RAPHAEL MOLINARO COELHO
O PAPEL DO CCR4 SOBRE AS CÉLULAS T REGULATÓRIAS NA SEPSE GRAVE
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES
RIO DE JANEIRO FEVEREIRO DE 2009
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RAPHAEL MOLINARO COELHO
O PAPEL DO CCR4 SOBRE AS CÉLULAS T REGULATÓRIAS NA SEPSE GRAVE
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito para obtenção do título de Mestre em ciências (microbiologia).
Orientadores:
Marcelo Torres Bozza Claudia Farias Benjamim
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES
RIO DE JANEIRO FEVEREIRO DE 2009
RAPHAEL MOLINARO COELHO
O PAPEL DO CCR4 SOBRE AS CÉLULAS T REGULATÓRIAS NA SEPSE GRAVE.
Rio de Janeiro, 18 de Fevereiro de 2009.
Aprovado por:
_____________________________________
Prof. Dra. Marcela Lopes - IBCCF- UFRJ _____________________________________
Dr. Hugo Castro Faria – FIOCRUZ
____________________________________
Prof. Dr. Alexandre Morrot- IMPPG-UFRJ _____________________________________
Prof. Dra. Luciana Arruda - IMPPG-UFRJ (REVISORA)
Fevereiro de 2009
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Inflamação e Câncer, Departamento de Farmacologia, Instituto de Cências Biomédicas (ICB), Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da Prof(a) Claudia Farias Benjamim e do Prof. Marcelo Torres Bozza.
Ficha Catalográfica
Molinaro, Raphael Coelho
O papel do CCR4 sobre as células T regulatórias na sepse grave / Raphael Molinaro Coelho - Rio de Janeiro, 2009.
XIV, f.83
Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas)
Universidade Federal do Rio de Janeiro / Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, 2009
Orientador: Marcelo Torres Bozza
Referências bibliográficas: f. 72-80.
1. Quimiocinas 2. CCR4 3. Sepse 4. Imunossupressão 5.
Células Tregulatórias 6. Inflamação I. Bozza, Marcelo II. UFRJ, Instituto de Microbiologia Prof Paulo de Góes, Mestrado em Ciências Biológicas III. O papel do CCR4 sobre as células T regulatórias na sepse grave
“ Passarinho que come pedra, sabe o futuro que tem.”
Vanessa Martins
AGRADECIMENTOS
A Prof.a Claudia Farias Benjamim que além de orientadora e professora, foi uma grande amiga durante esses anos. A sua orientação com determinação e brilhantismo trouxe lucros a todos que você incentivou. E de uma forma muito especial, você pode demonstrar que com garra e muito trabalho nossas idéias ganham gráficos e figuras. A sua eterna dedicação, paciência e atenção foram apenas uma das muitas qualidades que me ajudou a me torna um profissional que luta com alma e entusiasmo. A você, muitíssimo obrigado.
Ao Prof. Marcelo Torres Bozza por ter me ensinado da definição da palavra caráter e sabedoria. Você foi para o meu profissional, um dos grandes incentivos por dar tanta beleza e fé na ciência.
À minha “partner” de bancada, Cyntia Pecli, que desenvolveu grande parte deste trabalho comigo e sempre foi companheira nos MEGA experimentos até as longas tardes da noite com as Treginhas e os revoltadissímos neutrófilos. Gostaria de agradecer a Deus pela sua amizade, e por me ensinar tantas coisas e deixar eu te ensinar apenas algumas. Se eu fosse seu aluno, diria que seria o melhor aprendiz do mundo, mas na verdade eu sou e sempre serei seu amigo. Sentirei muita falta dos nossos risos. Obrigado Cyntia, por ter feito eu dizer: - Valeu!!!
Ao Carlos Alberto que sempre está disposto a ajudar e deixar compartilhar um projeto comigo. A Cristiane Sécca que me ensinou a correr atrás do sucesso e por me fazer rir de tantas loucuras que contamos no laboratório. Ao Leandro Lasdislau que com sua insistência e fé tem demonstrado ao laboratório que tudo é possível. A nova aquisição do lab, a aluna Janaina, por estar participando e apreendendo no lab. E a Vanessa Martins pela sua majestosa alegria e descontração. Além de ter dado o primeiro artigo para o Lab, me ajudou durante todos esses anos. A Ariane mesmo estando longe que me viu crescer cientificamente.
À minha extensão de laboratório que foi com a galera do Marcelo Bozza: Beth, Fabiano, Daniel Feijó, Tatiana, Guilherme, Raquel, Jaci, Marta, Claudia Paiva, Camila, Cristine, Isadora, Iranaia e a Letícia. A essa galera eu devo de tudo, vocês foram meus exemplos de pesquisadores.
A expansão da minha amizade não se limitou apenas ao laboratório do Marcelo Bozza. A Ana Paula, Carla e a Tati pelos papos e risos intermináveis. A Taiane e a Aline que me incentivaram e ajudaram em muitas decisões técnicas. Ao Paulo Emílio pela demonstração de parceria e colaboração, além de tudo um amigo.
Ao Steve Kunkel por ter confiado na nossa capacidade, investido no nosso laboratório e por ser um magnífico exemplo de pesquisador com toda essa espantosa humildade. Você me fez ainda mais apaixonado pela pesquisa devido as nossas conversas no congresso.
Aos professores e doutores da UFRJ, FIOCRUZ, UFF, UERJ, UMICH e do INCA, que ajudaram e confiaram tanto em mim jamais serão esquecidos. Desejo que continuemos com as colaborações cada vez mais fortes. E a todos os professores, alunos e funcionários do Departamento da Farmacologia – UFRJ, inclusive o Prof.
Newton que foi espetacular por deixado às chaves do seu laboratório e sua confiança conosco.
Aos órgãos de fomento CNPq, FAPERJ, pelo suporte financeiro. E a todas as pessoas que me ajudaram a sanar as minhas intermináveis listas de pedidos, sem vocês não teria conseguido.
