3.1. Animais.
Camundongos selvagens C57BL/6 (WT), pesando entre 20-24g, de ambos os sexos, foram gentilmente doados pelo biotério da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) e comprados do biotério central da Universidade Federal Fluminense (UFF). Os animais foram mantidos sob condições controladas com ciclo de claro/escuro e acesso livre a ração e água. Os camundongos deficientes homozigotos para o receptor CCR4 (CCR4-/-) com fundo genético dos WT, também foram mantidos nas mesmas condições no biotério da FIOCRUZ.
Os procedimentos com os animais de experimentação foram realizados de acordo com as diretrizes da Comissão de Uso de Animais (CEUA) do centro de ciências da saúde (CCS) da UFRJ, conforme o protocolo n° DFBCICB 028.
3.2. Modelo de ligação do ceco e perfuração (CLP).
Para avaliar a sepse grave e a imunossupressão, animais WT e CCR4-/-foram previamente anestesiados intraperitonealmente com cetamina 112,5 mg/kg e xilazina 10 mg/kg. Após estarem anestesiados, a cavidade abdominal foi aberta com uma incisão de 1,5 cm, o ceco foi identificado, exposto para fora da cavidade e ligado com linha de algodão (4-0), de forma a não obstruir a passagem entre íleo e ceco. Em seguida, o ceco foi perfurado nove ou três vezes com uma agulha de 21G para induzir a sepse grave (grupo CLP ou em alguns experimentos foi designado como grupo L) ou uma sepse moderada (grupo SL), respectivamente. O ceco foi recolocado na cavidade abdominal que foi fechada com auxílio de grampo cirúrgico 9 mm. Após o procedimento cirúrgico, os animais receberam a administração subcutânea de solução salina (1,0 mL), para reposição volêmica. Os animais controles ou falso operados (grupo Sham) foram abertos e o ceco exposto, mas não foi ligado e perfurado (BAKER et al., 1983).
Os animais submetidos ao CLP ou Sham receberam tratamento com antibióticos (Ertapenem, Merck) que foi preparado no dia do uso em solução salina estéril na concentração de 75 mg/kg. O antibiótico foi administrado intraperitonealmente nos animais CLP e Sham após 6, 24 e 48 horas da cirurgia.
Os animais foram acondicionados em caixas apropriadas para a observação diária da evolução da sepse, durante o período de sete dias (Figura 09). No gráfico, o dia da cirurgia foi considerado o dia zero.
Desenho Experimental:
Figura 09. Sobrevida ao CLP.
3.3. Avaliação da resposta imune inata em animais WT e CCR4-/- depois de 6 horas de submetidos a uma sepse grave e moderada.
Animais WT e CCR4-/- foram submetidos a uma sepse moderada (SL) ou grave (L). Como controles, os animais foram falso operado (Sham). Os animais foram eutanaziados após 6 horas da cirurgia pela administração de uma injeção letal de hidrato de cloral (800 mg/kg via i.p) (Figura 10).
Para avaliarmos a resposta imune local, a cavidade peritoneal foi lavada com 2 mL de PBS gelado e o volume foi recolhido. A partir dos exsudatos coletados foram realizados diversos ensaios como: contagem total e diferencial de leucócitos, a quantificação de citocinas e de CFU.
Para avaliarmos a resposta imune sistêmica, o sangue foi coletado por punção cardíaca com auxílio de seringa contendo anticoagulante (EDTA 5% em
PBS, pH 7,4). A partir de uma amostra do sangue quantificamos citocinas (TNF-α e IL-10) e CFU. Além do sangue, o pulmão foi perfundido pelo coração com 10 mL de salina 0,9% e então, foi guardado no nitrogênio líquido até o processamento da amostra.
Desenho experimental
Figura 10. Avaliação da resposta imune inata.
3.4. Contagem total de leucócitos.
A partir do exsudato recuperado o número total de leucócitos foi contado microscopicamente utilizando hemocitômetro em solução de turk (acido acético 2%, cristal violeta 0,01% em PBS).
3.5. Contagem diferencial de leucócitos.
Uma parte do exsudato foi centrifugada a 450 RPM durante 5 minutos em citocentrífuga (Hettich Universal 16R). As células foram fixadas com metanol por 5 minutos e coradas por hematoxilina-eosina (Bio-Cor). As células foram examinadas em microscópio óptico, sendo contadas 100 células por lâmina, as quais foram diferenciadas em neutrófilos, eosinófilos e células mononucleares. A quantidade de cada tipo celular presente na cavidade foi calculada pela porcentagem dessas células contadas em relação ao valor total obtido. O valor obtido para 1 ml foi
multiplicado pelo volume de tampão utilizado para lavar a cavidade. Os resultados foram expressos como n° de células por cavidade (nº de células/cavidade).
