Validação das Análises por RT-PCR Semi-quantitativa

A validação dos resultados obtidos nos ensaios do macroarranjo foi realizada pela técnica de PCR semi-quantitativa por transcrição reversa (RT-PCR), com três genes detectados como diferencialmente expressos (ORFs XAC0398, XAC0416 e XAC2370), utilizando os mesmos RNAs dos experimentos de macroarranjo. Como controle interno de expressão constitutiva, nas reações de RT-PCR semi-quantitativas, foi utilizada uma ORF que codifica o rDNA 16S (ORF XAC4291). Os oligonucleotídeos utilizados foram:

• XAC0398 5’-GATACGGTCACCCAAGATATG-3’ (“Foward”) 5’-ATGTGCGCGACGATGTTG-3’ (“Reverse”)

• XAC0416 5’-GCGCCAACTCGTCCTTCTTTC-3’ (“Foward”) 5’-AAGCCACCACCATTCTGC -3’ (“Reverse”)

• XAC2370 5’-TAGTGATTACCGACGTGC-3’ (“Foward”) 5’-ACAGGTTACGGATTGCTG-3’ (“Reverse”)

• XAC4291 5’-TAAGTGAAGAGTTTG-3’ (“Foward”) 5’-AGGGTATCTAATCCTGTTTG-3’ (“Reverse”)

“Amplicons” de 209 pb, 302 pb, 942 pb e 800 pb foram verificados para as XACs0398, 0416, 2370 e 4291, respectivamente.

Antecedendo as reações de RT-PCR, faz-se necessário o tratamento dos RNAs extraídos da Xac, no estádio infectante e no estádio não infectante, com DNase livre de RNase.

4.15.1 Tratamento de RNAs com DNase

Os RNAs totais extraídos da Xac no estádio infectante (cultivada por 12 e 20 horas em meio indutivo XAM1 e recuperada da planta aos 3 e 5 dias após a inoculação) e no estádio não infectante (cultivada em meio CN) foram tratados com DNase para a remoção de possíveis contaminantes de DNA genômico nas referidas amostras. Para tanto, foi utilizada a enzima desoxirribonuclease Ι (“Deoxyribonuclease I, Amplification Grade”, Invitrogen), segundo as especificações do fabricante. Após tratamento com DNase esses RNAs foram utilizados para a reação de RT-PCR semi-quantitativa. Como controle das reações de RT-PCR, os mesmos RNAs tratados com DNase foram utilizados para realização de uma PCR comum, com a enzima “Taq polimerase”, a fim de confirmar a ausência de DNA na amostra.

4.15.2 RT-PCR Semi-quantitativa

Para as reações de RT-PCR foi utilizado o kit "SuperScriptTM One-Step RT- PCR with Platinum Taq" da Invitrogen, de acordo com as especificações do fabricante. As reações foram realizadas com 250 ng de RNA tratado com DNase, em termomiclador Mastercycler Gradient (Eppendorf BioResearch, Hamburg, Germany), com um ciclo inicial de 50ºC por 30 minutos para a síntese de cDNA, seguido de ciclagem de PCR constituída por uma desnaturação inicial de 95ºC por 2 minutos e 20 ciclos de 95ºC por 45 segundos, seguidos da temperatura de anelamento adequada para cada oligonucleotídeo iniciador por 45 segundos, e 72ºC de extensão por no mínimo 30 segundos (esta extensão varia de oligo para oligo, sendo que se recomenda 1 minuto para cada 1 Kb de fragmento amplificado), e uma extensão final de 10 minutos por 72ºC. O volume total da reação (25 µl) contendo os produtos amplificados foi aplicado em gel de agarose 1,2% em tampão TBE 1X (Tris, ácido bórico e EDTA) e submetido à eletroforese (3V/cm). Após a eletroforese o material contido no gel foi transferido para membrana de náilon pelo método de “Southern blot” (Sambrook et al., 1989). Essa membrana foi então utilizada para validar a expressão diferencial de genes que contém consenso “PIP-box” evidenciados no macroarranjo, utilizando como sonda, fragmentos de PCR purificados correspondentes à seqüência dos respectivos genes amplificados a partir de DNA genômico da Xac.

