RAPD dos Isolados da Água de Alimentação

Os isolados da água de alimentação submetidos a analises por RAPD foram: AO2-05, AO2-07, AO2-08, AO2-09, AO2-11, AO2-12, AO2-14, AO2-15, AO2-17, AO2- 18, AO2-23, AO2-31, AO2-34, AO2-36 (identificados como Pseudomonas sp.), AO2-13, AO2-19 (identificados como Rheinheimera chironomi), e AO2-30 e AO2-37 (identificados como Brevundimonas sp.).

Após análise dos resultados foi possível verificar o número de perfis distintos dentre os isolados com mesma identificação (Tabela 4).

Tabela 4. Número de perfis de RAPD dos isolados bacterianos.

Identificação com base no gene

RNAr 16S Isolados

Número de Perfis

Pseudomonas sp.

AO2-05, AO2-07, AO2-08; AO2-09, AO2-11, AO2-12, AO2-14, AO2-15, AO2-17, AO2-18, AO2-23, AO2-31,

AO2-34, AO2-36

14

Rheinheimera chironomi AO2-13, AO2-19 2

Brevundimonas sp. AO2-30, AO2-37 2

Dentre os 14 isolados que foram identificados como Pseudomonas sp., e que não puderam ser identificados em nível de espécie após as análises filogenéticas (Figuras 3, 4 e 5), todos apresentaram perfis de RAPD distintos. O mesmo ocorreu com os isolados identificados como Brevundimonas sp. e Rheinheimera chironomi.

2.3.4. DGGE das Membranas de Osmose Inversa e Excisão de Bandas As amostras de membranas do sistema piloto de osmose inversa: Membrana 1 com 6 dias de permanência no sistema (M1-6D), membrana 6 – 6 dias (M6-6D), membranas com 9 dias no sistema, das porções meio e extremidade (9D-Meio e 9D-

55 Extremidade), membranas de 12 dias – meio e extremidade (12D-Meio e 12D- Extremidade), 14 dias – meio e extremidade (14D-Meio e 14D-Extremidade) e as membranas de 17 dias – meio e extremidade (17D-Meio e 17D-Extremidade) foram analisadas por DGGE para averiguar a diversidade bacteriana entre elas em relação ao espaço e tempo.

Todas as amostras foram analisadas em triplicata em géis com gradiente de desnaturação de 40-60% (Figuras 7 e 8).

Figura 7. DGGE das amostras de membranas de osmose inversa aos 6, 9 e 12 dias. Os quadrados numerados de 1 a 13 representam as bandas excisadas do gel para análises posteriores (M: Marcador 100 pares de bases – Invitrogen).

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Figura 8. DGGE das amostras de membranas de osmose inversa aos 12, 14 e 17 dias. As flechas indicam as amostras que foram selecionadas para a construção de bibliotecas gênicas). (M: Marcador 100 pares de bases – Invitrogen).

A análise dos perfis de DGGE permitiu acompanhar a dinâmica de formação do biofilme e sugeriu que o fluxo da água dentro do sistema não influencia a formação de biofilmes nas membranas posicionadas no começo ou no fim da filtração, já que a primeira membrana (M1-6D) e a última membrana (M6-6D) não apresentaram perfis diferentes no gel. Além disso, conforme as diferentes porções da extensão das membranas foram analisadas (meio e extremidade), foi possível observar que a diversidade também não se altera ao longo da membrana, ou seja, a comunidade microbiana é uniforme na extensão do sistema.

Membran a 12 dias Extremidad e Membran a 14 dias Meio Membran a 14 dias Extremidad e Membran a 17 dias Meio Membran a 17 dias Extremidad e M M

57 Porém, foi possível observar a influência do fator tempo na formação dos biofilmes. As membranas que permaneceram menos tempo dentro do sistema (6 e 9 dias) apresentaram um perfil menos complexo, i.e. um menor número de bandas foi observado em comparação com as membranas que permaneceram mais tempo no sistema (12, 14 e 17 dias), sugerindo uma variação da diversidade ao longo do tempo analisado.