À minha família, meus pais Antonio Jorge e Maria Helena, a Cássia e o Alessandro, pelo carinho e amor. Por ter especialmente lutado comigo pelos meus sonhos a vida inteira. Amo vocês demais.
LISTA DE ABREVIATURAS
ASP Aspergillus fumigatus BAL Lavado broncoalveolar BSA Albumina de soro bovino cAMP AMP cíclico
CARS Síndrome da resposta compensatória anti-inflamatória CCR4 Receptor de quimiocina CC do tipo 4
CCS Centro de Ciências da Saúde CD “Cluster” de diferenciação CEUA Comissão de uso de animais
CFU Unidade Formadora de Colônia CLP Ligadura e perfuração do ceco
CpG Seqüência de DNA de citosina seguida de guanina CTLA-4 Antígeno 4 dos linfócitos T citotóxicos
DCs Células dendríticas ELISA Ensaio imunoenzimático
EPM Erro padrão médio FACS Citometria de fluxo
FITC Isotiocianato de fluoresceína
Foxp3 Fator de transcrição forkhead-box p3 FSH Detector dispersão frontal
H&E Hematoxilina e Eosina
HLA Antígenos leucocitários humanos i.t. Intratraqueal
IL Interleucina
iNOS Oxído Nítrico Sintase Induzida IPA Aspergilose pulmonar invasiva
IRAK Quinase associada ao receptor IL-1 - M KC Quimiocinas derivada de Queratinocitos
kD Kilodaltons L Sepse Grave
LNM Linfonodo mesentérico LPS Lipopolissacarídeo LTB4 Leucotrieno B4
MCP-1 Proteína quimiotática de macrófago MDC Quimiocina derivada de macrófagos
MFI Intensidade média de fluorescência
MHC II Complexo de histocompatibilidade principal do tipo II MIP Proteína inflamatória produzida por macrófagos MPO Mieloperoxidase
NK Natural “killer”
NO Óxido nítrico
OPD o-fenilenediamina-dihidrocloreto Pam3CysKKKK Lipopeptideo Pam 3 Cys-Ser-(Lys)4
PBS Solução salina de fosfato tamponada PerCP Proteína clorofila peridinina
PMA Acetato de formol miristato PMN polimorfonucleares
ROS Espécies reativas de oxigênio RPM Rotações por minuto
SAL Solução fisiológica de NaCl 0,9%
SFB Soro fetal bovino
SIRS Síndrome da resposta inflamatória sistêmica SL Sepse Moderada
SN Sobrenadante
SSC Detector dispersor lateral
TARC Quimiocinas ativadas e reguladas pelo timo TGF Fator crescimento transformante
Th Célula T auxiliar
TLR Receptores semelhantes a toll TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
Tregs T regulatórias
UTI Unidade de Tratamento Intensivo WT Selvagens
RESUMO
O PAPEL DO CCR4 SOBRE AS CÉLULAS T REGULATÓRIAS NA SEPSE.
Autor: Raphael Molinaro Coelho Orientador: Marcelo Torres Bozza
Resumo da dissertação de mestrado submetida ao Programa de Pós- Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
A sepse é uma resposta inflamatória sistêmica contra uma infecção. Essa resposta é muita intensa, visto que induz a produção de diversos mediadores inflamatórios, a expressão de seus receptores, como também a ativação celular.
Esses receptores e seus mediadores também estão envolvidos em uma das conseqüências da sepse, que é a evolução a um quadro de imunossupressão. Um dos possíveis receptores envolvidos na evolução deste quadro é o CCR4, que tem sido descrito em diversas patologias inflamatórias e está expresso em uma das células capazes de modular negativamente o sistema imune, as células T regulatórias (Tregs). O nosso objetivo foi investigar o papel do receptor CCR4 sobre as células Tregs durante a sepse grave e na imunossupressão. Para isto, animais selvagens (WT) e CCR4 deficientes (CCR4-/-) foram submetidos a uma sepse polimicrobiana experimental através do modelo ligação e perfuração do ceco (CLP).
Os animais CCR4-/- sépticos apresentaram uma melhor sobrevida quando submetidos à sepse grave. A resistência do animal foi acompanhada de uma maior migração de neutrófilos para o peritôneo, redução das bactérias no peritônio e no sangue, menor infiltrado neutrofílico pulmonar e uma menor produção de citocinas inflamatória na fase aguda da sepse. O número de Tregs circulantes e esplênicas parecem influenciar no controle da intensidade da resposta após 1 dia da cirurgia, mas após 5 dias da cirurgia não observamos diferenças das células Tregs nos
órgãos linfóides. Os animais CCR4-/- também foram mais resistentes a uma infecção secundária. E isto pode ser observado pela integridade dos pulmões destes animais.
As Tregs dos animais CCR4-/- não apresentaram a função supressora ativa sobre os neutrófilos “in vivo” e “in vitro”. Além disso, o sobrenadante das Tregs dos CCR4-/- não inibem a produção de ROS pelos neutrófilos. Portanto, os nossos dados sugerem que o CCR4 possui um papel prejudicial na resposta inata contra a infecção ocasionando o desenvolvimento de uma resposta imune exacerbada e assim, evoluindo a um quadro de imunossupressão.
Palavras-chave: 1. Quimiocinas, 2. CCR4, 3. Sepse, 4. Inflamação, 5.
Células T regulatórias, 6. Imunossupressão.
Rio de Janeiro Fevereiro de 2009
ABSTRACT
THE ROLE OF CCR4 ON T REGULATORY CELLS IN SEPSIS.
Author: Raphael Molinaro Coelho Marcelo Torres Bozza
Abstract da dissertação de mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Sepsis is a systemic inflammatory response against infection. Overwhelming inflammatory response induces the production of many mediators, expression of theirs receptors and activation of different cell types. The mediators receptors have a critical role to the development of immunossupression. CCR4 is one of these chemokine receptors, which has been described to be involved in many inflammatory diseases. This receptor is expressed on T regulatory (Tregs) cells and presents a suppressive effect on immune response. Our aim was to investigate the role of CCR4 on Tregs cells during sepsis and immunosupression. Wild Type (WT) and CCR4 knockout (CCR4-/-) mice were subjected to cecal ligation and puncture (CLP) model.
