Metabolismo de Membrana e Parede Celular

A parede celular bacteriana é composta, dentre outros componentes, por uma macromolécula complexa e majoritária denominada peptídeoglicana (também chamada de mucopeptídeo ou mureína) que confere rigidez à parede e conseqüente proteção contra variações osmóticas. As bactérias Gram-positivas possuem grandes quantidades de peptídeoglicanas, conferindo uma camada mais espessa à parede, assim como maior rigidez quando comparada com as bactérias Gram-negativas, as quais possuem uma fina camada de

peptídeoglicana em sua parede celular e é revestida pela membrana externa que, por sua vez é composta por fosfolipídios, lipoproteínas e lipopolissacarídeos (Pelczar et al., 1996)

Nas situações em que uma bactéria patogênica confronta-se com a célula hospedeira, todo um repertório de genes tem sua expressão alterada, com a conseqüente produção de proteínas necessárias ao seu desenvolvimento no ambiente em que se encontra, adaptando-se à situação de confronto à célula vegetal hospedeira. Como é sabido, em espécies de Xanthomonas, assim como de outras bactérias patogênicas, existe a necessidade de ancoragem de proteínas na membrana da célula bacteriana, de modo a permitir a adesão e interação com as células do hospedeiro e conseqüente sucesso na indução da doença. No entanto, para que o patógeno esteja preparado para o ataque ao hospedeiro, é necessário uma rearquitetura da membrana bacteriana assim como da parede celular (Lang, 2000).

Corroborando dados da literatura, neste estudo foi possível verificar que 6 genes relacionados ao metabolismo de membranas e da parede celular bacteriana tiveram sua expressão modificada, indicando uma readaptação destas estruturas macromoleculares na interação Xac::citros (Tabela 7).

Tabela 7. Expressão diferencial e temporal de genes relacionados ao metabolismo de parede e membrana bacteriana.

1 _{De acordo com a anotação do genoma da Xac;} 2_{d.a.i. = dias após a inoculação.}

Os valores encontrados nas colunas referentes à cinética de infecção correspondem aos níveis de expressão de cada gene (valor de M, Smyth, 2005) no referido tempo de infecção. Os valores positivos correspondem à indução gênica e os valores negativos referem-se à repressão gênica, e nos locais onde não há valores indica que não houve diferença de expressão quando comparado ao cultivo da bactéria em meio Caldo Nutriente. A coluna Distância do “PIP” apresenta a que distância o “PIP box” se encontra do início do ATG inicial do gene, e I indica que o “PIP box” se encontra internamente na ORF.

A indução da expressão do gene XAC1463 é um exemplo de resposta precoce ao contato com o hospedeiro. Este gene codifica uma proteína (406 aminoácidos) de membrana externa (predita pelo programa PSORT), uma enzima com atividade de fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32). Ela tem como substrato a fosfatidilcolina, produzindo o 2- acilglicerolfosfocolina, um componente da via do metabolismo de glicerofosfolipídeos. Um outro gene dessa mesma via metabólica também foi induzido durante a cinética de infecção. Trata-se do gene XAC0360, que codifica a enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase (EC 1.1.99.5), cujo produto é a dihidroxicetona fosfato, também um componente da via dos glicerofosfolipídeos. Esta via metabólica dos

EXPRESSÃO DIFERENCIAL NA CINÉTICA DE INFECÇÃO GENE1 12 horas 20 horas 3 d.a.i.2 5 d.a.i.

Produto gênico Consenso do “PIP” Distância _{do “PIP”}

XAC1463 0,98 fosfolipase tipo A1 nCGAA..N15..nCGAA I

XAC0360 1,75 2,12 2,81 2,88 glicerol-3-fosfato _{desidrogenase} nCGAA..N15..nCGAA 38 XAC1375 1,10 0,70 0,97 ciclopropano ácido graxo fosfolipídeo

sintase nCGAA...N15..nCGAA 260 XAC0618 0,76 0,77 0,89 proteína da biossíntese de glucano periplasmático TTCGC..N16..TTCGG I

XAC2542 1,60 1,62 permease de _aminoácidos GCGAA..N16..GCGAA I

glicerofosfolipídios resulta na biossíntese de constituintes fosfolipídicos da membrana. Outro gene relacionado com a síntese de fosfolipídios, XAC1375, também mostrou-se induzido a partir de 20 horas de cultivo em meio indutivo até o final da cinética de infecção em folha de laranjeira (5 dias). Este gene codifica uma proteína citoplasmática (451 aminoácidos) denominada ciclopropano ácido graxo fosfolipídeo sintase, que tem como substrato a S-adenosil-L-metionina e o ácido graxo fosfolipídico olifínico. Estes resultados sugerem que os genes XAC1463, XAC0360 e XAC1375, foram induzidos para permitir uma reorganização na composição de fosfolipídeos da membrana externa bacteriana, possibilitando uma adaptação da membrana para acomodar as novas proteínas necessárias para a situação de ataque à planta hospedeira.

