DAIANE RODRIGUES BARBOSA BELGINI
CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE MICROBIANA DE BIOFILMES
EM MEMBRANAS DE OSMOSE INVERSA UTILIZADAS NO
TRATAMENTO DE EFLUENTES DE REFINARIAS DE PETRÓLEO
CHARACTERIZATION OF THE MICROBIAL DIVERSITY OF BIOFILMS IN
REVERSE OSMOSIS MEMBRANES USED IN THE WASTEWATER
TREATMENT OF OIL REFINERIES
Campinas
vii RESUMO
Com o intuito de otimizar o consumo de água do meio ambiente, o reuso de efluentes têm sido cada vez mais empregado. Dentre as diferentes tecnologias utilizadas no tratamento de efluentes para reuso, os sistemas de osmose inversa se destacam por oferecer vantagens como: economia, alta produtividade e alta eficiência na remoção de sais. Entretanto, estes sistemas estão constantemente sujeitos à contaminação por micro-organismos, o que leva à perda da eficiência e aumento nos custos operacionais e de manutenção. Neste contexto, este trabalho tem por objetivo a caracterização da diversidade bacteriana de um sistema de membranas de osmose inversa que trata efluentes de uma refinaria de petróleo, a fim de determinar quais são os micro-organismos relacionados com a formação de biofilme. A diversidade planctônica do sistema, i.e., água de alimentação, foi analisada através de plaqueamento e cultivo e de bibliotecas de genes RNA ribossomal 16S. A diversidade bacteriana associada às membranas foi analisada através de fingerprinting genético (DGGE – Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e construção de bibliotecas de genes ribossomais 16S. A partir das amostras de água de alimentação, foram obtidos 37 isolados bacterianos e 211 clones. A análise das membranas foi realizada através do sequenciamento e identificação de 13 bandas excisadas a partir do fingerprinting genético, assim como pela construção de duas bibliotecas gênicas, com 73 e 57 clones cada uma. Dentre os gêneros encontrados nas diferentes amostras, os mais representativos e com potencial para formação inicial de biofilmes foram: Acidovorax, Bosea, Methylibium, Novosphingobium, Rhizobium, Shinella, Sphingomonas, Sphingobium, Devosia, Microbacterium e Sphingopyxis. De acordo com a literatura, alguns destes gêneros são constantemente encontrados em sistemas aquáticos e são importantes na formação inicial de biofilmes em sistemas de osmose inversa. O conhecimento da diversidade de micro-organismos presentes nestes sistemas fornece subsídios para entender a dinâmica e os mecanismos de formação de biofilmes na superfície de membranas, permitindo o o desenvolvimento de estratégias de controle e remoção mais específicas.
Palavras-chave: Ecologia microbiana, Sistemas de Tratamento de Efluentes, Membranas de Osmose Inversa, Biofilmes, Bibliotecas de Genes RNAr 16S, DGGE.
ix ABSTRACT
In order to reduce the environmental water consumption, reuse of wastewater has been increasingly employed. Among the different technologies used in the treatment of wastewater for reuse, reverse osmosis system stands out because of its advantages such as economy, high productivity and high efficiency in the removal of salts. However, these systems are constantly subjected to contamination by microorganisms, which causes loss of efficiency and increase in operating and maintenance costs. In this context, this study aims to characterize the bacterial diversity of a reverse osmosis membrane system treating effluent of an oil refinery in order to determine which are the microorganisms related to biofilm formation. The planktonic diversity of the system, i.e. feed water, was analyzed by cultivation techniques and 16S ribosomal gene clone libraries. Bacterial diversity associated with membranes was analyzed through genetic fingerprinting (DGGE - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) and the construction of 16S ribosomal gene libraries. Approximately 37 isolates and 211 clones were obtained from the feed water samples. Analysis of the membranes was performed by sequencing and identification of 13 excised bands from DGGE gel, as well as the construction of two 16S rRNA gene libraries. Among the genera found in the samples, the most representative and with potential to initial biofilm formation were Acidovorax, Bosea, Methylibium, Novosphingobium, Rhizobium, Shinella, Sphingomonas, Sphingobium, Devosia, Microbacterium and Sphingopyxis. According to the literature, some of these genera are constantly found in aquatic systems and are important in the initial formation of biofilms in reverse osmosis systems. Knowledge of the diversity of microorganisms in these systems provides subsidies to understand the dynamics and mechanisms of biofilm formation on the surface of membranes, allowing further development of control and more specific removal strategies.
Keywords: Microbial Ecology, Wastewater Treatment Systems, Reverse Osmosis Membranes, Biofilms, 16S rRNA Gene Libraries, DGGE.
xi SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO...01
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...02
2.1. Reuso da água e o Tratamento de Efluentes...02
2.2. Sistemas de Membranas de Osmose Inversa e Biofouling...04
2.3. Biofilmes...06
2.3.1. Quorum-sensing...08
2.3.2. Estruturas de Motilidade...10
2.4. Estudo de Comunidades Microbianas...12
2.4.1. Ferramentas Moleculares e Genes Ribossomais 16S...13
2.4.2. DGGE: Fingerprinting genético...15
3. OBJETIVOS...18
3.1. Objetivos Gerais...18
3.2. Objetivos Específicos...18
4. ESTRUTURA ...18
CAPÍTULO 1. Culturable bacterial diversity from a feed water of a reverse osmosis system, evaluation of biofilm formation and biocontrol using phage...21
CAPÍTULO 2. Diversidade e Dinâmica da Comunidade Bacteriana em Sistema de Osmose Inversa de uma Refinaria de Petróleo...35
2.1. INTRODUÇÃO... ...36
2.2. MATERIAL E MÉTODOS...37
xii
2.2.2. Água de Alimentação...37
2.2.2.1. Amostragem...37
2.2.2.2. Isolamento...38
2.2.2.3. Coloração de Gram e Testes de Motilidade...38
2.2.2.4. Extração de DNA dos Isolados...39
2.2.2.5. Extração de DNA Total da Comunidade Microbiana...39
2.2.2.6. Amplificação e Purificação de Genes RNAr 16S...40
2.2.2.7. Sequenciamento dos Genes de RNA16S dos Isolados...40
2.2.2.8. Análise Filogenética...41
2.2.2.9. Random Amplified Polymorphic DNA – RAPD……...42
2.2.2.10. Construção de Biblioteca de Genes de RNAr 16S...42
2.2.3. Membranas de Osmose Inversa...44
2.2.3.1. Sistema Piloto de Osmose inversa e Amostragem das Membranas...44
2.2.3.2. Extração de DNA Total dos Biofilmes das Membranas de Osmose Inversa...46
2.2.3.3. Amplificação de Genes RNAr 16S para o DGGE das Membranas de Osmose Inversa...46
2.2.3.4. DGGE das Membranas de Osmose Inversa e Excisão de Bandas...46
2.2.3.5. Construção de Biblioteca de Genes RNAr 16S e Clonagem de Bandas Excisadas...47
2.2.3.6. Análise das Bibliotecas Gênicas...48
2.3. RESULTADOS...48
2.3.1. Identificação dos Isolados da Água de Alimentação...48
2.3.2. Coloração de Gram e Testes de Motilidade dos Isolados da Água de Alimentação...52
xiii 2.3.4. DGGE das Membranas de Osmose Inversa e Excisão de
Bandas...54 2.3.5. Bibliotecas Gênicas...60 2.4. DISCUSSÃO...65 2.5. CONCLUSÕES...71 5. CONCLUSÃO GERAL...73 6. PERSPECTIVAS FUTURAS...74 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...75
ANEXO: Árvore filogenética dos isolados da água de alimentação AO1 (referente ao capítulo 1)...87
xv Dedico este trabalho aos meus pais, à minha avó Guilhermina e à minha irmã Silmara (in memoriam) pelo incentivo, dedicação e apoio constantes
xvii AGRADECIMENTOS
Ao concluir esta etapa da minha vida, gostaria de agradecer às pessoas que me ajudaram a conquistar este objetivo, sem elas isso não seria possível.