Septic CCR4-/- mice showed higher survival rate to lethal sepsis as compared to septic WT mice. The CCR4-/- resistance was due to a better neutrophils migration to peritoneum, decreased bacterial count, less MPO levels and less inflammatory cytokines on acute sepsis. The number of circulating and splenic Tregs cells were increased in CCR4-/- mice on 1 day after surgery, but did not show differences after 5 days in lymphoid tissue. CCR4-/- mice were also resistant to secondary infection.
Tregs cells from CCR4-/- mice did not present suppressive function on neutrophils “in
vivo” and “in vitro”. Furthermore, the supernatants of Tregs cells from septic CCR4-/- mice did not inhibit ROS production by neutrophils. Our results suggest that CCR4 has a deleterious effect in innate immune response against the infection and contributes to immunosuppression stage.
Keywords: 1. Chemokines, 2. CCR4, 3. Sepsis, 4. Inflammation, 5. T regulatory cells, 6. Immunossupression.
Rio de Janeiro Fevereiro de 2009
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...1
1.1.MEDIADOR INFLAMATÓRIO: QUIMIOCINAS... 1
1.2.SEPSE... 7
1.2.1.MODELO EXPERIMENTAL DE SEPSE... 12
1.3.CÉLULASTREGULATÓRIAS(TREGS) ... 16
2. OBJETIVOS...21
2.1.OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 21
3. METODOLOGIA ...22
3.1.ANIMAIS... 22
3.2.MODELO DE LIGAÇÃO DO CECO E PERFURAÇÃO (CLP)... 22
3.3.AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE INATA EM ANIMAIS WT E CCR4-/- DEPOIS DE 6 HORAS DE SUBMETIDOS A UMA SEPSE GRAVE E MODERADA. ... 23
3.4.CONTAGEM TOTAL DE LEUCÓCITOS. ... 24
3.5.CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS. ... 24
3.6.QUANTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS NO SANGUE E EXSUDATO PERITONEAL... 25
3.7.QUANTIFICAÇÃO DE CITOCINAS... 25
3.8.ENSAIO DA ATIVIDADE DA ENZIMA MIELOPEROXIDASE (MPO)... 26
3.9.ESFREGAÇO SANGUÍNEO E DIFERENCIAL DE MEDULA ÓSSEA. ... 26
3.10.ANÁLISE TEMPORAL DAS CÉLULAS TREGS. ... 27
3.11.CITOMETRIA DE FLUXO. ... 28
3.12.CULTIVO DE ASP... 28
3.13.AVALIAÇÃO DA IMUNOSSUPRESSÃO PÓS-SEPSE... 29
3.14.LAVADO BRONCOALVEOLAR (BAL). ... 30
3.15.HISTOLOGIA. ... 30
3.16.PURIFICAÇÃO E MARCAÇÃO DE CÉLULAS CD4+FOXP3+ NO PULMÃO... 30
3.17.ISOLAMENTO DE CÉLULAS T REGULATÓRIAS... 31
3.18. INIBIÇÃO DA MIGRAÇÃO DE LEUCÓCITOS PARA UM FOCO INFECCIOSO “IN VIVO” VIA CÉLULAS T REGULATÓRIAS... 32
3.19.PURIFICAÇÃO DE NEUTRÓFILOS DE MEDULA ÓSSEA. ... 33
3.20.INIBIÇÃO DA MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS “IN VITRO” VIA CÉLULAS T REGULATÓRIAS... 33
3.21.INIBIÇÃO DA PRODUÇÃO DE ROS POR NEUTRÓFILOS ESTIMULADOS COM PMA MEDIADA POR TREGS.... 34
3.22.ANÁLISE ESTATÍSTICA. ... 35
4. RESULTADOS...36
4.1.SOBREVIDA DE ANIMAIS WT E CCR4-/- AO CLP... 36
4.2.MIGRAÇÃO CELULAR APÓS ESTÍMULO DE SEPSE GRAVE E MODERADA... 37
4.3.AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE BACTÉRIAS NA CAVIDADE PERITONEAL... 39
4.4.QUANTIFICAÇÃO DE CITOCINAS LOCAIS. ... 40
4.5.DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE NO PULMÃO... 42
4.6.QUANTIFICAÇÃO DE CITOCINAS SISTÊMICAS... 43
4.7.AVALIAÇÃO DO LEUCOGRAMA E CELULARIDADE DA MEDULA ÓSSEA. ... 44
4.8.PRESENÇA DAS CÉLULAS TREGS NO SANGUE PERIFÉRICO E ÓRGÃOS LINFÓIDES DURANTE A SEPSE GRAVE. . 45
4.9.SOBREVIDA DOS ANIMAIS WT E CCR4-/- SUBMETIDOS AO CLP OU SHAM OPERADOS DESAFIADOS COM CONÍDIOS DE ASP. ... 47
4.10.AVALIAÇÃO DA MIGRAÇÃO CELULAR PARA O PULMÃO FRENTE A UM ESTÍMULO INFECCIOSO. ... 48
4.11.ANÁLISE HISTOLÓGICA DO PULMÃO DE ANIMAIS WT E CCR4-/- SUBMETIDOS À SEPSE E DESAFIADOS COM ASP... 49
4.12.PRESENÇA DAS CÉLULAS TREGS NO SANGUE PERIFÉRICO E ÓRGÃOS LINFÓIDES 5 DIAS APÓS CLP. ... 51
4.13.PRESENÇA DE CÉLULAS TREGS NO PULMÃO DE ANIMAIS PÓS-SÉPTICOS DESAFIADOS COM ASP OU SALINA. ... 53
4.14.INIBIÇÃO DA MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS PARA O ESPAÇO BRONCOALVEOLAR VIA TREGS OBTIDAS DE ANIMAIS WT E CCR4-/- SUBMETIDOS OU NÃO AO CLP. ... 55
4.15.INIBIÇÃO DA MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS “IN VITRO” VIA TREG OBTIDAS DE ANIMAIS WT E CCR4-/- SUBMETIDOS OU NÃO AO CLP... 57
4.16. INIBIÇÃO DA PRODUÇÃO DE ROS POR NEUTRÓFILOS ESTIMULADOS COM PMA PELO SN DE TREGS OBTIDAS DE ANIMAIS WT E CCR4-/- SUBMETIDOS OU NÃO AO CLP. ... 59
5. DISCUSSÃO ...61
6. CONCLUSÕES ...71
7. BIBLIOGRAFIA ...72
8. ARTIGO I: ...79
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 01. Relação dos receptores de quimiocinas e seus ligantes... 2
FIGURA 02. Relação dos receptores de quimiocinas e doenças relacionadas... 4