4.15.3 “Southern blot”: Marcação de Sonda e Hibridação

As sondas utilizadas na hibridação dos “blots” contendo o produto das reações de RT-PCR, correspondentes aos genes XAC0398, XAC0416, XAC2370 e XAC4291, foram obtidas por amplificação por PCR do DNA genômico da bactéria. As reações de PCR foram efetuadas usando 1/10 de volume do tampão da enzima, 0,2 mM do mix de dNTPs (A, T, C, G), 2 mM de MgCl2, 0,4 pmoles de cada oligonucleotídeo, 0,2 U de

Taq polimerase (Gibco) e 100 ng de DNA genômico. Os ciclos de PCR utilizados foram: desnaturação inicial de 95ºC por 2 minutos, seguida por 35 ciclos de 95ºC por 45 segundos, 45 segundos de temperatura de anelamento (a temperatura foi adequada para cada oligonucleotídeo iniciador), 72ºC de extensão por no mínimo 30 segundos (esta extensão varia de oligo para oligo, sendo que se recomenda 1 minuto para cada 1 Kb de fragmento amplificado), e uma extensão final de 5 minutos por 72ºC. Os produtos amplificados foram visualizados em gel de agarose 1% e as sondas foram purificadas do gel para serem utilizadas na hibridização das membranas. Para a purificação dos fragmentos amplificados do gel de agarose foi utilizado o produto “S.N.A.P. gel purification kit” (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante.

A marcação direta das sondas de DNA foi realizada utilizando a enzima fosfatase alcalina termoestável e um agente quimiluminescente. Para tanto, foi utilizado o kit “Gene Images AlkPhos Direct Labelling and Detection System” (Amersham Biosciences). Este sistema de marcação e detecção é baseado na quimiluminescência do dioxetano. Isto envolve a marcação direta dos ácidos nucléicos utilizados como sonda com a enzima fosfatase alcalina termoestável. Esta marcação é alcançada pela completa desnaturação da sonda, permanecendo na forma de fita simples, seguido do “crosslinking” (ligação) covalente da enzima com o ácido nucléico (sonda marcada). O

reagente de detecção quimiluminescente CDP-Star (solução aquosa contendo 1,5% (w/v) de disódio 2-cloro-5-(4 metoxispiro [1,2-dioxetabe-3,2’-(5’-cloro)- triciclo[3,3,1,13,7]decan]-4yl) phenil fosfato) contém o substrato estabilizado dioxetano, que é degradado pela enzima fosfatase alcalina. Desta forma, quando o detector entra em contato com o complexo sonda-fosfatase, que leva à degradação do substrato, ocorre uma rápida emissão de luz por um breve período de tempo.

Os procedimentos de marcação de sonda, pré-hibridação, hibridação, lavagem da membrana e detecção de sinais foram realizados seguindo as recomendações do fabricante.

Após o processo final de geração de quimioluminescência, a membrana foi colocada em um cassete, em contato com um filme de raios-X (MXG/Plus, Kodak) para permitir a detecção do sinal quimioluminescente. A exposição foi feita na ausência de luz, à temperatura ambiente, por um período inicial de uma hora. Após a exposição, o filme foi revelado e fixado com os reagentes da Kodak. Se a exposição por uma hora gerava um sinal fraco no filme de raios-X, procedia-se nova exposição por um período maior utilizando-se um novo filme.

A quantificação do sinal produzido no filme pela sonda de cada ORF foi realizada através de análise densitométrica das autorradiografias em um equipamento Shimadzu modelo CS-9301, em um comprimento de onda de 550 nm, módulo de leitura em transmitância e zig zag. A área debaixo de cada pico foi calculada e representa a intensidade do sinal gerado em cada caso, que é o resultado da hibridação da sonda com o cDNA produzido a partir do RNA transcrito da ORF em questão. Quanto maior a quantidade de RNA transcrito, maior a quantidade de cDNA produzido e maior o sinal produzido no filme.

4.16 Análise de Promotores “PIP box” Através de Ensaios de Gene