Primeiramente, agradeço à minha orientadora Valéria, por ter me aceitado como sua aluna antes mesmo de me conhecer; por ser um exemplo a ser seguido, com seu dinamismo e disposição sem fim; e por sempre incentivar e acreditar no potencial dos seus alunos. Muito obrigada, Val, por ter permitido que eu trabalhasse neste projeto, no qual eu aprendi e amadureci tanto. Fico feliz em continuar a ser sua aluna.
Quero agradecer também à Virginia Medeiros de Siqueira, Samantha Fonseca e Viviane Piccin que me ensinaram e me ajudaram muito a concluir etapas deste trabalho. Além disso, por terem sido sempre pacientes com as minhas crises de insegurança e terem compartilhado muitos momentos alegres e divertidos durante essa jornada. Muito obrigada pelo apoio e pela amizade, que tenho certeza que não acaba com a finalização deste projeto.
Agradeço aos amigos da Divisão de Recursos Microbianos, pelos muitos momentos compartilhados, dentro e fora do laboratório. Obrigada pelo convívio diário, pelas risadas, cafés, faxinas e festinhas. Sem vocês, os dias na DRM não seriam os mesmos. Muito obrigada por me acolherem todos os dias, vocês são como uma família pra mim.
Não posso deixar de agradecer também aos meus colegas do laboratório de Genética Humana do CBMEG, pelos três anos de convívio e amizade; e às minhas ex-orientadoras Maricilda Palandi de Mello e Antonia Paula Marques de Faria, pelos seus ensinamentos e por terem permitido que eu trabalhasse em seus projetos de pesquisa, dando início à minha carreira acadêmica.
Ao professor Dr. Rubens Duarte, agradeço a ajuda na análise dos meus dados, por sempre ser tão cordial e sempre estar à disposição para ajudar.
Agradeço também aos professores que participaram da minha banca de qualificação (Dra. Marta Duarte, Dra. Laura Ottoboni e Dra. Virgínia Siqueira) e da banca do meu exame prévio (Dra. Fabiana Fantinatti-Garboggini e Dr. Michel Passarini) pelas discussões e sugestões a este projeto.
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Devo agradecer também à Petrobrás, pelo auxílio financeiro e logístico na pesquisa e aos grupos colaboradores da Universidade Federal de Viçosa e do Cenpes, pela elaboração do sistema piloto, por fornecerem informações importantes para a realização deste trabalho e pelas discussões sempre pertinentes para melhorar este estudo.
Sinto-me honrada em poder ter contado com o carinho e apoio de muitos amigos, entre eles: Tatiane Faquinha, Bianca Micheletto, Barbara Dias, Nelson Ramos, Giselle Kimura, Rafael Talaisys, Bruno Vaz, Iuri Guntchnigg, Hebert Culler, Flávia Caleffo, Filipe Grillo, Felipe Martinelli, Pedro Cruz, Dudu Del Ben e José Luiz (Zélo). Muito obrigada pelo apoio emocional, intelectual e pela amizade de vocês, pessoas tão especiais pra mim. Todos me ajudaram muito durante estes anos e tiveram uma paciência enorme comigo, principalmente nestes últimos meses. Sou grata a cada um de vocês por serem tão queridos e sempre estarem ao meu lado, nos momentos bons ou ruins.
Finalmente, quero agradecer aos meus pais e à minha avó Guilhermina, sem os quais eu não estaria concluindo esta etapa da minha vida, obrigada por me darem a liberdade de escolher a minha carreira, sempre me ajudarem e por serem os alicerces da minha vida. Agradeço também aos meus demais familiares, especialmente meus irmãos Jeferson, Lilian e Silmara (in memoriam) por compartilharem uma história de vida complexa comigo e me aceitarem em suas vidas.
Por fim, quero agradecer a todos aqueles que um dia já passaram na minha vida, ou ainda se encontram presentes, mas que eu não vejo ou converso com freqüência. Sem dúvida, não deixam de ter me incentivado, apoiado e, mesmo que indiretamente, me auxiliaram a concluir mais esta etapa.
Meu sincero agradecimento a todos, por permitirem que, com a sua convivência, eu me tornasse uma pessoa melhor a cada dia.
1 1. INTRODUÇÃO
Devido ao consumo excessivo de água, especialmente no setor industrial, o seu tratamento e reuso está cada vez mais evidenciado (Nascimento, 2004). Para isso, diversas metodologias têm sido utilizadas, como, por exemplo, sistemas de membranas de osmose inversa. Entretanto, estes sistemas estão constantemente sujeitos à impregnação por biofilmes microbianos, levando a uma diminuição na sua eficiência e aumentando os custos de sua manutenção (Ahmad et al., 2000; Chen et al., 2004).
Dessa maneira, esta pesquisa visa caracterizar estes biofilmes, apresentando os resultados do estudo das comunidades microbianas em um sistema de membranas de osmose inversa. Para isso, amostras de água de alimentação deste sistema foram examinadas, assim como membranas de osmose inversa.
Os dois tipos de amostras foram utilizados com a finalidade de entender as relações entre o ambiente planctônico e a formação dos biofilmes. Além disso, duas diferentes abordagens foram empregadas: metodologias dependentes e metodologias independentes de cultivo, visando enfatizar a importância de um estudo polifásico na caracterização de comunidades microbianas.
O conhecimento adquirido sobre a formação e a composição das comunidades microbianas nos biofilmes permitirá buscar alternativas para o controle da formação de biofilmes em membranas, com significativos impactos econômicos imediatos para a indústria do petróleo, os quais, em longo prazo, poderão ser estendidos para outros setores industriais que utilizam tais sistemas. Além disso, as informações geradas com este trabalho serão importantes no campo da ecologia microbiana e estudos de biofilmes em geral.
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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Reuso da Água e o Tratamento de Efluentes
O volume total de água disponível no planeta é da ordem de 1,5 milhões de km3. Deste total, apenas 0,3% está disponível na condição de água doce pronta para utilização humana (Nascimento, 2004). Embora esse seja um volume finito, por meio do ciclo hidrológico a água constitui um recurso renovável e, portanto, permanentemente disponível (Hespanhol et al., 2008).
Devido às suas características e à sua abundância, a água passou a ser usada em diversas aplicações. Seu uso se estende desde sobrevivência e higiene humana, até sofisticados processos industriais (Campos de Faria, 2004).
Entretanto, diante da tendência de contínuo crescimento populacional e industrial, das alterações climáticas e do uso indiscriminado, a disponibilidade hídrica tende a diminuir ao longo do tempo, enquanto os recursos hídricos disponíveis são mantidos aproximadamente constantes (Hespanhol et al., 2008).
A demanda de água ao longo dos três últimos séculos, em várias regiões do mundo, cresceu 35 vezes. A utilização de água em quantidades superiores ao volume disponível vem gerando problemas de escassez (Nascimento, 2004). Um exemplo disso é que muitos rios, particularmente em regiões semi-áridas, estão com seus fluxos reduzidos, e a reposição da água está cada vez mais prejudicada pelas mudanças climáticas (Rodriguez et al., 2009). Além disso, visto que ainda há cerca de 784 milhões de pessoas no mundo sem acesso a fontes adequadas de água (WHO/UNICEF, 2014) e cada vez mais os recursos hídricos se tornam escassos, há uma crescente demanda para conservar, tratar e reutilizar estes recursos.
Neste contexto, medidas como a cobrança pelo uso da água vêm sendo tomadas, sendo um instrumento extremamente benéfico, uma vez que induz à gestão do consumo e promove a redução da descarga de efluentes em corpos hídricos (Hespanhol et al., 2008).
