSL podem inibir a redução da expressão gênica da mTOR induzida pelo exercício de resistência, favorecendo, consequentemente, o ganho de peso corporal e muscular.

Outro resultado importante que difere o presente trabalho de outros publicados na literatura (HULMI et al., 2009; MOORE et al., 2011) reside no fato de que estudos citados tenham noticiado que a combinação exercício de resistência e PSL promova mais ativação da mTOR, mas nenhum deles acusou significativo ganho de massa muscular decorrente dessas adaptações (HULMI et al., 2009; MOORE et al., 2009; 2011). Hulmi et al. (2009) informaram que a fosforilação da mTOR permaneceu aumentada uma a quatro horas após indivíduos realizarem uma sessão de exercícios de resistência com pesos e serem suplementados com 15 g de PSL imediatamente antes e após a sessão de exercício. Apesar disso, a massa muscular não diferiu entre os grupos placebo e suplementado após 10 semanas e mesmo após 21 semanas de treinamento.

Segundo Moore et al. (2011), a ingestão de 25 g de PSL após uma sessão única de exercícios com pesos aumentou a taxa de síntese proteico-muscular, mediada pela fosforilação das proteínas p70s6k1 e eEF2, quando em comparação com o músculo em repouso, mas não em comparação com o grupo placebo. No presente trabalho, os ratos do grupo WE exibiram maior expressão gênica da mTOR que os animais do grupo CE, concomitante a menos oxidação de proteínas musculares e a mais ganho de peso corporal e muscular. Hulmi et al. (2009) e Moore et al. (2011) não avaliaram a

expressão gênica da mTOR, tampouco a oxidação de proteínas musculares, mas há importante característica em seus trabalhos que os difere do presente estudo. Esses autores utilizaram as PSL como forma de suplementação, com 15 g e 25 g de PSL para indivíduos com aproximadamente 75 e 85 kg, respectivamente. Já no presente estudo, as PSL foram utilizadas em substituição integral à caseína, sendo, portanto, a fonte proteico-dietética exclusiva. Essa característica poderia também explicar, em parte, as diferenças no ganho muscular, uma vez que a quantidade e o tipo de proteína podem influenciar a síntese proteica (BOIRIE et al., 1997; DANGIN et al., 2003; LEMON, 1991; TARNAPOLSKY; MacDOUGALL; ATKINSON, 1988; WOLFE, 2000). Essa hipótese pode ainda ser corroborada por estudos prévios de nosso laboratório, em que se identificou que somente a substituição integral da caseína pelas PSL foi capaz de afetar significativamente a utilização da proteína para fins de crescimento corporal, mas a substituição parcial de 30% não foi suficiente para gerar as mesmas diferenças (HARAGUCHI et al., 2010a).

Assim, os resultados do presente trabalho sugerem que o crescimento muscular gerado pela ingestão das PSL em combinação com o exercício de resistência parece ser mediado, em parte, não apenas por mais fosforilação/ativação, mas também por maior expressão gênica da mTOR, e que essas adapatações parecem ser dependentes da quantidade de PSL na dieta.

Existem outras características inerentes às PSL que poderiam também explicar os resultados encontrados. As PSL apresentam padrões distintos de digestão e absorção, incluindo rápida velocidade de esvaziamento gástrico, permitindo que sejam rapidamente absorvidas, gerando concentrações pós-prandiais de leucina em torno de três vezes superior àquelas produzidas pela caseína (BOIRIE et al.; 1997; DANGIN et al., 2003). Por isso, o rápido aumento na concentração plasmática da leucina pode ativar síntese proteica, via expressão gênica e ativação da via IGF-1- Akt/PKB, em especial a mTOR. Os resultados encontrados e mesmo os dados da literatura corroboram a hipótese de que a leucina é a principal responsável por esses efeitos, mas é provável que não seja a única.

Norton et al. (2009) propõem que a alta concentração plasmática de leucina produzida pelas PSL parece não ser suficiente para sustentar elevações na taxa de MPS. Comparando o efeito da caseína e PSL sobre a MPS, esses autores concluíram que a leucina é o fator primário para a sinalização da mTOR e estimulação da MPS

pós-prandial (zero a 90 min), mas não para a reposta posterior a esse período de tempo (90 a 300 min). Esses autores salientaram que essa resposta posterior não tem suporte das concentrações de leucina ou mesmo da fosforilação da mTOR, considerando que a ativação, mas não a duração da MPS, é proporcional ao conteúdo de leucina e que outros mecanismos moleculares, que não apenas a ativação da mTOR, podem estar envolvidos. De fato, diferenças no conteúdo de leucina da caseína (controle) e PSL não podem por si sós explicar os distintos ganhos de peso corporal e muscular dos animais dos grupos CE e WE (QUADRO 4).

Entretanto, como previamente descrito (vide secção 1.4.2), o crescimento muscular é resultado do balanço proteico gerado pela diferença entre a taxa de síntese e a taxa de degradação proteica (PHILLIPS, 2004), degradação esta controlada principalmente pelo UPS (ATTAIX et al., 2003; LECKER; GOLDBERG; MITCH, 2006; PRICE, 2003). Neste sistema, as ligases E3 MAFbx e a MuRF-1 são consideradas as enzimas-chave na ubiquitinação de proteínas musculares, agindo como componentes de reconhecimento das proteínas que serão ubiquitinadas (FRANCH; PRICE, 2005). Os resultados evidenciam que o exercício de resistência reduziu significativamente a expressão gênica da MuRF-1 (GRÁF. 8).

Diversos estudos demonstraram que uma única sessão de exercícios de resistência pode levar à superexpressão da MuRF-1 (MASCHER et al., 2008; YANG; JEMIOLO; TRAPPE, 2006). No entanto, consistentes pesquisas (CHURCHLERY et al., 2007; MASCHER et al., 2008; ZANCHI et al., 2009) mostram que o treinamento de resistência por várias semanas, assim como o utilizado no presente estudo, pode diminuir a expressão gênica da MuRF-1, provavelmente em resposta ao fenômeno conhecido como “adaptação ao treinamento de resistência” (ZANCHI et al., 2009), o que pode contribuir também para diminuir a taxa de degradação proteico-muscular, resultando em balanço proteico positivo e, consequentemente, aumento da massa muscular.

Os resultados revelaram que a expressão da MAFbx foi diminuída nos animais que ingeriram as PSL, independentemente do exercício. Até o presente momento, não há relatos na literatura acerca dos efeitos das PSL em associação ao exercício físico de resistência com pesos sobre a expressão do mRNA das ligases MuRF-1 e MAFbx, nem se essa expressão estaria associada à oxidação de proteínas e lipídeos teciduais. Superexpressão da MAFbx resulta na poliubiquitinação da MyoD, uma proteína que

pertence à família das proteínas conhecidas como fatores regulatórios da miogenia (MRF) (TINTIGNAC et al., 2005) e que, quando superexpressa, promove diferenciação muscular esquelética em resposta a estímulos hipertróficos (ISHIDO; KAMI; MASUHARA, 2004; KITZMANN et al., 1998). Dessa forma, a redução na expressão da MAFbx pode prevenir a ubiquitinação da MyoD e, consequentemente, a degradação muscular, como recentemente encontrado em estudos com miotubos primários e fibras musculares esqueléticas de camundongos (LAGIRAND-CANTALOUBE et al.,