O gene XAC0618, codificador de uma proteína integral de membrana relacionada com a biossíntese de glucanas periplasmáticas, foi induzido após 20 horas de cultivo em meio indutivo e nos tempos 3 e 5 dias após o contato da bactéria com a planta hospedeira. Esta enzima (EC 2.4.1.-) está implicada no metabolismo de parede celular. Os glucanos periplasmáticos osmorregulados (GPOs) são encontrados nos espaços periplasmáticos de bactérias Gram-negativas, e a concentração deste glucano bacteriano aumenta em resposta ao decréscimo de osmolaridade do ambiente em que a bactéria se encontra (Bohin, 2000). Esta condição de baixa osmolaridade possivelmente ocorre nos espaços intercelulares do vegetal durante o estabelecimento da bactéria (início da infecção), período este em que há pouca disponibilidade de nutrientes para o fitopatógeno. Page et al. (2001) relataram que mutantes deste gene GPOs em Erwinia chrysanthemi apresentaram-se não patogênicos em plantas hospedeiras e, interessantemente, também mostraram uma redução na síntese e secreção de pectato liase (enzima degradativa de componentes da parede celular do vegetal). Esta redução da produção de pectato liase está associada ao decréscimo de sua secreção através da

parede bacteriana, sugerindo que os GPOs são constituintes essenciais da parede, uma vez que favorecem a funcionalidade de secreção de pectato liase através da mesma. GPOs também foram relatados como necessários para o desenvolvimento de sintomas induzidos por P. syringae pv. syringae em feijoeiro, bem como para a resposta de hipersensibilidade em plantas não hospedeiras (Mukhopadhyay et al., 1988).

Um outro gene relacionado a constituintes de parede é o XAC0781, que codifica a enzima D-alanina-D-alanina ligase B (EC 6.3.2.4). Trata-se de uma proteína de 319 aminoácidos que de acordo com informações contidas no KEGG (“Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”), faz parte da via de biossíntese de peptídeoglicana. O gene XAC0781 mostrou-se reprimido em Xac após 20 horas de interação com o meio XAM1 e aos três dias de contato com a planta hospedeira. Enquanto a síntese de peptídeoglicanas, componentes da parede celular de Xac, está sendo reprimida (XAC0718), a síntese de GPOs e de fosfoglicerolipídeos de membrana (XAC1463 e XAC0360) estão sendo estimuladas, resultando em modificações na parede e membrana celular que poderiam estar atuando na capacitação da Xac em se instalar e se manter no hospedeiro.

O gene XAC2542, codificador de uma permease de aminoácidos, por sua vez, teve sua expressão aumentada aos 3 e 5 dias após a interação bactéria::planta, sugerindo um papel na captação de aminoácidos liberados pela ação do patógeno sobre as células vegetais atacadas.

Em síntese, os genes evidenciados a partir deste estudo como diferencialmente expressos e implicados na síntese de proteínas do metabolismo de membrana e parede bacteriana (Tabela 7), parecem ter sua expressão controlada segundo um mecanismo de regulação coordenado temporalmente a partir da interação com plantas cítricas hospedeiras. Após 12 horas da interação bactéria-planta, ou seja, no início do processo

infeccioso, o gene que codifica uma fosfolipase (XAC1463) tem sua expressão induzida, podendo levar à alteração na composição dos fosfolipídeos da membrana externa bacteriana e conseqüente adaptação da mesma à situação de ataque ao hospedeiro vegetal. Após 20 horas, 3 dias e 5 dias da interação com o hospedeiro, os genes XAC1375 e XAC0360, responsáveis pela síntese de compostos de fosfolipídeos tiveram sua expressão ativada, o que sugere uma complementação da ação fosfolipásica (XAC1463) na reestruturação da membrana externa da bactéria. A parede celular da Xac parece adaptar-se conjuntamente às modificações da membrana celular, pois um gene responsável pela produção de glucanas periplasmáticas (XAC0618) também foi induzido durante a infecção. Em paralelo, a aquisição de aminoácidos (XAC2542) pelo fitopatógeno é induzida (3 e 5 dias) após a ação degradativa da bactéria sobre a parede vegetal e conseqüente disponibilização de nutrientes na forma de aminoácidos.