No Brasil, as regulamentações dos recursos hídricos estão presentes na Lei da Política Nacional de Recursos Hídricos nº 9433/97, que impõe critérios para cobrar pelo uso da água. Esta legislação tem o intuito de conservar e recuperar os recursos hídricos
3 e melhorar a qualidade de água que chega à população, buscando dotá-la de um valor econômico (Campos de Faria, 2004).
Dessa maneira, como as leis e multas ambientais referentes ao uso dos recursos hídricos estão se tornando cada vez mais rígidas, há uma tendência na busca por metodologias que visam minimizar o descarte de resíduos e a captação de água (Campos de Faria, 2004; Kim et al., 2009). Para isso, projetos de reuso se tornaram uma prática comum no mundo, tendo sido registrados inúmeros projetos relacionados (Rodriguez et al., 2009).
O setor industrial tem grande impacto sobre o consumo de água, já que grandes volumes são necessários para o funcionamento de diferentes indústrias. Assim, o reuso é uma realidade para este setor da sociedade, pois, além de ser economicamente vantajoso em função da redução dos custos envolvidos, reduz o volume de água consumido e dos efluentes lançados em estações de tratamento de descartes industriais ou em corpos d’água.
Nas indústrias, há diversas possibilidades para aproveitamento de águas de reuso, já que as características físico-químicas e biológicas exigidas para a água são marcadamente inferiores às necessárias para o consumo humano e podem ser empregadas em diferentes unidades como, por exemplo, em caldeiras, torres de resfriamento e geração de energia (Bernardis, 2002; Nascimento, 2004).
Para tratar os efluentes são utilizados, normalmente, dois estágios: o tratamento primário e o secundário. O tratamento primário consiste na separação do óleo, água e sólidos. No tratamento secundário, o óleo dissolvido e outros poluentes orgânicos são biologicamente consumidos por micro-organismos (Mariano, 2001).
Visto que, muitas vezes, para reutilizar a água ou devolvê-la para o meio, a sua qualidade precisa ser superior à resultante dos estágios primário e secundário, e como estes estágios convencionais têm demonstrado dificuldade em remover materiais orgânicos e poluentes, um estágio adicional pode ser requerido no tratamento de efluentes (Kim et al., 1997; Simpson, 2008). Assim, diferentes metodologias para este fim podem ser empregadas. As mais conhecidas são: lodos ativados, lagoas aeradas, filtros biológicos, lagoas de estabilização, torres de oxidação, filtração, adsorção em carvão ativado e membranas de osmose inversa (Carvalho, 2006).
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As membranas de osmose inversa têm sido bastante utilizadas, pois oferecem vantagens como: durabilidade, baixo consumo de energia, alta produtividade e eficiência na remoção de uma ampla variedade de contaminantes (Nascimento, 2004). Por meio da aplicação de membranas de osmose inversa é possível obter a remoção de minerais e outros contaminantes, incluindo metais pesados, vírus e pesticidas. Elas também podem remover de 95 a 99% dos hormônios e mais de 95% de produtos farmacêuticos e de cuidado pessoal (Huang et al., 2001; Snyder et al., 2007; Kim et al., 2007; Rodriguez et al., 2009). Portanto, se implementados com sucesso, os sistemas de osmose inversa podem produzir água de qualidade superior em comparação com as tecnologias convencionais, justificando a crescente utilização desta tecnologia com o decorrer dos anos (Lee et al., 2006).
2.2. Sistemas de Membranas de Osmose Inversa e Biofouling
Embora sejam eficientes e muito utilizados no tratamento de efluentes, os sistemas de membrana sofrem constante obstrução durante sua operação e necessitam de contínua manutenção e limpeza (Ahmad et al., 2000; Chen et al., 2004).
Um dos fatores críticos limitando a aplicação efetiva das tecnologias de membranas para o tratamento de água é a incrustação de materiais, que recebe o nome de fouling. Este fenômeno resulta na diminuição da qualidade e da quantidade de água produzida (Baker & Dudley, 1998; Kim et al., 2009; Herzberg et al., 2010).
De acordo com a literatura, nas tecnologias de membranas, os tipos mais importantes de incrustação incluem (Flemming, 1997; Ahmad et al., 2000):
Incrustação de cristais (deposição de minerais e sais devido ao excesso do produto na água de alimentação e etapas anteriores no tratamento da água);
Incrustação orgânica (deposição de ácidos húmicos, óleos, graxa);
Incrustação de partículas (deposição de argila, detritos, sílica);
Incrustação microbiológica (biofouling, adesão e acúmulo de micro-organismos formando biofilmes).
5 Os três primeiros tipos de incrustações podem, geralmente, ser controlados pela redução da concentração dos componentes na fase aquosa a ser filtrada e nas etapas anteriores à filtração por membranas. Entretanto, a incrustação de origem microbiológica – biofouling – é difícil de controlar, pois não se consegue reduzir facilmente o número de micro-organismos antes da água a ser filtrada entrar em contato com as membranas (Flemming, 1997). Assim, o biofouling torna-se um dos principais problemas encontrados na operação dos sistemas de membrana de osmose inversa, podendo ocorrer mesmo após o pré-tratamento do sistema e da água pela adição de biocidas (Baker & Dudley, 1998).
O biofouling é um processo dinâmico de colonização e crescimento microbiano, com formação de biofilmes; resultando na perda severa de desempenho, modificações nas propriedades da superfície das membranas e demandando custosas limpezas periódicas nas membranas ou a sua substituição (Flemming, 2002; Ivnitsky et al., 2007; Kim et al., 2009; Ponnusamy et al., 2010). E, como os biofilmes estão presentes em praticamente qualquer sistema ambiental onde exista água, formando-se especialmente em sistemas com poucos nutrientes como uma estratégia de sobrevivência, é comum que sejam encontrados em sistemas de tratamento de água, tornando o biofouling um problema mundialmente reconhecido destes sistemas (Flemming, 1997; Shrout & Neremberg, 2012).
Tendo em vista que a qualidade da água de alimentação é considerada como o fator principal que contribui para a formação do biofouling e dos biofilmes nas membranas, torna-se necessário monitorar a qualidade desta água e, se necessário, agir de maneira a eliminar a presença de micro-organismos antes que ela alcance o sistema de osmose inversa (Ahmad et al., 2000). Com essa finalidade, controlar o crescimento microbiológico na água de alimentação através da utilização de biocidas é um dos procedimentos padrão para evitar o desenvolvimento dos biofilmes. Entretanto, diversos trabalhos indicam que este não é o melhor método para o controle do biofouling, pois, além dos biocidas deformarem os componentes das membranas, eles também podem piorar a situação do biofouling.
Baker & Dudley (1998) demonstraram que é possível que algumas bactérias sobrevivam à desinfecção realizada por biocidas através da secreção de matriz de
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exopolisssacarídeos (EPS) pelo biofilme. Esta matriz age como um mecanismo de defesa que, por sua vez, torna a bactéria resistente ao biocida e, consequentemente, mais difícil de ser eliminada. O surgimento de um novo biofilme, resistente ao biocida, pode causar problemas, uma vez que pode ser composto por uma alta proporção de EPS, o que pode resultar em perdas de eficiência ainda maiores do sistema de membranas. Além disso, é provável que micro-organismos não viáveis, presentes na água depois do tratamento com biocidas, possam agir como uma fonte de nutrientes ao biofilme remanescente, e também que os próprios biocidas, que podem ser quebrados em componentes menores, possam se tornar disponíveis como nutrientes para os micro-organismos do biofilme remanescente ou do novo biofilme.
Dessa forma, devido às dificuldades na remoção dos biofilmes e à deficiência nas estratégias de eliminação e controle, novas tecnologias têm sido elaboradas. Entretanto, pouco se sabe a respeito das comunidades microbianas que formam biofilmes sobre as membranas, tornando necessárias mais investigações em todos os aspectos da formação de biofilmes, a começar por sua composição (Flemming, 2002; Chen et al., 2004; Bereschenko et al., 2010a; Herzberg et al., 2010; Lee et al., 2010).