3.6. Quantificação de bactérias no sangue e exsudato peritoneal.
Após 6 horas da cirurgia, o sangue e o lavado peritoneal dos animais WT e CCR4-/- submetidos à sepse grave ou moderada foram coletados como descrito anteriormente. Os exsudatos do peritônio obtidos de animais submetidos à sepse moderada (SL) foram diluídos 100 vezes em PBS e dos animais submetidos à sepse grave (L) foram de 10000 vezes. A partir desta diluição, 10 µL foram semeados em placas de petri contendo meio Ágar Mueller Hinton. Amostras de 10 µL de sangue do grupo SL foram semeadas sem diluições, e no grupo L as amostras foram diluídas 10 e 100 vezes. Todo procedimento foi realizado sob condição estéril. Após as semeaduras, as placas foram incubadas por 18h a 37°C e o número de unidades formadoras de colônias (CFU) foram contadas e calculadas.
3.7. Quantificação de citocinas.
Uma parte do lavado peritoneal coletado 6 horas após a cirurgia foi utilizado para a quantificação de TNF-α, IL-10, e MIP-2. O volume recolhido foi centrifugado e o sobrenadante isento de células foi guardado em freezer à – 20°C até o dia da dosagem. Para obtenção do plasma, o sangue foi coletado com auxílio de seringa contendo anticoagulante por punção cardíaca (EDTA 5% em PBS, pH 7,4). As amostras foram centrifugadas e o plasma foi transferido e guardado junto com o exsudato à – 20°C até o dia da dosagem. A quantificação das citocinas foi realizada através do método imunoenzimático (ELISA) descrito a seguir:
Placas de 96 poços foram cobertas com anticorpo específico (Pharmigen, San Diego, CA,USA) diluídos em PBS e incubados por 18 horas a 4°C. As placas então foram lavadas três vezes com PBS + 0,05% Tween20 (PBS-T20) (Sigma). As ligações não específicas foram bloqueadas com PBS + 1% BSA por 2 horas a temperatura ambiente. Os padrões das citocinas e as amostras foram adicionados as placas e incubadas por 24 horas a 4°C. Então, as placas foram lavadas com PBS-T20 e foram adicionados os anticorpos biotinilados específicos para cada
citocina. Após 1 hora, as placas foram lavadas com PBS-T20, o conjugado avidina-peroxidase foi adicionado em cada poço e incubados por mais 30 minutos. As placas foram lavadas com PBS-T20 e incubadas com o substrato OPD (o-fenilenediamina-dihidrocloreto, Sigma) em tampão citrato pH 5,0. Após 20 minutos, a reação foi interrompida com HCl 6 N e a densidade óptica quantificada em espectrofotômetro a 490nm (Spectra Max-250, Molecular Devices).
3.8. Ensaio da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO).
Os pulmões retirados dos animais foram utilizados para dosagem de mieloperoxidase. O pulmão foi colocado em tampão gelado (NaCl 0,1 M, Na2PO4
0,02 M, EDTA 12 mM pH 4,7) e homogeneizado em pollytron. O homogenato foi em seguida centrifugado a 3000 RPM por 15 minutos a 4°C. Os eritrócitos foram retirados com solução de lise ACK (NH4Cl 0,15 M, KHCO3 1 mM e EDTA 0,1 mM).
As células foram ressuspensas em uma solução de Na2PO4 contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB). As células foram rompidas por congelamento/aquecimento. O lisado foi centrifugado a 10.000g por 15 minutos.
Para reação da mieloperoxidase, 50 µL do sobrenadante do extrato celular foi incubado com TMB (3,3,3,3–tetrametilbenzidina) e com H2O2 por 5 minutos. A reação foi interrompida com H2SO4 2 N. A quantificação de neutrófilos foi feita a partir da curva padrão de neutrófilos (obtidos de animais injetados com carragenina e diluídos de forma seriada ½ na concentração inicial de 2x105 células/ poço). A densidade óptica das amostras seriadas foi quantificada em espectrofotômetro a 450 nm (Spectra Max-250, Molecular Devices).
