Sistema de Captação de Ferro

A captação de ferro em bactérias requer um transporte ativo e é de grande importância por se tratar de um componente essencial para o seu metabolismo, atuando em processos como respiração, síntese de RNA e na inativação de espécies ativas de oxigênio (Wandersman & Delepelaire, 2004). Sob circunstâncias aeróbicas o ferro é oxidado rapidamente ao íon férrico (Fe3+), sendo esta forma de baixíssima solubilidade em pHs fisiológicos (Raymond & Dertz, 2004). A estratégia comum das bactérias Gram-negativas para a captação de ferro é a síntese de sideróforos, moléculas que possuem elevada afinidade para o íon férrico, capazes de quelar e reduzir Fe3+ para Fe2+. Os sideróforos secretados no meio externo se complexam com íons férrico (Fe3+) e são reconhecidos na superfície celular bacteriana por receptores específicos da membrana

externa, também conhecidos como receptores dependentes de TonB. Estes receptores se encontram na membrana externa e transportam o complexo siderófo/Fe2+ para o interior da célula bacteriana, com o auxílio de proteínas constituintes do Sistema Ton. O Sistema Ton de E. coli (Figura 24) consiste de três proteínas, TonB, ExbB e ExbD (numa razão molar de 1:7:2), que interagem umas com as outras formando um complexo que responde ao gradiente de protóns na membrana externa. Este sistema fornece energia necessária para que os receptores de sideróforos dependentes de TonB realizem o transporte unidirecional de sideróforos. A maioria das proteínas TonB são periplasmáticas e possuem a região N-terminal ancorada na membrana citoplasmática, enquanto um segmento específico da região C-terminal possui alta afinidade com um motivo da região N-terminal da proteína receptora de sideróforo denominado TonB box (Figura 24). Esta interação da proteína TonB com o motivo TonB box do receptor dependente de TonB favorece o transporte de íons de ferro para o interior da célula bacteriana (Braun & Braun, 2002; Carter et al. 2006).

O controle e regulação de expressão dos genes relacionados ao metabolismo de ferro estão ligados ao gene fur (“ferric uptake regulator”), sendo este um gene regulador do metabolismo de ferro em patógenos bacterianos. Em E.coli vários genes são regulados pelo fur, dentre eles os genes responsáveis pela síntese e transporte de sideróforos, genes codificadores de proteínas citoplasmáticas envolvidas na resposta ao estresse oxidativo e outros que codificam proteínas relacionadas a fatores de virulência, como colicinas e hemolisinas, indicando uma ligação entre as vias regulatórias do metabolismo de ferro e da expressão de fatores de virulência (Hantke, K., 2001).

Em Xac a síntese de sideróforos foi verificada “in vitro” por Etchegaray et al. (2004). Os resultados mostraram que a bactéria foi capaz de se desenvolver em meio de cultura líquido com deficiência de ferro e, após o cultivo das células bacterianas, o sobrenadante foi utilizado para ensaios de determinação de sideróforos.

Membrana externa

Membrana

Figura 24. Transporte de Fe3+ _{através da membrana externa de Escherichia coli. (Braun & Braun, 2002).}

Proteína receptora de sideróforo depenndente de TonB carregada Proteína receptora de

sideróforo depenndente de TonB não carregada

Fe3+

Região de alta afinidade entre a proteína TonB e proteína receptora de sideróforo

Os resultados obtidos neste trabalho revelaram a indução de quatro genes codificadores de receptores dependentes de TonB, sendo eles, XAC1276, XAC1435, XAC2672 e XAC1310, como apresentado na Tabela 8.

Tabela 8. Expressão diferencial e temporal de genes relacionados ao sistema de captação de ferro.

1 _{De acordo com a anotação do genoma da Xac;} 2_{d.a.i. = dias após a inoculação.}

Os valores encontrados nas colunas referentes à cinética de infecção correspondem aos níveis de indução de cada gene (valor de M, Smyth, 2005) no referido tempo de infecção. Nos locais onde não há valores indica que não houve diferença de expressão gênica quando comparado ao cultivo da bactéria em meio Caldo Nutriente. A coluna Distância do “PIP” apresenta a que distância o “PIP box” se encontra do início do gene, e I indica que o “PIP box” se encontra internamente na ORF.

O gene XAC1276 foi induzido 12 horas após o contato com o meio indutivo e codifica para uma proteína de 765 aminoácidos. O gene XAC1435 codifica uma proteína contendo 713 aminoácidos e também foi induzido no início do contato com o meio indutivo (12 horas) e até 20 horas após o contato com este meio. O gene XAC 2672 codifica uma proteína contendo 1075 aminoácidos e mostrou-se induzido aos três dias após o confronto com a planta hospedeira, enquanto o XAC1310, que codifica uma proteína de 869 aminoácidos, foi induzido nos tempos finais da cinética de infecção, ou seja, aos três e cinco dias após o contato com a planta hospedeira. De acordo com as

EXPRESSÃO DIFERENCIAL NA CINÉTICA DE INFECÇÃO GENE1 12 horas 20 horas 3 d.a.i.2 _d.a.i. 5

Produto gênico Consenso do “PIP” Distância _{do “PIP”}

XAC1276 1,60 receptor dependente de _TonB TTCGn..N15..TTCGn I

XAC1435 0,99 0,48 receptor de ferro _{dependente de TonB} nCGAA...N15..nCGAA 271

XAC2672 0,99 proteína Oar (receptor _{dependente de TonB)} nCGAA...N15..nCGAA I

predições geradas pelo programa PSORT, todas estas quatro proteínas induzidas ao longo da cinética de infecção são proteínas de membrana externa, o que viabilizaria o contato das mesmas com o complexo sideróforo-íons de ferro que se encontram no ambiente da célula hospedeira.

A indução da expressão de genes que codificam receptores de íons de ferro sugere que a Xac se encontra em meio pobre em ferro, tanto “in vitro” quanto “in vivo”, sendo que a maximização da captação de ferro implica no aumento da expressão dos receptores dependentes de TonB. Além disso, há uma seqüência temporal na indução desses receptores, com receptores expressos em períodos mais iniciais e outros em tempos intermediários da infecção.