2.3. Biofilmes
Bactérias são capazes de colonizar praticamente qualquer superfície e têm sido encontradas em condições extremas como temperaturas entre -12ºC e 110ºC e ambientes com o valor de pH entre 0,5 e 13. Quando associadas a um biofilme, são ainda mais resistentes, podendo resistir a biocidas que a mesma bactéria no seu estado planctônico não resistiria; ou seja, estar em um biofilme oferece vantagens às bactérias em relação ao seu estado de vida livre (Baker & Dudley, 1998).
Biofilmes podem se formar sobre uma diversidade de superfícies, incluindo tecidos vivos, dispositivos médicos e tubulação de sistemas de água. A interface sólido-líquido entre uma superfície e um meio aquoso fornece um ambiente ideal para a fixação e crescimento de micro-organismos e formação de biofilmes (Donlan, 2002).
Os biofilmes são definidos como comunidades microbianas sésseis, caracterizadas por conter células que deixam suas formas de vida planctônicas e se
7 aderem irreversivelmente a um substrato ou a outras células; e que permanecem mergulhadas em uma matriz de exopolissacarídeos (EPS), produzidos e secretados por elas próprias (Donlan, 2002; Madigan et al., 2008; Kim et al., 2009).
Esta matriz pode ser responsável por 50% a 90% do carbono orgânico total do biofilme e pode variar em suas propriedades químicas e físicas, mas é principalmente composta de polissacarídeos. O EPS secretado atua como uma armação primária, que auxilia na fixação dos micro-organismos a uma superfície, e atua ainda como um material para manter as células do biofilme unidas. Por ser altamente hidratada, a matriz previne a dessecação do biofilme e, além disso, pode contribuir para a resistência a antimicrobianos, impedindo que os antibióticos sejam transportados para dentro do biofilme através da ligação direta a estes agentes. Partículas não celulares, como cristais minerais, partículas de corrosão ou argila, dependendo do ambiente no qual o biofilme se desenvolveu, também podem ser encontradas na matriz (Donlan, 2002).
Em relação à formação de um biofilme, o primeiro passo é a rápida adsorção de moléculas orgânicas em uma superfície. Esta camada orgânica altera a superfície e aumenta as chances da adesão microbiana subseqüente. O próximo passo é a adesão de micro-organismos à superfície condicionada; que é seguido de uma fase de adesões microbianas adicionais, do crescimento das células aderidas, e da sucessiva produção da matriz extracelular. Uma vez que o biofilme está estabelecido, ele fornece um ambiente ideal para a continuação do crescimento de micro-organismos, e pode atuar como uma armadilha para outras partículas orgânicas, que podem, rapidamente, ser transformadas em biomassa (Ahmad et al., 2000).
Em resumo, a formação de um biofilme é constituída por cinco fases: adesão reversível, adesão irreversível e formação de microcolônias, secreção de matriz extracelular e maturação, e dispersão (Figura 1).
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Figura 1. Estágios de formação e vida de um biofilme (Adaptado de O’Toole et al., 2000).
Conforme já citado, enquanto o biofilme amadurece, a quantidade de matriz extracelular produzida aumenta, e, segundo Madigan (2004), esta matriz é um dos principais agentes atuando no aumento da resistência dos biofilmes e torna a sua remoção mais difícil. Diferentes agentes antimicrobianos, como o cloro, por exemplo, podem ser utilizados para remover os biofilmes de superfícies ou evitá-los. Entretanto, os micro-organismos podem não ser afetados por estes agentes, seja pela resistência adquirida ou pelo efeito do estresse causado pelos biocidas que estimulam a secreção da matriz de exopolissacarídeos, dificultando a eliminação dos biofilmes.
Portanto, o conhecimento acerca da composição microbiana destas comunidades é essencial para conhecer os mecanismos de formação e manutenção do biofilme pelos micro-organismos, tais como mecanismos de quorum-sensing e estruturas de motilidade. Somente desta maneira, estratégias mais eficazes e de remoção e pré-tratamento das superfícies afetadas poderão ser elaboradas e aplicadas com sucesso.
2.3.1. Quorum-sensing
O termo Quorum-sensing (QS) é utilizado para descrever um fenômeno que depende da densidade de células bacterianas, onde uma população mínima, ou quorum, é requerida para iniciar um determinado comportamento. Apesar das vias serem complexas, uma característica universal é de que apenas um pequeno grupo de
9 moléculas sinalizadoras desempenha papéis fundamentais do QS, estas moléculas recebem o nome de auto-indutores (AI) (Shrout & Neremberg, 2012).
Em geral, a produção dos auto-indutores é contínua pelas células da comunidade, permanecendo em um nível basal, mas as respostas a estas moléculas apenas se iniciam quando os níveis delas atingem uma concentração ideal. Conforme a população cresce, a concentração dos AIs aumenta, pois há mais produtores presentes (Kim et al., 2009; Shrout & Neremberg, 2012). Os AIs são, a partir disso, reconhecidos pelas células e utilizados para coordenar o comportamento da população ou comunidade microbiana regulando a expressão de genes (Hentzer & Givskov, 2003; Kappachery et al., 2010; Ponnusamy et al., 2010; Yu et al., 2012).
O QS pode ocorrer entre células de uma única espécie de bactérias, bem como entre espécies distintas, e diferentes moléculas podem ser usadas como sinais. As classes comuns de auto-indutores são os oligopeptídeos em bactérias Gram-positivas; as N-acil homoserina lactonas (AHL) em bactérias Gram-negativas e uma família de auto-indutores conhecidos como auto-indutor-2 (AI-2) em ambas as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (Miller & Bassler, 2001).
Mecanismos de QS já foram identificados e caracterizados em diversas bactérias, entre elas: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Acinetobacter sp., Aeromonas sp. e Vibrio fischeri. Estas bactérias utilizam o quorum-sensing para diferentes atividades, seja para controlar fatores de virulência, a formação de biofilmes, a resistência a antibióticos ou produzir bioluminescência (Sauer & Camper, 2001; Cornelis, 2008).
Em relação à formação e o comportamento dos biofilmes, apenas as questões ambientais como a concentração de substratos, pH da água e temperatura, eram consideradas importantes. Entretanto, após a descoberta dos mecanismos de QS, diversos pesquisadores têm demonstrado que este fenômeno está, também, envolvido na formação e manutenção de biofilmes, desempenhando um papel ativo na fixação celular e no comportamento dos micro-organismos (Waters & Bassler, 2005; Paul et al., 2009). Até o momento, cerca de 60% das bactérias isoladas de ambientes com biofouling tiveram moléculas envolvidas com o mecanismo de QS identificadas (Donlan, 2002; Kim et al., 2009; Shrout & Neremberg, 2012).
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Visto que o QS é importante na formação e manutenção dos biofilmes, este mecanismo tem sido alvo de manipulações para estimular ou inibir a sua formação. A interferência do QS é uma estratégia promissora no controle do comportamento e formação dos biofilmes e recebe o nome de Quorum Quenching (QQ) (Paul et al., 2009).
Pesquisas a respeito do QQ podem fornecer meios para controlar o crescimento de biofilmes sem utilizar agentes inibitórios de crescimento que, inevitavelmente, selecionam micro-organismos resistentes.
Compostos como o ácido salicílico, extratos de alho e de cranberry (oxicoco ou mirtilo-vermelho) têm mostrado vários níveis de propriedades anti-biofilmes em diversos estudos (Ren et al., 2005; Bjarnsholt et al., 2005; Yamanaka et al., 2007; Brackman et al., 2008). Furanonas, isoladas da alga vermelha marinha Delisa pulchera, são um dos compostos naturais mais estudados a respeito do seu papel na inibição de biofilmes (Kappachery et al., 2010; Yu et al., 2012). Pesquisadores demonstraram que biofilmes tratados com moléculas de QQ, como as furanonas, se tornaram mais suscetíveis a serem eliminados por biocidas (Hentzer et al., 2003; Rasmussen et al., 2005).