3.9. Esfregaço sanguíneo e diferencial de medula óssea.
Para avaliarmos a porcentagem de neutrófilos na médula óssea retiramos o conteúdo da medula óssea de um fêmur através da lavagem com PBS gelado. As amostras de medula dos animais normal WT e CCR4-/- foram analisadas pela contagem total e diferencial, respectivamente. No esfregaço sanguíneo, uma gota de sangue foi espalhada numa lâmina de vidro e corada com H&E. Em ambas as
amostras, contamos 100 células, diferenciando-os em neutrófilos ou mononucleares.
No gráfico expressamos apenas a contagem total e diferencial dos neutrófilos presentes por mL de sangue ou por fêmur na medula óssea. Os dados foram expressos em média ± EPM.
3.10. Análise temporal das células Tregs.
Animais WT e CCR4-/- foram eutanaziados 1 ou 5 dias após serem submetidos ao CLP ou Sham operados (Figura 11).
O baço e o linfonodo mesentérico foram coletados separadamente e macerados numa placa de 6 poços (Nunc, Dinamarca) contendo 4 mL de PBS. A suspensão celular foi centrifugada a 400g por 5 minutos. Os eritrócitos foram retirados com solução de lise ACK. O número de células foi determinado por hemocitômetro e ajustado para 106 células/ mL. A suspensão celular foi fixada em paraformaldeído 1% (Sigma) por 15 minutos à 4°C. As células foram lavadas 3 vezes com tampão de fluxo (1% SFB; 0,01% NaN3 em PBS) e guardadas à 4°C no escuro.
O sangue foi coletado por punção cardíaca com auxílio de seringa contendo anticoagulante (EDTA 5% em PBS, pH 7,4) e foi separado para marcação de antígenos celulares por citometria de fluxo.
Desenho Experimental:
Figura 11. Análise temporal das células Tregs.
3.11. Citometria de Fluxo.
A caracterização fenotípica das células foi realizada através da marcação com anticorpos monoclonais conjugado a flouróforos para moléculas presentes na superfície celular e intracelular. Para marcação da superfície, 100 µL de amostra do sangue ou 106 células do baço ou linfonodo mesentério foram incubadas com anti-CD16/CD32 (B&D Pharmingen) para bloqueio do receptor Fc por 15 minutos a 4°C e depois com anti-CD4-PerCP por 30 minutos a 4°C no escuro (B&D Pharmingen). A permeabilização foi feita por 5 minutos com 0,1% de saponina em tampão de fluxo para marcação intracelular com anti-Foxp3-FITC e incubado por 30 minutos a 4°C no escuro. Lavamos três vezes para retirar o excesso de marcadores com tampão de fluxo. As células foram analisadas no FACSCalibur (CellQuestTM software;
Becton and Dickinson, Mountain View, CA) e os dados foram analisados no programa FCS Express 3.00. Foram adquiridos 30.000 eventos, e no “dot plot” do FSH/SSC a população de linfócito foi selecionada e analisada. Os gráficos mostrados em “dot plot” (CD4 e Foxp3) representam uma amostra de cada grupo (n=3-5) e o gráfico de barras a direita expressa à média ± EPM dos valores individuais.
3.12. Cultivo de ASP.
Utilizamos como ferramenta de nossos estudos a cepa 13073 de A. fumigatus (American Type Culture Collection, Manassas, VA), pois esta cepa tem sido usada para induzir IPA em animais imunocomprometidos (STEINHAUSER et al., 1999;
BENJAMIM et al., 2003). O organismo foi cultivado em ágar Sabouraud (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) por 7–10 dias a 37°C. No dia do inóculo, a superfície da placa foi lavada com 50 mL de PBS-Tween80 0.1% (PBS-t) (Vetec). A suspensão de conídios foi filtrada usando gaze estéril para remover agregados celulares e hifas.
Em seguida, centrifugamos a 1000g por 15 minutos. A concentração foi determinada em hemocitômetro.