Em função da baixa diversidade observada nos tempos iniciais (6 e 9 dias), 13 bandas visualizadas no perfil destas membranas foram selecionadas, excisadas, clonadas e sequenciadas. O seqüenciamento dos clones resultou em 23 sequências e, a partir da sua análise, foram identificados micro-organismos pertencentes aos filos Proteobacteria e Actinobacteria. Apesar da pequena diversidade de filos, 10 gêneros distintos foram identificados: Escherichia/Shigella (17%), Novosphingobium (9%), Acidovorax (9%), Shinella (9%), Methylibium (9%), Sphingopyxis (9%), Methyloversatilis (9%), Microbacterium (4%), Bosea (4%) e Beggiatoa (4%). Além dos gêneros identificados, 17% das sequências foram afiliadas com similaridade maior que 95% a micro-organismos ainda não cultivados (Figura 9).

Figura 9. Relação dos gêneros identificados a partir das bandas excisadas do DGGE e a porcentagem de cada um em relação ao total de 23 sequências analisadas.

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Além das informações a respeito dos gêneros identificados a partir da excisão das bandas dos géis de DGGE, é importante ressaltar também a relação entre cada clone com a membrana da qual a banda foi excisada. Assim, a relação entre os dias de permanência de cada membrana no sistema e o gênero identificado pode ser estabelecida (Tabela 5).

A banda 1 foi excisada da membrana M6-6D e os seus clones foram identificados como pertencentes aos gêneros Methylibium e Escherichia/Shigella. A banda 2 estava na mesma posição do gel que a banda 1, mas foi excisada da amostra relativa à membrana 9D – Extremidade; e os gêneros identificados foram Methylibium, Shinella e Microbacterium.

As bandas 3 e 4 também possuíam a mesma posição no gel, mas pertenciam às amostras das membranas 9D-Meio e 9D-Extremidade, respectivamente. Os clones foram afiliados a micro-organismos não cultivados e aos gêneros Bosea e Escherichia/Shigella. As bandas 5 e 6, equivalentes no gel, tiveram clones identificados como micro-organismos não cultivados e pertencentes aos gêneros Sphingopyxis, e Beggiatoa. Estas bandas foram excisadas das amostras 9D-Extremidade e 12D-Meio.

A banda 7 tem como correspondente no gel a banda 8, que não teve clones sequenciados. Dentre os clones identificados para esta banda, os gêneros Escherichia/Shigella e Shinella foram os afiliados com mais de 95% de similaridade. A Banda 9, referente à membrana 9D-Meio, não teve nenhuma banda equivalente excisada do gel, e seus clones foram identificados como pertencentes ao gênero Novosphingobium.

A banda 10, pertencente à amostra M1-6D, possui equivalência com a banda 11, que não teve clones sequenciados. Os clones dessa banda foram afiliados com micro- organismos não cultivados e também com o gênero Methyloversatilis. Da mesma maneira, a banda 12, da amostra M6-6D, também teve um clone identificado como Methyloversatilis; e a sua equivalente, a banda 13, excisada da amostra 9D – Extremidade, teve seus clones com afiliação aos gêneros Escherichia/Shigella e Acidovorax.