FIGURA 03. Relação entre incidência e mortalidade na sepse... 8
FIGURA 04. Processo de migração de neutrófilos do sangue para sítio infeccioso... 9
FIGURA 05. Curva temporal da sepse até a imunossupressão.. ... 11
FIGURA 06. Seqüência de eventos que permitem a imunossupressão observada seguida da sepse... 14
FIGURA 07. Alvos das células Tregs. ... 15
FIGURA 08. Envolvimento das Tregs em diferentes estágios patológicos... 17
FIGURA 09. Sobrevida ao CLP... 22
FIGURA 10. Avaliação da resposta imune inata.... 23
FIGURA 11. Análise temporal das células Tregs. ... 26
FIGURA 12. Imunossupressão pós-sepse. ... 28
FIGURA 13. Isolamento e marcação de CD4+FOXP3+ pulmonar.... 30
FIGURA 14. Inibição da migração celular “in vivo” pelas células tregs. ... 31
FIGURA 15. Inibição da função de neutrófilos “in vitro” pelas células Tregs... 33
FIGURA 16. Sobrevida de animais WT e CCR4-/- submetidos à sepse grave. ... 35
FIGURA 17. Migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal durante a sepse.. 36
FIGURA 18. Quantificação do número de CFU no lavado peritoneal e sangue de animais submetidos a sepse moderada (SL) ou a sepse grave (L). ... 38
FIGURA 19. Quantificação de citocinas presentes no exsudato na sepse... 39
FIGURA 20. Determinação do infiltrado neutrofílico pela atividade da MPO... 40
FIGURA 21. Quantificação de citocinas no plasma de animais sépticos.... 41
FIGURA 22. Leucograma e contagem de neutrófilos na medula óssea... 42
FIGURA 23. População de células Tregs no sangue periférico, baço e linfonodo mesentérico 1 dia após a cirurgia.... 44 FIGURA 24. Curva de sobrevida dos animais WT e CCR4-/- desafiados com 7,5x107 conídios de ASP depois de serem submetidos ao CLP ou Sham ...46
FIGURA 25. Migração de neutrófilos para o BAL após 14 e 48 horas do desafio com asp ou salina depois de serem submetidos ao CLP ou Sham...47
FIGURA 26. Analise histológica do pulmão de animais WT e CCR4-/- desafiados com ASP... 48
FIGURA 27. Presença de células Tregs no sangue periférico, baço e linfonodo mesentérico após 5 dias da cirurgia.... 50 FIGURA 28. Presença de Tregs no pulmão de animais WT e CCR4-/- submetidos ao CLP e desafiados com ASP. ... 52
FIGURA 29. Migração de neutrófilos para o lavado broncoalveolar de animais desafiados com ASP + células Tregs... 54 FIGURA 30. Inibição da migração de neutrófilos “in vitro” via tregs obtidas de animais WT e CCR4-/-... 56
FIGURA 31. Inibição da produção de ROS pelo sobrenadante de cultura de células Tregs.... 57 FIGURA 32. Importância do CCR4 na sepse para a evolução da imunossupressão...68
1. INTRODUÇÃO
Atualmente, sabe-se que o processo inflamatório está envolvido em várias doenças como obesidade, diabetes, neurodegeneração, sepse e câncer, e esse envolvimento em muitas delas era desconhecido até recentemente. Algumas doenças consideradas antes como degenerativas ou próprias do envelhecimento, incluem a inflamação como parte de seu processo fisiopatológico.
O processo inflamatório é uma resposta do organismo a uma injúria. Entende- se como injúria qualquer processo capaz de causar lesão celular ou tecidual. A resposta a lesão é comum em vários tipos de tecidos e é mediada por diversos mediadores inflamatórios produzidos pelas células danificadas e/ou por células residentes ou recrutadas ao sitio inflamatório. Neste sentido, o nosso laboratório vem investigando a participação de mediadores inflamatórios e de células da resposta imune na evolução de doenças inflamatórias, incluindo a sepse.
1.1. Mediador inflamatório: quimiocinas
As quimiocinas são importantes moléculas envolvidas no controle da migração de células, principalmente células do sistema imune, para determinados sítios no organismo. As quimiocinas são secretadas por diversos tipos celulares, geralmente quando estas células são estimuladas por algum estímulo inflamatório, ou secretadas de forma constitutiva. As quimiocinas pertencem à superfamília das citocinas e são pequenas moléculas protéicas de 8 a 15 kD que possuem diversas atividades biológicas. A definição das quimiocinas se deve à sua seqüência de 4 resíduos de cisteína na porção amino-terminal. Elas são subdivididas em quatro subfamílias distintas: CC, CXC, C e CX3C, sendo X um aminoácido qualquer.
Existem duas grandes subfamílias, uma delas é composta por 28 ligantes (CCL1 a CCL28) e a outra contém 16 ligantes (CXCL1 a CXCL16). As outras 2 menores são representadas por uma que contém apenas 2 ligantes (XCL1 e XCL2) e a última que tem apenas o CX3CL1 (Figura 01) (COMERFORD & NIBBS, 2005).