3.13. Avaliação da imunossupressão pós-sepse.
Animais WT e CCR4-/- submetidos ao CLP ou Sham foram desafiados com conídios de ASP após 4 dias da cirurgia. Após o desafio, os animais foram avaliados para diversos parâmetros, como sobrevida à infecção secundária, migração celular para foco infeccioso e histologia. Nestes experimentos, animais WT e CCR4-/- foram desafiados intratraquealmente (i.t.) com 7,5x107 conídios de ASP em 30µL de salina por animal, e os animais controles receberam apenas salina. Os animais foram acondicionados em caixas apropriadas para a observação diária da sobrevida após a sepse. O dia do desafio com o fungo foi considerado o dia zero e os animais foram observados por mais sete dias. Para avaliar a migração celular após 14 e 48 horas do desafio foi realizado o lavado broncoalveolar nestes animais. Em seguida, o lado direito do pulmão foi congelado para histologia. (Figura 12).
Desenho Experimental:
Figura 12. Imunossupressão pós-sepse.
3.14. Lavado broncoalveolar (BAL).
Após o desafio, os animais foram eutanaziados, a traquéia foi exposta e na cavidade toráxica foi feito um orifício. Expomos a traquéia e inserimos uma agulha de 21G na traquéia por onde injetamos 1 mL de PBS. O lavado broncoalveolar (BAL) foi recuperado e analisado quanto ao número total e diferencial de leucócitos, conforme descrito.
3.15. Histologia.
Após 48 horas do desafio, os animais foram eutanaziados e o ventrículo direito foi perfundido com 10 mL de salina 0,9% gelada para remoção do sangue. O pulmão foi inflado com 100 µL de meio de inclusão OCT (Optimal Cutting Temperature). O pulmão direito foi recolhido e congelado no meio de inclusão direto no nitrogênio líquido por 10 minutos. O material foi cortado na espessura de 5 µm e logo fixado com acetona gelada por 10 minutos, depois foi corado com hematoxilina e eosina.
3.16. Purificação e marcação de células CD4+Foxp3+ no pulmão.
Após 4 dias da cirurgia os animais WT e CCR4-/- foram desafiados com ASP ou salina, e após 3 dias (Figura 13) os animais foram eutanaziados e o ventrículo direito foi perfundido com salina para remoção do sangue. O pulmão foi coletado e digerido com colagenase tipo IV (Sigma) por 1 hora a 37°C. A suspensão celular foi tratada com ACK para retirar eritrócitos. Para purificarmos as células CD4 pulmonares, as células foram ressuspensas na concentração celular de 107/ 90µl de Tampão MACS (BSA 1%, 2 mM de EDTA em PBS) e incubadas com anti-CD4-PE por 15 minutos. Adicionamos anti-PE conjugada a microesferas, incubamos por 10 minutos e lavamos. A seleção positiva para obtenção de linfócitos T CD4+ foi realizada em coluna MS (Myltenic biotec, EUA). A partir destas células CD4, fixamos e marcamos para Foxp3.
Desenho experimental
Figura 13. Isolamento e marcação de células T CD4+Foxp3+ pulmonares.
As células foram analisadas por citometria de fluxo e adquiridos 10.000 eventos. Os gráficos mostrados em “dot plot” (CD4 e Foxp3) representam uma amostra de cada grupo com o seu valor porcentual. O gráfico de barras expressa a média ± EPM.
3.17. Isolamento de células T regulatórias.
Para purificarmos as células T regulatórias, utilizamos o kit de separação de células T regulatórias (Myltenic biotec, EUA). O baço e o linfonodo mesentérico foram coletados dos animais. As células foram ressuspensas na concentração celular de 108/ 400 µl de tampão MACS (BSA 1%, 2 mM de EDTA em PBS) e incubadas com coquetel de anticorpos biotinilados para seleção negativa de CD4+ mais anti-CD25-PE por 15 minutos. Lavamos e incubamos com estreptavidina conjugada a microesferas por 15 minutos. Novamente lavamos e isolamos as CD4+ através de seleção negativa em coluna LD num suporte magnético em que somente as células CD4+ não marcadas fluem pela coluna magnética. As células CD4+ foram
quantificadas e ajustadas numa concentração de 107 células/ 90 µL de tampão MACS. Adicionamos anti-PE conjugado a microesferas, incubamos por 10 minutos e lavamos. A seleção positiva foi realizada em coluna MS permitindo a obtenção de células CD4+CD25+ com pureza de 92-96%.
3.18. Inibição da migração de leucócitos para um foco infeccioso “in vivo” via células T regulatórias.
Animais WT e CCR4-/- foram submetidos ao CLP ou Sham-operados. Após 4 dias, o baço e o linfonodo dos animais de cada grupo foram unidos em uma única amostra e as células T regulatórias CD4+CD25+ foram obtidas de acordo com o kit de separação de células regulatórias. O ASP foi cultivado, isolado e ajustado na concentração de 5x107 conídios/ 30 µL.