Dessa maneira, a remoção completa dos biofilmes pode se tornar possível quando o método biológico preventivo, mediado por QQ, é combinado com métodos químico, como os biocidas. Portanto, o QQ apresenta-se como uma tecnologia promissora para o controle do biofouling sobre superfícies (Paul et al., 2009).
No entanto, para o sucesso destas ferramentas, informações a respeito de quais são os micro-organismos que estão presentes nos biofilmes são necessárias, a fim de determinar os tipos de auto-indutores produzidos que, consequentemente, serão alvos dos mecanismos de QQ.
2.3.2. Estruturas de Motilidade
Diversas características são observadas como importantes na formação de um biofilme, tais como as condições do ambiente (temperatura, pH, características do substrato, disponibilidade de água e de nutrientes), a produção de exopolissacarídeos (EPS) e a comunicação inter-celular mediada pelos mecanismos de quorum sensing
11 (QS). Além destes fatores, a capacidade das células microbianas de se aderir a um substrato e as estruturas que elas utilizam para este fim são também importantes, pois interferem ativamente na eficácia da adesão das células sobre uma superfície.
Dentre estas estruturas celulares utilizadas para adesão, sabe-se que as estruturas de motilidade, tais como pili, fímbrias e flagelos possuem um papel importante nos estágios iniciais deste processo. Estas estruturas fornecem uma vantagem competitiva entre os organismos da comunidade, já que aqueles que conseguem se aderir e podem usufruir dos benefícios de se associar a um biofilme (Donlan, 2002; Bereschenko et al., 2010b).
Korber e colaboradores (2002) demonstraram a importância destas estruturas de motilidade na adesão de células. Eles utilizaram linhagens de P. fluorescens com e sem motilidade, e mostraram que as células com motilidade aderem em maior número em relação às células sem motilidade. Além disso, as células sem motilidade não são capazes de colonizar áreas em um substrato com a mesma eficácia que as células com motilidade, resultando numa formação mais lenta e fraca de um biofilme (Donlan, 2002).
Este aumento na eficácia da adesão pelas estruturas de motilidade pode estar relacionado à hidrofobicidade que elas fornecem aos micro-organismos, auxiliando-os a superar a barreira de repulsão eletrostática que existe entre a célula e substrato (Rosenberg & Kjelleberg, 1986).
Até hoje, foram identificados diferentes tipos de motilidade microbiana, relacionados a diferentes tipos de estrutura. Alguns dos mais conhecidos são: swarming, swimming e o twiching (Figura 2).
Figura 2. Esquema dos tipos de motilidade twiching, swarming e swimming, mediadas por pili e flagelo (Adaptado de Kearns, et al., 2010).
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A motilidade do tipo twiching é um tipo de movimento bacteriano sobre superfícies e é independente de flagelos. Ela ocorre pela extensão e retração de pili tipo IV, que operam de uma forma semelhante a um gancho (Mattick, 2002).
A motilidade do tipo swarming é uma locomoção rápida (2–10 μm/s) e coordenada de uma população de bactérias em superfícies sólidas ou semi-sólidas. Este tipo de motilidade foi primeiramente relatado por Jorgen Henrichsen (1972) e já foi caracterizado nos gêneros: Serratia, Salmonella, Aeromonas, Bacillus, Yersinia, Pseudomonas, Proteus, Vibrio e Escherichia (McCarter & Silverman, 1990; Burkart, 1998; Eberl et al., 1999; Young et al., 1999; Kirov et al., 2002; Kearns & Losick, 2004; Tremblay et al., 2007; Rather, 2005).
A motilidade do tipo swimming é um tipo de movimento produzido através da ação de flagelos, mas difere do swarming, pois as células se movem individualmente e de maneira aleatória (Henrichsen, 1972).
A partir do conhecimento acerca das estruturas e tipos de motilidade, estratégias de interferência da adesão, direcionadas a estas estruturas, podem ser aplicadas nos micro-organismos formadores de biofilme, auxiliando na sua remoção. Além disso, se esta interferência ocorrer antes da adesão microbiana, pode ser que os biofilmes não venham a se formar, evitando os problemas que eles causam em diferentes substratos. Para isso, entretanto, é necessário conhecer a comunidade microbiana do biofilme, a fim de determinar quais são os micro-organismos que o formam e, assim, definir as estratégias a serem aplicadas de maneira específica.
2.4. Estudo de Comunidades Microbianas
Compreender a diversidade microbiana tem sido a ambição de microbiologistas por décadas. Características morfológicas e bioquímicas são bastante utilizadas para caracterizar e identificar os constituintes de comunidades microbianas (Muyzer et al., 1993; Klindworth et al., 2013). No entanto, estas características são analisadas por métodos dependentes de cultivo que podem falhar na mimetização das condições particulares que os micro-organismos necessitam para a proliferação no seu habitat natural e, além disso, muitos micro-organismos podem ficar ligados a partículas do
13 sedimento e, assim, não serem detectados por microscopia convencional ou métodos tradicionais de plaqueamento e cultivo (Muyzer et al., 1993, Herzberg et al., 2010).
Estes métodos clássicos, apesar de importantes e rotineiramente utilizados, fornecem informações sobre apenas 0,01 a 3% dos micro-organismos presentes em ambientes naturais (Bereschenko et al., 2008a). Portanto, cada vez mais, os especialistas da área buscam por técnicas que permitam complementar as informações encontradas através dos métodos clássicos da microbiologia (Gillan et al., 1998).
Neste sentido, a aplicação de metodologias de biologia molecular para estudar a diversidade e ecologia de micro-organismos em ambientes naturais tem se disseminado amplamente nas últimas décadas (Head et al., 1998; Muyzer & Smalla, 1998; Dowd et al., 2008). Esta abordagem molecular tem sido otimizada e adaptada para superar as limitações impostas pelas metodologias dependentes de cultivo no estudo de populações microbianas. Ela pode fornecer uma representação mais precisa da estrutura da comunidade microbiana, melhorando a capacidade de detectar e identificar micro-organismos que não poderiam ser acessados pelos métodos clássicos (Ferris et al., 1996; Herzberg et al., 2010).
2.4.1. Ferramentas Moleculares e Genes Ribossomais 16S
A aplicação de técnicas de biologia molecular para detectar e identificar micro-organismos é cada vez mais recorrente, uma vez que oferecem uma perspectiva mais abrangente e precisa da composição de comunidades microbianas e são um complemento para as metodologias dependentes de cultivo (Muyzer et al., 1993; Muyzer & Smalla, 1998).
Devido à ubiquidade das moléculas de RNA ribossomal (RNAr) em todas as formas de vida celular, a análise comparativa das suas sequências pode ser aplicada universalmente para inferir relações entre organismos (Chun et al., 1999; Lim et al., 2012). As moléculas de RNAr compreendem domínios de sequências altamente conservadas, intercaladas com regiões mais variáveis. Enquanto a presença destas regiões variáveis permite que estes genes sejam utilizados como uma ferramenta de classificação, a presença de regiões conservadas permite a elaboração de primers e
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sondas universais para acessar as informações contidas nestes genes (Pei et al., 2010; Vetrovsky & Bladrian, 2013). Por isso, uma das abordagens moleculares mais comuns no estudo de comunidades microbianas tem sido a utilização dos genes RNAr. Esta prática mostra-se eficaz na exploração de ambientes microbianos e na identificação de micro-organismos ainda não cultivados.