Receptores Ligantes
CCR1 CCL3, CCL5, CCL7, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL23 CCR2 CCL2, CCL7, CCL8, CCL13, CCL16
CCR3 CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL24, CCL26, CCL28 CCR4 CCL17, CCL22
CCR5 CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL11, CCL14, CCL16 CCR6 CCL20
CCR7 CCL19, CCL21 CCR8 CCL1
CCR9 CCL25
CCR10 CCL27, CCL28
CCR11 CCL19,CCL21, CCL25 CXCR1 CXCL6, CXCL7, CXCL8
CXCR2 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8 CXCR3-A CXCL9, CXCL10, CXCL11
CXCR3-B CXCL4, CXCL9, CXCL10, CXCL11 CXCR4 CXCL12
CXCR5 CXCL13 CXCR6 CXCL16 CXCR7 CXCL12
XCR1 XCL1, XCL2 CXXXCR1 CXXXCL1
Figura 01. Relação dos receptores de quimiocinas e seus ligantes.
Adaptado de COMERFORD, 2005.
As quimiocinas se ligam aos receptores de sete alças transmembranares associado às proteínas Gs. Dentro de cada subfamília, particularmente entre as quimiocinas que participam do processo inflamatório, observa-se uma grande promiscuidade, em que um receptor pode ser alvo de ligação de várias quimiocinas ou vice-versa. As quimiocinas atuam através destes receptores de alta afinidade expostos na superfície das células. Atualmente já foram identificados onze receptores diferentes para quimiocinas CC (chamadas de CCR1 a CCR11) e sete para quimiocinas CXC (chamadas CXCR1 a CXCR7)(COMERFORD & NIBBS, 2005).
As quimiocinas também podem ser divididas em dois grupos: constitutivas ou induzidas, dependendo da sua expressão. As quimiocinas constitutivas são expressas primariamente em órgãos linfóides secundários onde terão papel importante para direcionar os leucócitos aos órgãos alvos. As quimiocinas induzidas ou inflamatórias têm um papel muito importante em direcionar as células para o foco inflamatório (MOSER & LOETSCHER, 2001) e estas são expressas em altas concentrações quando são induzidas através de estímulos inflamatórios como, por exemplo, TNF-α, IL-1β e/ou LPS.
As quimiocinas e seus receptores junto com as moléculas de adesão (integrinas e selectinas) atuam sobre diversos tipos celulares direcionando-os seletivamente para seus tecidos alvos (LEY, 2003; ONO et al., 2003). Por exemplo, o recrutamento de células T virgens, células dendríticas maduras e algumas células T de memória para o linfonodo depende dos ligantes CCL9 e CCL21. A interação destas células no órgão linfóide é importante para que ocorra uma resposta imune dependente de células T (KUNKEL & BUTCHER, 2002).
A resposta imune requer uma migração coordenada dos leucócitos da circulação sanguínea e linfática para os tecidos, e dentro destes para sítios determinados seguindo um gradiente de concentração de quimioatraentes. Este processo é regulado por uma extensa rede de quimioatraentes, como quimiocinas, mediadores lipídicos, produtos microbianos e proteínas do sistema complemento.
As quimiocinas e seus receptores não são simples moléculas quimiotáticas.
Com o avanço das pesquisas foram descritos outros papéis além da função quimiotática. As quimiocinas também estão envolvidas no desenvolvimento, regulação e ativação celular. As quimiocinas atuam em inúmeros processos incluindo a angiogênese/angiostase, diferenciação e ativação celular, injúria, crescimento tumoral e metástase, localização e desenvolvimento de tecidos linfóides, na diferenciação e balanço da resposta imune Th1/Th2 e sobre ativação e migração de células T regulatórias (ROSSI & ZLOTNIK, 2000; D'AMBROSIO;
PANINA-BORDIGNON & SINIGAGLIA, 2003; ROSENKILDE & SCHWARTZ, 2004;
YI et al., 2006). Além disso, as quimiocinas participam da interação entre a resposta imune inata e adquirida, sendo esta interação fundamental para uma resposta automática, dinâmica, duradoura e regulada da homeostase do organismo. É
importante considerar a resposta imune inata e adquirida como parte de um processo integrado (BEUTLER & POLTORAK, 2001; MAZZONI & SEGAL, 2004).
Vários trabalhos demonstram que quimiocinas CC são componentes importantes para o recrutamento e ativação de células T, monócitos e eosinófilos, normalmente associadas com a inflamação crônica (KUNKEL & BUTCHER, 2002;
OLSON & LEY, 2002). Com base em estudos clínicos, as quimiocinas CC e seus receptores estão também associados a diversas patologias tornando-as moléculas de grande importância médica para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos de diversas doenças (Figura 02).
Alvo Terapêutico Indicações
CCR1 Esclerose múltipla, artrite reumatóide, câncer, rejeição ao transplante, doença renal
CCR2 Esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabete, obesidade, aterosclerose, câncer, asma
CCR3 Asma, rinite alérgica CCR4 Asma, doença alérgica CCR5 HIV, transplante, câncer CCR6 Asma
CCR7 Câncer
CCR9 Doença intestinal
CXCR1 e CXCR2 Sepse, Aterosclerose, artrite reumatoide, doença pulmonar crônica obstrutiva
CXCR3 Transplante, psoríase, esclerose múltipla, artrite reumatoide, câncer CXCR4 HIV, câncer
CX3CR Aterosclerose
Figura 02. Relação dos receptores de quimiocinas e doenças relacionadas.
Adaptado de COMERFORD, 2005.