Em resumo, as amostra M1-6D (Bandas 7 e 10) e M6-6D (Bandas 1 e 12) tiveram os gêneros Methyloversatilis, Escherichia/Shigella e Shinella identificados. A

59 Gênero Membrana 1 6 Dias Membrana 6 6 Dias Membrana 9D Meio Membrana 9D Extremidade Membrana 12D Meio

Banda 1 - Clone 1 Methylibium

Banda 1 - Clone 2 Escherichia/Shigella

Banda 2 - Clone 1 Methylibium

Banda 2 - Clone 2 Shinella

Banda 2 - Clone 3 Microbacterium

Banda 3 - Clone 2 Bosea

Banda 3 - Clone 3 Escherichia/Shigella

Banda 4 - Clone 1 Não cultivado Banda 4 - Clone 2 Não cultivado Banda 5 - Clone 1 Sphingopyxis

Banda 5 - Clone 3 Sphingopyxis

Banda 6 - Clone 1 Beggiatoa

Banda 6 - Clone 2 Não Cultivado Banda 7 - Clone 1 Escherichia/Shigella

Banda 7 - Clone 2 Shinella

Banda 9 - Clone 1 Novosphingobium

Banda 9 - Clone 3 Novosphingobium

Banda 10 - Clone 2 Methyloversatilis

Banda 10 - Clone 3 Não cultivado Banda 12 - Clone 2 Methyloversatilis

Banda 13 - Clone 1 Escherichia/Shigella

Banda 13 - Clone 2 Acidovorax

Banda 13 - Clone 3 Acidovorax

amostra 9D-Meio (Bandas 3 e 9) teve seus clones identificados como Bosea, e Novosphingobium. Os clones da amostra 9D-Extremidade (Bandas 2, 4, 5 e 13) foram identificados como pertencentes aos gêneros Methylibium, Shinella, Microbacterium, Sphingopyxis, Escherichia/Shigella e Acidovorax. E, por fim, a amostra 12D-Meio (Banda 6) teve afiliação com o gênero Beggiatoa e com micro-organismos ainda não cultivados.

Visto que estas membranas permaneceram menos tempo no sistema antes de serem analisadas, a presença destes micro-organismos nestas análises indica que estes gêneros podem ser importantes na formação inicial do biofilme no sistema de osmose inversa, sendo, portanto, possíveis alvos para futuros estudos.

Tabela 5. Relação das bandas excisadas dos géis DGGE, identificação dos clones e membranas analisadas.

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Devido à maior complexidade observada no fingerprinting genético referente às membranas de 12, 14 e 17 dias, outra abordagem tornou-se necessária para analisar as comunidades presentes nos biofilmes destas amostras. Dessa maneira, duas bibliotecas gênicas foram construídas, uma para a amostra de 12 dias e outra para a amostra de 17 dias. A composição da comunidade bacteriana das membranas de 14 dias não foi analisada por excisão de bandas ou bibliotecas gênicas, pois o perfil de DGGE apresentado por elas foi muito semelhante aos das membranas de 12 e 17 dias.

2.3.5. Bibliotecas Gênicas

Aproximadamente 400 clones foram obtidos das bibliotecas de RNAr 16S e sequenciados. Depois de remover as sequências de baixa qualidade, cerca de 350 sequências foram utilizadas para analisar a composição e a abundância dos micro- organismos nos diferentes tempos do sistema analisado.

A partir das sequências analisadas, foram obtidas curvas de rarefação (Figuras 10, 11 e 12) e índices de diversidade, riqueza e cobertura para cada biblioteca (água de alimentação e membranas) (Tabela 6). Por meio das curvas de rarefação foi obtido o número de OTUs em função do número de sequências analisadas, em níveis de filo, família, gênero e espécie (valores maiores ou iguais a 80%, 90%, 95% e 97% de similaridade, respectivamente).

A cobertura das bibliotecas foi de moderada a alta, entre 78 e 93%, para o cutfoff de 95% de similaridade de sequência, ou seja, distância evolutiva (D) de 0,05. Entretanto, as curvas de rarefação mostram que para este nível filogenético há uma tendência para atingir o platô, indicando que o esforço amostral foi próximo do necessário para cobrir a diversidade das amostras. Já para os níveis de filo e família, o esforço amostral foi suficiente para cobrir toda a diversidade presente nas amostras.