O ponto de partida desta ferramenta é a extração de ácidos nucléicos, seguida da amplificação dos genes RNAr por PCR (Polimerase Chain Reaction), através da utilização de primers específicos para as regiões conservadas. Os produtos de PCR podem, então, ser utilizados para diferentes metodologias. Em bibliotecas gênicas, por exemplo, estes fragmentos de DNA são clonados por meio de kits disponíveis comercialmente e sequenciados (Head et al., 1998; Tringe & Rubin, 2005; Liu et al., 2005). Uma vez que os dados de sequenciamento tenham sido gerados, análises filogenéticas podem ser realizadas, determinando a diversidade da comunidade microbiana através da comparação com sequências publicadas anteriormente em bases de dados confiáveis, ou seja, de maneira independente do cultivo dos micro-organismos (Head et al., 1998).
Estas metodologias baseadas nos genes RNAr têm sido utilizadas com frequência para analisar a estrutura de comunidades microbianas em sistemas marinhos, de água doce ou de tratamento de água, como sistemas de osmose inversa.
Ferramentas moleculares, tais como DGGE e bibliotecas de genes RNAr 16S, têm sido usadas para identificar micro-organismos em diferentes ambientes aquáticos (Bernard et al., 2001; Williams et al., 2004; Langmark et al., 2005). Pang e Liu (2007), por exemplo, investigaram a composição microbiana de biofilmes formados em membranas de osmose inversa através da construção de uma biblioteca de genes RNAr 16S e da técnica de fingerprinting genético RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
Em 2008, Bereschenko e colaboradores realizaram um estudo de diferentes pontos de um sistema de filtração por membranas de osmose inversa, tais como a água de alimentação, paredes de tanques de armazenamento, filtros e membranas com biofouling, através de bibliotecas de genes RNAr 16S e DGGE. Eles evidenciaram as
15 alterações no sistema em relação ao tempo e a importância de diferentes micro-organismos na formação dos biofilmes neste sistema.
Além de bibliotecas gênicas e métodos de fingerprinting, outras ferramentas de biologia molecular também podem ser utilizadas. Khan e colaboradores (2011) utilizaram uma metodologia que consiste na aplicação de sondas para diferenciar células vivas e mortas, mostrando um perfil da atividade de micro-oganismos presentes em um sistema de membranas de osmose inversa. Ashhbab et al. (2014) e Klindworth et al. (2013) também analisaram a comunidade microbiana presente em um sistema de membranas, mas utilizaram o sequenciamento em larga escala de genes RNAr 16S. Outra possibilidade bastante utilizada é a combinação de metodologias clássicas da microbiologia com as ferramentas moleculares no estudo de comunidades microbianas em ambientes aquáticos. Os trabalhos de Chen et al. (2004) e Zhang et al. (2011) são exemplos da utilização desta abordagem polifásica para investigar a variabilidade e a composição de biofilmes em sistemas de osmose inversa.
Portanto, visto que diferentes trabalhos têm utilizado metodologias independentes de cultivo baseadas em genes RNAr 16S, a aplicação destas ferramentas tornou-se importante e essencial para realizar um estudo mais completo de comunidades microbianas, permitindo que micro-organismos ainda não cultivados presentes em amostras ambientais possam ser detectados, suprindo as deficiências das ferramentas clássicas da microbiologia.
2.4.2. DGGE: Fingerprinting genético
Dentre as ferramentas moleculares disponíveis para estudar a composição de comunidades microbianas através dos genes de RNAr, as técnicas de fingerprinting genético são bastante utilizadas. Elas são interessantes para determinar a diversidade de micro-organismos em diversos ecossistemas e para monitorar o comportamento de comunidades microbianas através de mudanças no tempo e/ou espaço (Rôças et al., 2004). Estas técnicas fornecem padrões da diversidade genética que refletem a complexidade das comunidades estudadas (Muyzer & Smalla, 1998).
De acordo com Cairns e colaboradores (2011), dentre as técnicas de fingerprinting, uma das que mais se destaca é a Eletroforese em Gel de Gradiente
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Desnaturante, ou Denaturating Gradient Gel Eletrophoresis (DGGE). Esta metodologia tornou-se uma poderosa ferramenta para análise da diversidade bacteriana em vários ambientes naturais, incluindo o marinho, lagos e solos, sendo que, dentro de um curto período de tempo, esta metodologia atraiu a atenção de muitos microbiologistas ambientais, sendo, atualmente, utilizada em muitos laboratórios (Muyzer & Smalla, 1998; Rôças et al., 2004).
Murray e colaboradores (1996), por exemplo, utilizaram o DGGE para comparar a diversidade filogenética de agregados de micro-organismos em dois estuários. Já Ferris e colaboradores (1996) utilizaram a técnica para analisar o perfil da distribuição de populações microbianas que habitam regiões com diferentes temperaturas em uma comunidade de cianobactérias de fontes termais (Ferris et al., 1996). Dowd e colaboradores (2008) utilizaram esta ferramenta para estudar comunidades microbianas formadoras de biofilmes em implantes médicos, enquanto Zwart et al. (1998) usaram DGGE para determinar a presença de diversos membros pertencentes ao grupo Verrucomicrobiales em um lago de água doce na Holanda. Heuer et al. (1997) usaram DGGE para estudar a diversidade genética de actinomicetos em diferentes solos, e para monitorar mudanças em sua abundância em rizosfera de batata.
No estudo de comunidades microbianas presentes em sistemas de osmose inversa, a utilização dessa técnica também é bastante comum. Bereschenko e colaboradores (2008a) utilizaram DGGE para revelar as diferenças entre a comunidade bacteriana de biofilmes presentes em diferentes pontos de um sistema de osmose inversa. Em 2007, Ivnitsky e colaboradores utilizaram DGGE para rastrear as mudanças que ocorreram em biofilmes na superfície de membranas em função da temperatura, tempo de operação e fonte de água de alimentação. Zhang et al. (2006) utilizaram DGGE para analisar as variações na composição de biofilmes que se formam em sistemas de membranas de osmose inversa e em sistemas de distribuição de água potável. Raulio e colaboradores (2012) também utilizaram esta ferramenta molecular para analisar biofilmes presentes em sistemas de membrana de osmose inversa utilizados na dessalinização de água do mar e de água salobra.
Para realizar o DGGE, amplificações de uma região do gene RNAr 16S ou um gene funcional são realizadas previamente. Uma sequência rica em guaninas (G) e
17 citosinas (C) é adicionada à extremidade 5' de um dos primers, co-amplificada e, assim, introduzida nos fragmentos amplificados (Sheffield et al., 1989; Sheffield et al., 1992). Esta sequência rica em GC, denominada de grampo, funciona como um domínio de elevado ponto de fusão impedindo que as duas fitas de DNA se dissociem completamente. O comprimento desta sequência de citosinas e guaninas pode variar entre 30 e 50 nucleotideos (Muyzer & Smalla, 1998).
Após a amplificação, os produtos resultantes, essencialmente do mesmo tamanho, são separados em bandas durante uma eletroforese em gel de poliacrilamida contendo um gradiente linear crescente de agentes desnaturantes (uma mistura de uréia e formamida) (Kawai et al., 2001). Esta separação é baseada na diminuição da mobilidade eletroforética do fragmento de DNA dupla fita parcialmente desnaturada pelo gradiente de agentes desnaturantes (Muyzer & Smalla, 1998). A desnaturação parcial faz com que a migração dos fragmentos cesse, formando diversas bandas no gel (Muyzer et al.,1993; Ferris et al., 1996). Além do padrão das bandas, que fornece informações a respeito da diversidade das comunidades analisadas, a excisão destas bandas, sua re-amplificação e sequenciamento, podem fornecer informações a respeito da constituição destas comunidades, ou seja, os micro-organismos que a formam podem ser identificados a partir do gel desnaturante (Head et al., 1998).