Animais WT recipientes foram divididos em 4 diferentes grupos. Em cada grupo, os animais (n = 5-6) receberam intratraquealmente (i.t) salina ou ASP na presença ou ausência de células Tregs obtidas de animais sépticos WT ou CCR4-/-.
Os diferentes grupos estão descritos como mostra na Figura 14.
Desenho Experimental:
Figura 14. Inibição da migração celular pelas células Tregs “in vivo”.
Após 24 horas do desafio, eutanaziamos os animais e o BAL de cada animal foi coletado. O número total e diferencial de leucócitos foi quantificado e os distinguimos em células mononucleares ou neutrófilos. O gráfico foi expresso em média ± EPM dos neutrófilos que migraram para a cavidade.
3.19. Purificação de neutrófilos de medula óssea.
Os fêmures e as tíbias foram retirados de animais WT. Em seguida, o conteúdo da medula óssea foi lavado com PBS gelado. A suspensão celular foi centrifugada em gradientes de 65% e 72% de Percoll (AmerSham Pharmacia) a 1200g por 32 minutos com aceleração e desaceleração lenta, a temperatura ambiente. A banda retirada entre os dois gradientes corresponde aos neutrófilos. A pureza encontrada é de 94 a 96% determinada morfologicamente e por citometria.
3.20. Inibição da migração de neutrófilos “in vitro” via células T regulatórias.
Células Tregs foram purificadas, conforme descrito anteriormente, de animais WT e CCR4-/- submetidos ao CLP ou Sham após 4 dias da cirurgia, e incubadas em RPMI-1640 suplementado (2 mM de L-glutamina e 10% de SFB) por 18 horas a 37°C/ 5% CO2. As células foram usadas no ensaio de migração celular e o sobrenadante destas células foi recolhido e guardado a – 20°C para o ensaio de inibição de produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidas pelos neutrófilos (Figura 15). Os neutrófilos foram purificados no dia do ensaio conforme descrito acima.
As células Tregs e neutrófilos foram pré-incubadas na proporção de 1:39 por 2 horas a 37ºC e 5% CO2. Após a pré-incubação, a migração celular foi realizada em placas de quimiotaxia de 24 poços transwell (Costar, cat# 3421) com poro de 5 µm por 2 horas a 37ºC e 5% CO2. Nos poços inferiores foram adicionados 600 µL de RPMI com 1% de SFB contendo ou não o estímulo para a migração de neutrófilos, 1 nM de LTB4 (Cayman). A suspensão celular foi ressuspensa em um volume de 2x105 células/ 200µL de RPMI + 1% de SFB e adicionada no poço superior. Após a
incubação, as células que migraram foram coletadas nos poços inferiores e contadas no hemocitômetro. A migração celular em direção ao meio sem estímulo foi considerada randômica (controle negativo). O índex quimiotático foi calculado pela divisão de cada valor encontrado no poço inferior pelo número médio de neutrófilos que migraram do controle negativo. O gráfico foi expresso em média destes valores
± EPM.
Desenho Experimental:
Figura 15. Inibição da função de neutrófilos pelas células Tregs “in vitro”.
3.21. Inibição da produção de ROS por neutrófilos estimulados com PMA mediada por Tregs.
Os neutrófilos obtidos de medula óssea foram pré-incubado por 2 horas com o sobrenadante (SN) das células Tregs diluído 20 vezes (1/20) de cada grupo..Após a pré-incubação, as células foram estimuladas com 50 ng/mL de PMA a 37oC por mais 1 hora. As células foram lavadas e incubadas por 10 minutos a 37oC com 2 µM de sonda CMH2D-CFDA (Invitrogen, CA) que se liga a espécies reativas de oxigênio.
As células foram lavadas duas vezes para remover a sonda livre e ressuspendidas em tampão de fluxo. Analisamos a geração de ROS por citometria de fluxo. Os resultados foram expressos pelo valor do MFI encontrado.
3.22. Análise estatística.
Os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente através dos testes Mantel-Cox LogRank para curvas de sobrevivência. Os valores quantitativos foram representados como média e erro padrão da média (EPM) e testados para testes não-paramétricos Mann-Whitney. Foram consideradas diferenças significativas os valores de p< 0,05.