Membranas de Osmose Inversa

2.2.3.1. Sistema Piloto de Osmose Inversa e Amostragem das Membranas O sistema piloto de filtração por osmose (Membrane Specialists LLC) foi implementado no Laboratório de Celulose e Papel da Universidade Federal de Viçosa e é composto por um módulo com seis membranas tubulares substituíveis (PCI Membranes) dispostas em contínuo (Figura 1). O tipo de filtração é in-out e a pressão inicial aplicada foi de 80 psi com um fluxo de 4 L/h.m2 de superfície da membrana. A partir deste sistema piloto, foram retiradas as membranas para o estudo dos biofilmes.

Antes de o sistema piloto funcionar com o efluente, para verificar o seu funcionamento, ele ficou ligado por 15 dias com água destilada. Após este período, a água destilada foi substituída pela água de alimentação denominada AO2.

No primeiro tempo de análise da membrana, i.e. ao 6º dia, foram retiradas membranas das duas extremidades (1ª e 6ª membranas) a fim de verificar se houve influência do fluxo contínuo do efluente na quantidade de biofilme aderido à membrana em função da sua posição no sistema (primeira e última membranas, conforme fluxo contínuo do efluente) (Figura 1).

Amostragem

Figura 1. Posição de cada membrana no sistema piloto de filtração e local amostrado na membrana para análise.

45 O tempo de amostragem das membranas foi seguido de acordo com o cronograma da Tabela 1. As análises foram feitas em duas posições da membrana: extremidade e meio.

As membranas foram retiradas, cortadas em pedaços de aproximadamente 10 cm e armazenadas em recipientes esterilizados, contendo tampão Fosfato Salino (PBS), congeladas e imediatamente transportadas para os laboratórios da Divisão de Recursos Microbianos (CPQBA/UNICAMP) para a realização das análises (Figura 2).

Figura 2. Fotos ilustrativas das membranas coletadas no 9º, 12º, 14º e 17º de funcionamento do sistema piloto. O aumento da intensidade da coloração representa o aumento do biofilme formado sobre as membranas.

Tabela 1. Cronograma de amostragem das membranas do sistema piloto.

Tempo Posição Observação Data da Coleta

6 dias Extremidade 1ª e 6ª membranas 19/09/2012

9 dias Extremidade - 22/09/2012 9 dias Meio - 12 dias Extremidade - 25/09/2012 12 dias Meio - 14 dias Extremidade - 27/09/2012 14 dias Meio - 17 dias Extremidade - 29/09/2012 17 dias Meio -

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2.2.3.2. Extração de DNA total dos biofilmes das Membranas de Osmose Inversa

As membranas armazenadas em tampão PBS, provenientes do sistema piloto, foram descongeladas e, em fluxo laminar, foram cortadas em pequenas porções. Cada porção foi transferida para micro-tubo contendo 1 mL de tampão PBS. Após este processo, as amostras de membranas contendo os biofilmes foram submetidas à extração do DNA total, que seguiu o protocolo de Groβkopf et al. (1998) e Neria- Gonzáles et al. (2006), detalhado anteriormente.

2.2.3.3. Amplificação de Genes RNAr 16S para o DGGE das Membranas de Osmose Inversa

Para a realização da técnica de DGGE, foi utilizado o DNA extraído a partir do biofilme formado nas membranas de osmose inversa, como detalhado anteriormente.

As amostras de DNA foram utilizadas para amplificação da região variável V3 do gene RNAr 16S através da utilização do par de primers 341f-GC Clamp (5'- CCTACGGGAGGCAGCAG-3') e 907r (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') (Muyzer & Ramsing, 1995). As reações de PCR foram realizadas com volume final de 50 μL contendo tampão de PCR (Invitrogen) 1X, 3,0 mM de MgCl2, 0,2 μM de dNTP Mix

(Invitrogen), 0,5 μM de cada primer, 4,0 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen), e cerca de 5,0 μL da amostra de DNA (~ 50 ng). A amplificação foi realizada em termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystem) e o programa de amplificação consistiu em: 1 ciclo de desnaturação a 94 °C por 5 minutos; 35 ciclos a 94°C por 1 minuto, 58°C por 1 minuto e 72°C por 2 minutos e 10 ciclos a 58°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto. A amplificação foi confirmada em gel de agarose 1%, corado com 0,02 μL/mL SYBR Safe 10.000X em DMSO (Invitrogen).

2.2.3.4. DGGE das Membranas de Osmose Inversa e Excisão de Bandas

Os produtos da amplificação do DNA total obtido a partir do biofilme formado nas membranas de osmose inversa foram submetidos à metodologia denominada Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis (DGGE) para avaliação da dinâmica de

47 formação do biofilme através da comparação entre as comunidades microbianas presentes em cada membrana.

O sistema de DGGE empregado foi o INGENY UPhor (Ingeny) e o gradiente de desnaturação utilizado foi de 40-60%. A eletroforese foi realizada por 16 horas a 100 V. O gel foi corado com SYBR Safe 10.000X in DMSO (Invitrogen) e depois visualizado em transiluminador UV e fotografado utilizando o equipamento ImageQuant (GE Healthcare).

Após a realização dos géis de DGGE, algumas bandas foram excisadas do gel. Cada banda foi separada em um micro-tubo de 0,6 mL e eluída em água ultra-pura esterilizada. Estes tubos foram armazenados a 4ºC por 24 horas e então congelados. A partir disso, diluições (1:1000) foram feitas e as bandas foram utilizadas para uma nova amplificação, através da utilização dos primers 341f-GC e 907r. Os produtos desta amplificação foram novamente aplicados em eletroforese DGGE para averiguação da pureza das bandas. Uma vez verificada a pureza, as bandas foram utilizadas para clonagem, sequenciamento e análises filogenéticas.

2.2.3.5. Construção de Biblioteca de Genes RNAr 16S e Clonagem de Bandas Excisadas

As bandas excisadas do DGGE foram utilizadas para a amplificação através dos primers 341f (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') e 907r (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG- 3') (Muyzer & Ramsing, 1995). As reações seguiram as mesmas condições para a amplificação de fragmentos de genes RNAr 16S utilizados nos géis de DGGE (item 2.2.3.3). A partir disso, os fragmentos foram purificados e utilizados para clonagem, juntamente com os fragmentos de DNA amplificados provenientes das membranas.

Todos os amplicons obtidos foram ligados em vetor pGEM-T (pGEM-T Easy Vector System, Promega), segundo as especificações do fabricante, e clonados de acordo com os parâmetros especificados anteriormente para a construção de biblioteca de genes RNAr 16S (item 2.2.2.10).

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2.2.3.6. Análise das Bibliotecas Gênicas

Após a montagem dos contigs, realizada conforme descrito anteriormente (item 2.2.2.8), eles foram utilizados para análises de diversidade e filogenéticas.

As afiliações filogenéticas dos contigs foram determinadas com a utilização da rotina Classifier (RDP - Ribosomal Database Project, Wisconsin, USA, http://www.http://rdp.cme.msu.edu/), sendo confirmadas através da rotina BLASTn (http://www.ncbi.nem.nih.gov).

O programa Mothur (Schloss et al., 2009) foi utilizado para as análises de rarefação e estimativa de diversidade e riqueza (parâmetros ACE, Chao1, Shannon e Simpson), utilizando a abordagem baseada em Unidades Taxonômicas Operacionais (OTUs).