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Tabela 6. Índices de diversidade e cobertura das bibliotecas de RNAr 16S construídas a partir do DNA total das amostras de água de alimentação (AO2) e membranas (12D e 17D), em nível de distância (D) de 0,05 (= gênero). Nome da Amostra Número de Sequências OTUs Índice de

Riqueza Indices de Diversidade Cobertura (%)

Chao Simpson Shannon

Água de

Alimentação 211 58 94,9 0,103 2,85 90

Membrana 12D 73 19 20,5 0,085 2,552 93

Membrana 17D 57 18 30,0 0,144 2 78

No que diz respeito aos índices de diversidade Shannon e Simpson, as três bibliotecas tiveram valores semelhantes, indicando que as comunidades de bactérias presentes na água de alimentação e nos biofilmes das membranas de 12 e 17 dias têm nível de complexidade similar, sendo a da água de alimentação um pouco mais diversa em relação às comunidades dos biofilmes. Em relação aos índices de riqueza, a biblioteca da água de alimentação mostrou-se consideravelmente mais rica que as demais, apresentando índice de Chao (estimativa de riqueza) 94,9 em comparação aos valores de 20,5 e 30 das outras bibliotecas. Apesar das informações que estes índices fornecem, a composição das comunidades não pode ser inferida a partir deles, sendo necessário comparar as sequências obtidas com bases de dados para obter informações mais completas e uma visão geral do sistema microbiano.

Figura 10. Curva de Rarefação da Biblioteca Gênica da Água de Alimentação para os cutoffs referentes aos níveis de filo (0,2), família (0,10), gênero (0,05) e espécie (0,03).

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Figura 11. Curva de Rarefação da Biblioteca Gênica da Membrana de 12 dias para os cutoffs referentes aos níveis de filo (0,2), família (0,10), gênero (0,05) e espécie (0,03).

Figura 12. Curva de Rarefação da Biblioteca da Membrana de 17 dias para os cutoffs referentes aos níveis de filo (0,2), família (0,10), gênero (0,05) e espécie (0,03).

Para avaliar as diferenças na composição de cada biblioteca, foram determinados os números de Unidades Taxonômicas Operacionais (OTUs) para os diferentes níveis supracitados. Para o nível taxonômico de gênero, a amostra da água de alimentação apresentou o maior número de OTUs (58), seguida pelas amostras das membranas (18 OTUs cada). Tendo como base estas informações, foi realizada uma análise detalhada das afiliações de cada OTU em nível de gênero, através das plataformas RDP e BLASTn (Tabela 7). Verificou-se na biblioteca da amostra de água de alimentação maior diversidade de filos em relação às demais. Nas comunidades formadas nas membranas, apenas dois filos foram encontrados: Proteobacteria e

63 Actinobacteria. Houve também uma divergência na diversidade e abundância de gêneros encontrados em cada biblioteca (Figura 13), sendo a biblioteca da membrana de 12 dias a mais numerosa neste aspecto, apresentando 14 gêneros distintos, seguida da biblioteca da água de alimentação (12 gêneros) e da biblioteca da membrana de 17 dias (11 gêneros).

Figura 13. Disposição e abundância relativa dos gêneros encontrados nas bibliotecas gênicas do sistema de membranas de osmose inversa (Porcentagem relativa ao número total de OTUs nas bibliotecas).

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Tabela 7. Composição e abundância relativa dos micro-organismos identificados nas bibliotecas gênicas. Gênero Água de Alimentação Membrana 12D Membrana 17D (%) (%) (%) Acidovorax 0 0 2 Aquicella 0 0 2 Bdellovibrio 2 0 0 Bosea 0 5 2 Bradyrhizobium 0 12 2 Burkoholderia 0 5 0 Cupriavidus 0 3 0 Devosia 0 4 2 Escherichia/Shigella 2 0 0 Kaistia 0 2 0 Leptothrix 0 4 0 Leucobacter 2 0 0 Methylibium 0 2 0 Methylobacterium 0 4 0 Microbacterium 0 12 33 Não cultivados 53 21 36 Nitrospira 16 0 0 Novosphingobium 0 2 2 Opitutus 5 0 0 Rheinheimera 3 0 0 Rhizobium 0 2 13 Sediminibacterium 1 0 0 Shinella 0 20 2 Sphingobium 3 2 2 Sphingopyxis 0 0 2 Steroidobacter 2 0 0 Terrimonas 2 0 0 Thiothrix 5 0 0 Vampirovibrio 3 0 0