Em resumo, o DGGE caracteriza-se como uma técnica adequada, rápida e confiável para investigar a distribuição temporal e espacial de populações de micro-organismos, tratando-se, portanto, de uma metodologia ideal para estudos de ecologia microbiana (Head et al., 1998; Muyzer & Smalla, 1998).
Porém, como qualquer metodologia, o DGGE também possui limitações. Uma delas é que a técnica permite apenas a separação de fragmentos relativamente pequenos, até 500 pares de bases. Isso limita a quantidade de informação para inferências filogenéticas, bem como para o desenho dos primers. Além disso, em geral, as técnicas eletroforéticas exibem apenas os fragmentos de DNA obtidos a partir das espécies predominantes na comunidade, podendo subestimar a diversidade real da amostra. Outro limite da técnica é que os fragmentos de DNA amplificados podem migrar de maneira agregada e apresentar apenas uma banda, novamente subestimando a diversidade da comunidade analisada (Muyzer & Smalla, 1998).
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Portanto, considerando os vieses e limitações de todos os métodos, apenas uma abordagem integrada, que combina técnicas de biologia molecular, novas estratégias de isolamento e caracterização fisiológica dos isolados obtidos, irá revelar o papel da diversidade microbiana no funcionamento dos ecossistemas (Muyzer & Smalla, 1998).
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivos Gerais:
Este trabalho teve como objetivos caracterizar e monitorar a diversidade microbiana em um sistema de tratamento de efluentes de refinaria de petróleo por duas diferentes abordagens: dependente e independente de cultivo.
3.2. Objetivos específicos:
Comparação da comunidade microbiana presente nas membranas de osmose inversa com grupos planctônicos predominantes na água de alimentação do sistema, por métodos independentes e dependentes de cultivo;
Monitoramento da diversidade da comunidade microbiana nas membranas, nas diferentes fases de formação do biofilme;
Determinação da composição da comunidade microbiana na água de alimentação e no biofilme formado nas membranas de osmose inversa;
Determinação dos potenciais micro-organismos responsáveis pelos estágios iniciais da formação do biofilme.
4. ESTRUTURA
Esta dissertação foi dividida em dois capítulos. O Capítulo 1 é constituído do artigo publicado no periódico internacional World Journal of Microbiology and Biotechnology intitulado “Culturable bacterial diversity from a feed water of a reverse
19 osmosis system, evaluation of biofilm formation and biocontrol using phages”. Neste artigo estão descritas as etapas de isolamento, identificação e testes de motilidade de bactérias provenientes de uma amostra de água de alimentação do sistema de membranas de osmose inversa utilizado neste trabalho.
Os ensaios relacionados ao isolamento e caracterização de fagos foram realizados pelo grupo de pesquisa do Professor Dr. Sérgio Oliveira de Paula, na Universidade Federal de Viçosa (UFV), e os ensaios de formação de biofilmes pelos isolados foram realizados pela Dra. Virgínia Medeiros de Siqueira na Divisão de Recursos Microbianos (DRM) do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
O Capítulo 2 trata de um novo isolamento e testes de motilidade a partir de outra amostra de água de alimentação utilizada no sistema de membranas. Além disso, também trata das análises independentes de cultivo desta amostra de água, assim como das membranas deste sistema, através da construção de bibliotecas gênicas e DGGE.
21
CAPÍTULO 1
Belgini, D.R.B., Dias, R.S., Siqueira, V.M., Valadares, L.A.B., Albanese, J.M., Souza, R.S., Torres, A.P.R., Sousa, M.P., Silva, C.C., S.O. De Paula, Oliveira, V.M. (2014). Culturable bacterial diversity from a feed water of a reverse osmosis system, evaluation of biofilm formation and biocontrol using phages. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 30(10): 2689-700.
A árvore filogenética apresentada neste trabalho, referente à identificação dos isolados (página 26) pode ser encontrada em melhor resolução junto aos anexos.
35
________ CAPÍTULO 2
Diversidade e Dinâmica da Comunidade Bacteriana em Sistema de Osmose Inversa que trata efluente de uma Refinaria de Petróleo
36
2.1. INTRODUÇÃO
A água é um recurso natural que foi considerado renovável pela população mundial e teve utilização indiscriminada por muitos anos. Apenas quando a sua importância e esgotabilidade foram comprovadas, a água passou a ser tratada como um bem de consumo, portanto, passível de cobrança sobre seu uso e descarte (Nascimento, 2004). A partir de então, políticas para a gestão deste recurso, assim como a aplicação de leis e multas sobre o consumo excessivo e descarte inapropriado, vem sendo criadas. Por isso, setores da sociedade como o setor agrícola e industrial, que utilizam grandes quantidades de água, têm investido na busca de alternativas para reduzir o consumo e tecnologias para tratar, reutilizar e descartar adequadamente os efluentes gerados, evitando possíveis cobranças e aumento nos valores de seus produtos finais.
Dentre as indústrias que fazem o reuso de água e tratam seus efluentes, pode-se dizer que as refinarias de petróleo se destacam em relação às demais (Teixeira & Ávila, 2004). Diversas metodologias são utilizadas por estas indústrias para este tratamento, porém, uma das que mais se sobressaem é a tecnologia de membranas de osmose inversa, pois oferece vantagens como: durabilidade, baixo consumo de energia, alta produtividade e eficiência na remoção de uma ampla variedade de contaminantes (Nascimento, 2004). Entretanto, apesar de sua eficiência, os sistemas de membranas de osmose inversa sofrem constante obstrução durante sua operação e necessitam de contínua manutenção e limpeza. Esta obstrução ocorre principalmente pelo crescimento de comunidades de micro-organismos, o que pode causar perda severa de desempenho.
Dessa forma, este trabalho teve como objetivo a caracterização detalhada das comunidades microbianas presentes em um sistema de tratamento de efluentes a fim de possibilitar, a partir do conhecimento gerado, a elaboração de estratégias específicas mais eficientes para o controle e a eliminação dos biofilmes, evitando gastos com a manutenção e substituição das membranas dentro das refinarias de petróleo.
37 Isolamento e identificação de micro-organismos – Métodos dependentes de cultivo
Comparação entre os grupos presentes nas membranas e aqueles presentes na água de
alimentação
Determinação dos micro-organismos responsáveis pelo
início da formação do biofilme Caracterização dos grupos
planctônicos presentes na Água de Alimentação
ação do Sistema de Osmo e Inversa
Caracterização das comunidades microbianas nas Membranas de
Osmose Inversa
Monitoramento da diversidade das comunidades presentes nas membranas através de DGGE
Excisão de Bandas do DGGE e Construção de Bibliotecas de Genes
RNAr 16S Construção de Biblioteca de DNAr 16S – Método independente de cultivo 2.2. MATERIAL E MÉTODOS 2.2.1. Estrutura do Trabalho 2.2.2. Água de alimentação 2.2.2.1. Amostragem
A coleta da amostra de água de alimentação do sistema de osmose inversa da refinaria Gabriel Passos (REGAP - Betim, MG) foi realizada pela equipe técnica da
38
Petrobrás, com a utilização de tubos estérilizados e luvas para evitar contaminação. Em seguida, esta amostra foi imediatamente transportada para os laboratórios da Divisão de Recursos Microbianos (CPQBA/UNICAMP) e mantida sob refrigeração a 4 oC. A amostra enviada foi denominada de Água de Alimentação 2 (AO2) e foi coletada em 25 de Julho de 2012. A amostra AO2 faz parte da mesma amostra de água de alimentação utilizada no sistema piloto de membranas de osmose inversa.
2.2.2.2. Isolamento
O isolamento foi realizado inoculando-se 100 µL da água em diferentes meios de cultura sólidos específicos para o crescimento de bactérias, e.g. Agar Nutriente (AN), Agar Triptona de Soja (TSA) e Agar extrato de levedura-extrato de malte (ISP2). A cada 24 h foi observado se houve crescimento de colônias bacterianas, por um período total de 5 dias.