Receptores de quimiocinas da subfamília CC, como o CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8 e seus ligantes estão envolvidos tanto na resposta imune
adquirida como na resposta imune inata. Um dos aspectos interessantes é que eles podem modular a expressão de citocinas. Por exemplo, o CCL2 (ligante do receptor CCR2) promove uma resposta inflamatória do tipo Th2 em modelo de granuloma pulmonar induzido por Shistosoma mansoni via aumento da expressão de IL-4, como também inibe a produção de IL-12 por macrófagos no granuloma (CHENSUE et al., 1996). Além de modular citocinas, o CCR2 é capaz de modular o recrutamento de macrófagos e células CD8 frente a uma infecção por Listeria monocytogenes (KURIHARA et al., 1997). Também foi demonstrado que o CCR6 participa no recrutamento de células T de memória para a pele (KLEINEWIETFELD et al., 2005).
Em modelo de peritonite aguda, a neutralização do CCL2 por anticorpos é capaz de diminuir as quantidades de IL-12 e aumentar de IL-10 expressas no pulmão (MATSUKAWA et al., 2000).
Dentre os receptores de quimiocinas o CCR4 é um receptor muito interessante. O CCR4 possui alta afinidade por CCL17 (TARC) e CCL22 (MDC). O RNAm do receptor é expresso no baço e em leucócitos, incluindo células dendríticas, células T, basófilos, monócitos, macrófagos e plaquetas. Os primeiros estudos sobre o receptor CCR4 na resposta imune demonstraram que este receptor era importante no recrutamento de células relacionadas à resposta imune tipo Th2 (CHVATCHKO et al., 2000). Estudos mais recentes demonstram que o CCR4 possui um papel essencial na imunidade inata e adquirida (ISHII et al., 2008). Neste contexto, SCHUH et al. demonstraram que animais deficientes para o CCR4 apresentam uma resposta antifúngica caracterizada pelo aumento da função neutrofílica e aumento do recrutamento de macrófagos no espaço broncoalveolar.
Estes dados demonstram que o CCR4 possui um papel regulatório no recrutamento e/ou ativação das células inflamatórias (SCHUH et al., 2002). Em um modelo experimental de endotoxemia, animais deficientes para CCR4 que foram desafiados com LPS são extremamente resistentes à mortalidade, exibem uma menor produção de citocinas inflamatórias no local e um maior recrutamento de macrófagos peritoneais (CHVATCHKO et al., 2000). Adicionalmente, esses animais deficientes também são mais resistentes à mortalidade induzida por outros ligantes de TLR (Toll-Like receptors) além do LPS (TLR4), como o Pam3Cys (TLR2) e CpG (TLR9).
Essa resistência está associada a um recrutamento mais rápido de leucócitos,
aumento da expressão de TLR, desvio no perfil de citocinas/quimiocinas para o tipo Th1 e uma melhor eliminação da infecção local (NESS et al., 2006). Entretanto, um dado inicialmente contraditório é que a administração do ligante CCL22 possui um papel protetor e a inibição do CCL22 é prejudicial à sepse induzida por CLP (ligação do ceco e perfuração) (ABRAHAM, 2005). Mas como o CCR4 possui mais de um ligante, provavelmente o CCL17 é o mediador responsável pelos efeitos deletérios observados. Em um modelo de sepse polimicrobiana, a ausência do CCR4 possui um papel essencial na resistência a sepse e pode atuar na resposta imune inata através da diferenciação de macrófagos alternativos em animais sépticos via TLR9 (ISHII et al., 2008).
Em outros modelos inflamatórios auto-imunes, como em modelo de lesão cutânea por linfoma, há uma grande expressão do CCL17 pelas células endoteliais nas lesões. Junto com as lesões, observa-se um aumento da expressão de E- selectina e ICAM-1, indicando um microambiente favorável para a migração das células T para o local inflamatório (FIVENSON & NICKOLOFF, 1992; UCCINI et al., 1993).
O aumento da expressão do CCR4 e de seus ligantes está associado a diversas patologias como fibrose pulmonar, inflamação hepática, desenvolvimento de granulomas e diabetes (BELPERIO et al., 2004; FUJIMURA et al., 2004;
JAKUBZICK et al., 2004). Todas essas doenças apresentam infiltração de células T expressando o CCR4.
A partir destes dados, pressupomos que o CCR4 possui um papel importante na imunidade inata e adquirida em processos inflamatórios com a participação de células T. O nosso grupo vem estudando o papel de mediadores envolvidos nas doenças inflamatórias, dentre elas a sepse. Investigar o papel do CCR4 na evolução da sepse até a imunossupressão pós-sepse foi o nosso objetivo, pois a perspectiva de podermos modular a ação das quimiocinas em uma resposta inflamatória intensa, torna-se um dos maiores incentivos para estudos básicos e clínicos nesta área.
1.2. SEPSE
A manifestação clínica da sepse é conseqüência de uma resposta imune intensa do hospedeiro contra um patógeno, que pode se manifestar por hipotensão, coagulopatia e disfunção dos órgãos (BONE, 1994). Durante uma infecção, o organismo responde inicialmente de forma não específica, liberando mediadores inflamatórios na tentativa de eliminar o agente agressor. Caso a resposta inata local não elimine o agente infeccioso, ocorre a proliferação e disseminação do agente patogênico com liberação exacerbada de mediadores inflamatórios locais e sistêmicos, atingindo órgãos distais podendo culminar na falência múltipla de órgãos e então, na morte (COHEN, 2002).
A definição da sepse, de acordo com DELINGER et al. 2008, é uma resposta inflamatória sistêmica à infecção. Assim, quando o paciente séptico apresenta um quadro clínico de hipoperfusão ou hipotensão tecidual e disfunção orgânica (p.e.
acidose lática, oligúria ou confusão mental) determina-se que evoluiu a uma sepse grave. Além disso, o quadro pode evoluir até choque séptico, o qual se caracteriza por um quadro de hipotensão arterial não revertida pela expansão volêmica adequada e administração de vasoconstrictores.
A sepse apresenta altos índices de mortalidade nos hospitais do mundo todo.