Verificou-se na biblioteca da água de alimentação que o gênero Nitrospira apresentou maior porcentagem de clones identificados (16%), os demais ficaram em um percentual de 1 a 5%. A maior parte destes gêneros não teve ocorrência comum nas demais bibliotecas, indicando que os micro-organismos presentes na água de

65 alimentação podem não estar presentes no biofilme maduro que se formou nas membranas de 12 e 17 dias.

Para as membranas, os gêneros Shinella (20%), Microbacterium (12%) e Bradyrhizobium (12%) foram os mais abundantes na biblioteca da amostra de 12 dias e os gêneros Rhizobium (13%) e Microbacterium (33%) os mais abundantes para a amostra de 17 dias. Os gêneros Bosea, Bradyrhizobium, Devosia, Microbacterium e Novosphingobium foram identificados nas amostras de ambas as membranas, dando indício da sua estabilidade na comunidade analisada e possível importância na constituição de biofilmes maduros.

Além de todos os gêneros identificados, grande parte das sequências foi afiliada com maior similaridade a micro-organismos ainda não cultivados (53% das sequências na biblioteca da água de alimentação, e 21 e 36% nas bibliotecas das membranas de 12 e 17 dias, respectivamente), sugerindo que a maioria das bactérias presentes no sistema de membranas de osmose inversa de refinaria de petróleo ainda é desconhecida.

A análise das bibliotecas revelou que a composição das comunidades nos biofilmes de 12 e 17 dias varia, assim como a abundância de alguns membros comuns, sugerindo que o biofilme é dinâmico. Ainda, a diversidade de bactérias no biofilme maduro de 17 dias mostrou-se menor que em 12 dias, indicando que o biofilme já está em declínio, na fase de dispersão e perda de alguns membros.

2.4. DISCUSSÃO

A comunidade bacteriana do sistema de osmose inversa utilizado neste trabalho foi caracterizada utilizando abordagem polifásica. Diferentes porções do sistema foram analisadas: a água de alimentação (porção planctônica da comunidade) e membranas de osmose inversa com diferentes tempos de permanência no sistema (porção séssil da comunidade – biofilmes).

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A primeira parte do estudo consistiu na realização de isolamentos a partir da água de alimentação e a caracterização da motilidade dos isolados. A análise filogenética indicou que a divisão Proteobacteria foi a predominante no isolamento. Chan et al. 2004 e Bereschenko et al. (2008) já destacaram a predominância deste grupo taxonômico em sistemas de osmose inversa, por métodos dependentes e independentes de cultivo. Dentro deste filo, a classe Gamaproteobacteria foi a mais numerosa no isolamento, sendo esta, massivamente representada pelo gênero Pseudomonas (18). Pseudomonas spp. são bactérias Gram-negativas pertencentes à família Pseudomonaceae e são encontradas em muitos habitats. Vários estudos têm relatado o isolamento deste gênero em sistemas de tratamento de água, bem como formando biofilmes (Ridway et al., 1993; Dudley & Christopher, 1999; Li et al., 2004; Schafer et al., 2005; Herzberg & Elimelech, 2007; Bereschenko et al., 2008a, 2008b; Huang et al., 2008). A sua capacidade de utilizar diferentes compostos orgânicos como fonte de carbono tem sido atribuída à sua versatilidade genética, que se reflete na sua atividade metabólica, com excelente capacidade de adaptação e colonização de nichos ecológicos diferentes, incluindo água (Ruiz et al., 2004). Mehri e colaboradores (2013) estudaram a diversidade de espécies do gênero em amostras de águas residuais e descobriram que as espécies P. putida e P. fluorescens foram predominantes, além disso, elas apresentam estabilidade para formar biofilmes e são resistentes à radiação UV. Estas características evidenciam o potencial das bactérias do gênero para a formação inicial de biofilmes nos sistemas analisados neste trabalho.