As colônias bacterianas foram caracterizadas por macro-morfologia, e.g. cor, tamanho da colônia, presença de pigmento e formato das bordas, e aquelas com diferentes morfologias foram repicadas para novo meio de cultura para verificação da pureza e utilização em experimentos futuros.
2.2.2.3. Coloração de Gram e Testes de Motilidade
Os isolados foram caracterizados quanto à composição da sua parede celular através da coloração de Gram (cristal violeta por 1 minuto, lugol por 1 minuto, álcool 95% por 30 segundos e safranina por 30 segundos).
Nos testes de motilidade, seguindo protocolo descrito por Déziel et al. (2001), foram analisadas as capacidades de movimento bacteriano unicelular por pili (twitching), movimento bacteriano multicelular por rotação flagelar (swarmming) e movimento bacteriano unicelular por rotação flagelar (swimming). Para twitching e swarmming foi feita uma suspensão bacteriana em água destilada e esterilizada e inoculados 10 µL na superfície do meio de cultura King B (peptona 20,0 g; glicerol 10,0 mL; dipotássio de fosfato 1,5 g; sulfato de magnésio 7,0 g, H2O 1,5 g; e água destilada
39 swarmming, respectivamente. Para swimming, os isolados foram inoculados com alça em agulha através do meio de cultura King B contendo 0,3% de Agar.
2.2.2.4. Extração de DNA dos Isolados
Para extração de DNA dos isolados bacterianos obtidos da água de alimentação, foi utilizado protocolo descrito por Van Soolinger et al. (2003), específico para a extração de DNA de bactérias Gram negativas e positivas.
A integridade e concentração do DNA foram avaliadas através de eletroforese em gel de agarose 0,8% corado com 0,02 μL/mL SYBR Safe 10.000x in DMSO (Invitrogen).
2.2.2.5. Extração de DNA Total da comunidade microbiana
Para a análise independente de cultivo, cerca de 1 L da amostra AO2 foi submetida à filtração a vácuo, com a utilização de membrana Millipore (0,22 m) para concentração dos micro-organismos presentes na água. A membrana foi mantida em tubo Falcon de 15 mL contendo aproximadamente 5 L de Tampão Fosfato Salino (PBS). Após agitação do tubo contendo a membrana, as células se desprenderam e permaneceram suspensas no tampão. Este tampão foi transferido para um micro-tubo de 1,5 mL no qual as células foram precipitadas através de centrifugação.
As células precipitadas foram suspensas em 1 mL de tampão PBS e submetidas à extração de DNA total utilizando uma combinação dos protocolos descritos por Groβkopf et al. (1998) e Neria-Gonzáles et al. (2006). O procedimento consistiu na adição de 100 μL de lisozima (C=100 mg/mL) aos micro-tubos contendo as células recuperadas da água, seguida da incubação a 37ºC durante 60 minutos, com agitação manual a cada 10 minutos. Posteriormente, foram adicionados 50 μL da enzima proteinase K (10 mg/mL) e 200 μL de SDS 10% e uma nova incubação a 60ºC durante 60 minutos foi realizada, com agitação manual a cada 10 minutos. Então, os frascos foram submetidos a três ciclos “freeze-thaw” (ciclos de 2 minutos a 65ºC, alternados por 2 minutos em nitrogênio líquido), de forma a promover a lise mecânica das paredes celulares microbianas. Em seguida, o conteúdo de cada um dos micro-tubos foi dividido
40
e um volume igual de fenol saturado em Tris-HCl (pH 8,0) foi adicionado. Após centrifugação, a fase superior aquosa foi transferida para novo micro-tubo ao qual foi acrescentado clorofórmio: álcool isoamílico (na proporção de 24:1). A fase superior novamente foi transferida para novo micro-tubo de 1,5 mL e precipitada com 10% v/v de NaCl 5 M e 2 volumes de etanol absoluto gelado. Após precipitação do DNA, o pellet foi lavado por 3 vezes com etanol 70% gelado. Depois de seco a 28°C, o DNA foi suspenso em aproximadamente 50 μL de água ultra-pura esterilizada e estocado em freezer a -20ºC.
A integridade e concentração do DNA foram avaliadas através de eletroforese em gel de agarose 0,8% corado com 0,02 μL/mL SYBR Safe 10.000x in DMSO (Invitrogen).
2.2.2.6. Amplificação e Purificação de Genes RNAr 16S
O DNA obtido dos isolados e da água de alimentação foi utilizado em reações de PCR para amplificação do gene RNAr 16S usando-se o par de primers 10f (5´ - GAG TTT GAT CCT GGC TCA G - 3´) e 1100r (5´ - AGG GTT GGG GTG GTT G - 3´) (Lane et al., 1991). O programa de amplificação utilizado consistiu de 1 ciclo a 95 °C por 2 minutos; 30 ciclos a 94 °C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto e 72°C por 3 minutos; e 1 ciclo de extensão final a 72 °C por 3 minutos. Cada reação continha: tampão de PCR (Invitrogen) 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 μM de dNTP Mix (Invitrogen), 0,5 μM de cada
primer, 2,0 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen), e 5,0 μL (~50 ng) da amostra de DNA; em um volume final de 25 L.
Os resultados de amplificação dos fragmentos do gene RNAr 16S foram confirmados em gel de agarose 1%, corados com 0,02 μL/mL SYBR Safe 10.000X in DMSO (Invitrogen).
Os produtos de PCR dos isolados foram purificados utilizando mini-colunas (GFX PCR DNA and gel band purification kit, GE Healthcare).
2.2.2.7. Sequenciamento dos Genes RNAr 16S dos Isolados
O sequenciamento dos fragmentos de DNAr 16S provenientes dos isolados foi realizado em sequenciador automático ABI 3500 XL (Life Technologies). A reação de
41 sequenciamento foi constituída de 1 µL de DNA (aproximadamente 10 ng de DNA), 0,5 µL de um único primer (foward ou reverse) (5 mM), 2 µL de tampão Save Money (500 µL de MgCl2 50 mM e 1 mL de Tris-HCl 1 M pH 9,0), 2 µL do reagente Big Dye (Applied
Biosystems) e água q.s.p. 10 µL. As condições da reação foram: desnaturação inicial a 96°C durante 2 minutos, seguida de 26 ciclos, sendo cada ciclo constituído das etapas de desnaturação (96°C, 45 segundos), pareamento (50°C, 30 segundos) e extensão (60°C, 4 minutos). As reações foram realizadas em termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf).
Posteriormente, as reações de sequenciamento foram precipitadas, suspensas em formamida e então aplicadas no respectivo sequenciador automático
2.2.2.8. Análise Filogenética
As sequências parciais do gene RNAr 16S obtidas com cada primer foram montadas em uma sequência consenso (contig), combinando os diferentes fragmentos obtidos com ajuda do programa phredPhrap (Ewing et al., 1998).
Após a montagem do contig correspondente ao organismo alvo, este foi comparado com sequências de RNAr 16S de organismos representados nas bases de dados Genbank (http://www.ncbi.nem.nih.gov) e RDP (Ribosomal Database Project, Wisconsin, USA, http://www.http://rdp.cme.msu.edu/), usando as rotinas BLASTn e SequenceMatch, respectivamente. Foram, então, selecionadas sequências de organismos tipo relacionados ao organismo desconhecido para realização das análises filogenéticas. As sequências foram alinhadas utilizando o programa CLUSTAL X (Thompson et al., 1997) e analisadas com o software MEGA v. 4 (Tamura et al., 2007). As matrizes de distância evolutiva foram calculadas com o modelo de Kimura 2 p (1980) e a construção da árvore filogenética a partir das distâncias evolutivas foi feita pelo método de Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987), com valores de “bootstrap” calculados a partir de 1000 replicatas, utilizando as rotinas incluídas no software MEGA.