No Brasil, o índice de mortalidade de sepse grave em hospitais públicos é significativamente maior do que em hospitais de rede privada. Além disso, observa- se uma alta taxa de mortalidade em hospitais do Brasil (56%) quando comparados a de outros países em desenvolvimento como a Argentina (45%) e em países desenvolvidos (33%) Este trabalho demonstrou que a alta taxa de mortalidade acomete tanto países desenvolvidos como em países em desenvolvimento (TELES et al., 2008).
Nos Estados Unidos o tempo médio de internação dos pacientes sépticos em UTIs é de 20 dias o que acarreta em um alto custo, ultrapassando os US$ 16 bilhões de dólares /ano. Ocorre cerca de 215.000 mortes/ano em pacientes internados por sepse o que corresponde a 9,3% de todas as mortes (O'BRIEN et al., 2007).
No Brasil, um estudo multicêntrico com 2419 pacientes, realizado em 50 hospitais de todas as regiões do Brasil – SEPSE BRASIL – revelou que a incidência
de sepse, sepse grave e choque séptico nos pacientes internados em unidades de terapia intensiva foi de 16,9% e a taxa de mortalidade de 15%, 35,6% e 48%, respectivamente (SILVA et al., 2004). Outro estudo demonstrou uma incidência de 17,4% de pacientes com sepse grave entre os pacientes sépticos de UTI, com uma taxa de mortalidade de 46,9%. Assim como nos Estados Unidos, a taxa de mortalidade no Brasil cresce de acordo com a gravidade da doença. A taxa de incidência dos graus de severidade da sepse é inversamente proporcional à mortalidade (Figura 03) (SILVA et al., 2004).
Mortalidade
Choque Séptico 14,6%
52,2%
46,9%
Sepse grave 17,4%
33,9%
Sepse 30%
Incidência
Figura 03. Relação entre incidência e mortalidade na sepse.
Adaptado de SILVA et al., 2004.
Apesar do crescimento do conhecimento em pesquisa básica, avanço tecnológico e significativo incremento no arsenal terapêutico, não houve um correspondente decréscimo na mortalidade relacionada à sepse. Isso ocorre provavelmente devido à natureza invasiva de diversos procedimentos médicos, do uso indiscriminado de antibióticos e aumento da vida média da população (TELES et al., 2008). O nosso estudo atual possui uma grande relevância para o desenvolvimento de novas terapias a fim de melhorarmos a sobrevida de pacientes.
Vários autores têm demonstrado a importância das células inflamatórias no controle e na resolução das infecções (FERREIRA, 1980; DONG et al., 1993;
BENJAMIM; FERREIRA & CUNHA, 2000). Nesse contexto, FAURSCHOU &
BORREGAARD demonstraram que a depleção de neutrófilos, induzida por quimioterápicos, está fortemente associada às infecções bacterianas e fúngicas de alta letalidade (FAURSCHOU & BORREGAARD, 2003).
Um dos principais processos da resposta imune inata é a migração de neutrófilos para o local de injúria. Os neutrófilos são as primeiras células recrutadas para um sítio infeccioso, em resposta, principalmente a citocinas como IL-1 β, TNF- α, mediadores lipídicos e quimiocinas. A migração é um processo regulado por um amplo espectro de moléculas como citocinas e mediadores lipídicos, liberados pelas células residentes e pelas células recrutadas ao foco infeccioso como mostra na figura 04.
Esses mediadores também estão envolvidos na ativação leucocitária, estimulando a fagocitose e mecanismos efetores da ação microbicida. Animais deficientes de neutrófilos (VERDRENGH & TARKOWSKI, 1997) apresentaram sinais clínicos graves de sepse e alta mortalidade na fase inicial da infecção por Staphylococcus aereus, sugerindo que a fagocitose por neutrófilos é uma etapa crítica para o controle da infecção.
Figura 04. Processo de migração de neutrófilos do sangue para sítio infeccioso. Este processo consiste na captura, rolamento, ativação, adesão, diapedese e quimiotaxia até o foco infeccioso (VON ANDRIAN & MACKAY, 2000).
Embora o número de neutrófilos circulantes possa aumentar durante a sepse, essas células apresentam alterações nas funções de quimiotaxia, fagocitose e na atividade microbicida desencadeadas pela fagocitose, como por exemplo, a liberação de espécie reativa de oxigênio (ROS) (TERRITO & GOLDE, 1976;
FERREIRA, 1980; DONG et al., 1993). Já foi demonstrado que na sepse grave ocorre a falência de migração neutrofílica para o foco infeccioso, aumento no número de bactérias no fluido peritoneal e no sangue, e conseqüentemente uma alta taxa de mortalidade (BENJAMIM, 2000). Embora, os mecanismos envolvidos na inibição da migração de neutrófilos na sepse grave ainda não estejam bem elucidados, evidências sugerem a participação de citocinas pró-inflamatórias neste processo. Sabe-se que essas citocinas estimulam a indução sistêmica da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) e produção de óxido nítrico, o qual participa na inibição da migração de neutrófilos. Animais deficientes para iNOS submetidos a
sepse grave não apresentaram inibição da migração de neutrófilos. Entretanto, esses animais deficientes apresentaram alta mortalidade, o que sugere que o óxido nítrico (NO) participa na falência de neutrófilos e na atividade microbicida dessas células (BENJAMIM et al., 2002).
Os eventos fisiopatológicos na sepse podem ser subdivididos em uma fase inicial e uma fase tardia. A fase inicial é caracterizada pela grande liberação de mediadores pró-inflamatórios, incluindo TNF-α, IL-1β, IL-6 e quimiocinas, sendo conhecida como Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica [do inglês “Systemic Inflammatory Response Syndrome”; SIRS]. A resposta pró-inflamatória é compensada pela liberação de mediadores antiinflamatórios, como a IL-10 e TGF-β.
Esta fase tardia foi denominada de Síndrome da Resposta Anti-inflamatória Compensatória [do inglês “Compensatory Anti-inflammatory Response Syndrome”;
CARS] (Figura 05) (DINARELLO & ABRAHAM, 2002).
Figura 05. Curva temporal da sepse até a imunossupressão.