O segundo gênero mais representativo deste isolamento foi Bacillus (4). Bactérias pertencentes a este grupo têm sido frequentemente encontradas como componente de biofilmes em sistemas de osmose inversa. As espécies de Bacillus são capazes de produzir endosporos, que têm uma alta resistência aos efeitos adversos, tais como o calor, solventes, desidratação e irradiação UV. A versatilidade destes endosporos lhes permite permanecer em ambientes agressivos por um longo período de tempo, contribuindo para a sua sobrevivência, mesmo em sistemas de tratamento de água com adição de biocidas (Abecasis et al., 2013).

Outro gênero encontrado durante o isolamento foi Sphingomonas, embora em menor abundância. Segundo Azevedo e Oliveira (2000), bactérias pertencentes a este

67 gênero têm um papel importante na formação inicial de biofilmes por produzirem grandes quantidades de EPS, o que serve como base para a aderência de outras bactérias e para a subsequente maturação do biofilme. A presença de apenas vestígios de compostos orgânicos que ocorrem naturalmente nos sistemas de tratamento de água é suficiente para o crescimento destas bactérias, uma vez que Sphingomonas spp. são metabolicamente versáteis e tem uma absorção eficiente de nutrientes sob condições limitantes como sistemas de tratamento de água (Pollock & Armentrout, 1999). Este gênero é comum em ecossistemas aquáticos e espécies deste gênero foram identificadas em biofilmes presentes em sistemas de distribuição de água, bem como em sistemas de membranas de osmose inversa (Zwart et al., 2002; Li et al., 2004; Schafer et al., 2005; Bereschenko et al., 2008a, 2008b; Huang et al., 2008).

Embora não tenham sido encontrados em uma quantidade representativa, outros gêneros de bactérias foram isolados a partir da água de alimentação: Brevundimonas, Rheinheimera, Chyseobacterium, Flavobacterium, Serratia, Aeromonas, Arenimonas, Delftia, Sphingobium, Achromobacter e Sphingopyxis. Os gêneros Aeromonas, Flavobacterium, Pseudomonas, Bacillus e Serratia já foram isolados em outros trabalhos a partir de membranas de osmose inversa e demonstraram ser importantes na formação de biofilmes (Ridgway et al., 1983; Baker & Dudley, 1998; Knoell et al., 1999; Herzberg et al., 2010). O gênero Brevundimonas também já foi isolado a partir de biofilmes causando bioufouling em membranas, sendo responsável pela produção de grandes quantidades de EPS (Verhoef et al., 2002). Zhang et al. (2006) sugerem que a presença de Brevundimonas sp. é justificada pela condição oligotrófica destes ambientes, resultando em uma maior taxa de fixação de células às membranas e formação de biofilmes.

Apesar da diversidade de isolados presentes na água de alimentação com potencial para formação de biofilmes, nem todos são capazes de colonizar ativamente as superfícies. Muitos trabalhos evidenciam que as bactérias que possuem características relacionadas à motilidade têm vantagens na capacidade de aderir a superfícies e dar início à formação de biofilmes (Pollock & Armentrout 1999; Berenchescko et al., 2010b). Assim, a fim de verificar essa capacidade e relacioná-la com a formação de biofilmes, estes isolados foram caracterizados em relação à sua

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motilidade. Dentre os isolados testados para a motilidade, o gênero que mais se destacou foi Pseudomonas. Murray et al. (1996) já observaram os três tipos de motilidade em bactérias da espécie P. aeruginosa. Para P. aeruginosa, a motilidade está correlacionada com a produção de ramnolípidos, que é um agente tenso-ativo capaz de reduzir a tensão superficial de líquidos, facilitando a adesão das células. Além disso, Köhler e colegas (2000) demonstraram que a motilidade do tipo swarming em P. aeruginosa é induzida em superfícies semi-sólidas sob condições de limitação de nitrogênio. Dessa maneira, dependendo das condições ambientais, as bactérias do gênero Pseudomonas podem apresentar motilidade. Esta característica reflete a sua alta capacidade para colonizar uma série de nichos diferentes e formar biofilmes sobre superfícies como as membranas de osmose inversa, colocando as bactérias deste gênero como alvos principais das estratégias de prevenção e remoção de biofilmes.

Além da utilização de metodologias clássicas, a comunidade bacteriana presente neste sistema de osmose inversa foi analisada através de ferramentas moleculares. Na biblioteca da água de alimentação, apesar da maior diversidade de filos, a grande maioria dos clones pertenceu ao filo Proteobacteria. De acordo com Bereschenko et al. (2008), este grupo taxonômico é abundante em tratamento de água e sistemas de osmose inversa. O gênero Nitrospira (16%) foi o mais expressivo nesta biblioteca, seguido por Opitutus (5%), Thiothrix (5%), Sphingobium (3%), Vampirovibrio (3%), Rheiheimera (3%), Terrimonas (2%), Steroidobacter (2%), Leucobacter (2%), Escherichia/Shigella (2%) e Bdellovibrio (2%). O gênero Nitrospira já foi isolado a partir de água do mar, água doce, solos e tubos de ferro de sistema de aquecimento (Daims et al., 1999). Martiny e colaboradores (2005) também identificaram estas bactérias em sistemas aquáticos. Elas têm um papel reconhecido na oxidação de nitrito, característica que pode explicar a sua presença no sistema de osmose inversa, visto que a água de alimentação é proveniente de etapas anteriores do tratamento de efluentes, nas quais há uma alta concentração de compostos nitrogenados. Além disso, essas bactérias sobrevivem por longos períodos de seca e podem entrar num estado de dormência, sendo, portanto, adaptadas a ambientes oligotróficos, como sistemas aquáticos.

69 O gênero Sphingobium, também identificado nesta biblioteca, se destaca na frequência em que é encontrado em ambientes aquáticos como: água potável, água destilada, biofilmes em tubos, tanques e banheiras, e fluidos de diálise. A capacidade destas bactérias para sobreviver em água clorada e em ambientes oligotróficos demonstra seu potencial na formação de biofilmes (Vaz-Moreira et al., 2011). Estas características justificam a presença de bactérias deste gênero na água de alimentação mesmo após o seu pré-tratamento com cloro.

Além dos gêneros Nitrospira e Sphingobium, os gêneros Methylibium e Rheinheimera têm sido constantemente relacionados a sistemas aquáticos, justificando sua presença na água de alimentação do sistema analisado (Stein et al., 1996; Brun et al., 2000; Lau et al., 2005; Merchant et al., 2007; Yee et al., 2010).

Assim como na água de alimentação, a maior parte das bactérias identificadas nos biofilmes formados nas membranas foi afiliada ao filo Proteobacteria, predominando os representantes das classes Alfaproteobacteria e Betaproteobacteria. Em 2008, Bereschenko e colaboradores observaram a importância de micro- organismos pertencentes à classe Alfaproteobacteria em um sistema de osmose. Hörsch et al. (2005) também identificaram representantes destas classes - Alfa e Betaproteobacteria - em biofilmes maduros formados em sistemas de filtração de água. A presença constante das bactérias deste grupo taxonômico nestes sistemas é