Adaptado de BONE, 1994.
Este desequilíbrio de mediadores pró-inflamatórios com mediadores regulatórios resulta em uma “tempestade” de citocinas. Essa liberação excessiva dos mediadores antiinflamatórios e as alterações no processo reparativo são alguns dos fatores responsáveis pelo desenvolvimento do quadro de imunossupressão, pois ocorrem diversas alterações funcionais duradouras no sistema imune. Diversos mecanismos celulares e moleculares já foram descritos para explicar a
IMUNOSSUPRESSÃO
Resposta Anti-inflamatória
Resposta Pró-inflamatória
Recuperação
imunossupressão pós-sepse. Entre eles estão o aumento de células T regulatórias, a diminuição da produção de citocinas pró-inflamatórias, o aumento da expressão de moléculas inibitórias intracelulares da sinalização da via de TLR (como por exemplo a IRAK-M), a redução da expressão de HLA-DR, o grande número de células apoptóticas, além de fatores epigenéticos (WANG & DENG, 2008). Essas alterações podem prejudicar a resposta imune por desativação ou por falta de células capazes de disparar uma resposta Th1 eficiente. Em conseqüência, o paciente séptico pode apresentar incapacidade de erradicar a infecção primária causadora da sepse, e, além disso, ficar mais propenso a adquirir infecções nosocomiais secundárias (WANG & DENG, 2008).
A imunossupressão seguida de uma inflamação aguda grave não é exclusiva da sepse, também é observada em outras doenças, incluindo a isquemia e reperfusão por órgão transplantado (NAGANO & TILNEY, 1997), alterações na recuperação de infecções por vírus sincicial respiratório (OPENSHAW; DEAN &
CULLEY, 2003), após queimaduras e traumas intensos (RODGERS et al., 2000;
KOBAYASHI et al., 2002) e pancreatites (NAGANO & TILNEY, 1997; RODGERS et al., 2000; OPENSHAW; DEAN & CULLEY, 2003).
Dados na literatura demonstram que pacientes que se recuperam de um quadro séptico grave apresentam alto índice de mortalidade no período de um ano.
Nestes trabalhos, 80% dos pacientes acometidos de sepse grave que obtiveram alta, faleceram em um período de 8 anos por causas não sépticas, mas devido a doenças como câncer, problemas cardiovasculares e pulmonares. Foi observado que a vida-média do paciente séptico correlaciona-se com a severidade da sepse (PERL et al., 1995; QUARTIN et al., 1997).
1.2.1. Modelo experimental de sepse
Embora existam muitas controvérsias no campo da sepse, é bastante uniforme o pensamento de que essa síndrome é extremamente complexa devido ao envolvimento de muitos sistemas, tecidos, tipos celulares e mediadores inflamatórios. Muitos modelos animais têm sido usados para estudar a fisiopatologia da sepse (OSUCHOWSKI et al., 2006), com o objetivo de recapitular as alterações
observadas na sepse humana. Utilizando um modelo murino experimental de sepse, a ligação e perfuração do ceco (CLP) (BAKER et al., 1983), neste modelo o ceco dos animais são expostos para fora da cavidade peritoneal e na porção distal do ceco é realizado uma ligadura no ceco a fim de formar uma bolsa com conteúdo fecal. A intensidade do estímulo irá depender do número de perfurações e do calibre da agulha utilizada no ceco. Um alto número de furos e um grande calibre da agulha irão desencadear uma grande quantidade de conteúdo fecal na cavidade peritoneal induzindo a uma intensa resposta inflamatória, e consequentemente, uma alta mortalidade (BENJAMIM, 2000). Este modelo experimental é o que mais mimetiza, tanto qualitativamente como quantitativamente, observações clínicas de peritonite polimicrobiana (FINK & HEARD, 1990). Semelhante ao que se observa na clínica, a morte do animal no modelo de CLP é causada pelos efeitos diretos das bactérias e por uma intensa resposta pró-inflamatória sistêmica contra os patógenos seguida de um quadro anti-inflamatório (BONE, 1994).
A partir deste modelo, o nosso grupo vem estudando como as alterações celulares e moleculares ocorridas na sepse podem alterar a interação da resposta imune inata e adquirida e como conseqüência, desenvolver uma imunossupressão.
Nesse contexto, durante o processo infeccioso, as citocinas e outros mediadores poderão induzir respostas imunes efetoras de proteção ou de lesão ao hospedeiro, que dependerão principalmente do padrão de citocinas liberadas, bem como sua concentração no sítio infeccioso e na circulação. Embora o papel de diversos mediadores e células estejam bem descritos, na sepse, não existe atualmente um tratamento eficaz, pois não está esclarecido como todos esses mediadores agem e quais os papeis que cada um deles desempenha (RIEDEMANN; GUO & WARD).
Uma das conseqüências da imunossupressão pós-sepse é que o organismo se torna mais suscetível a infecções secundárias. Recentemente foi demonstrado que 28,3% dos pacientes sépticos na população chinesa desenvolvem aspergilose pulmonar invasiva (IPA). O pulmão é o principal órgão afetado e o Aspergillus sp. é o segundo principal causador da infecção (XIE et al., 2008). Além do Aspergillus, outros patógenos são importantes causas de infecção. Assim como observado em animais, pacientes sépticos são mais suscetíveis a infecções nosocomiais no
pulmão, principalmente pela Pseudomonas aeruginosa (RICHARDSON et al., 1982;
MUSTARD et al., 1991).
O Aspergillus fumigatus (ASP) é um fungo que está comumente presente no ar e se reproduz através da propagação de conídios que são liberados no ambiente.
Esses conídios possuem uma superfície hidrofóbica o que lhes permite sobreviver no ar por um tempo prolongado. Para a maioria dos indivíduos, a inalação de conídios é inócua. No trato respiratório, o hospedeiro é protegido pela imunidade inata através da geração de um processo inflamatório capaz de eliminar esses conídios. O ASP é um fungo oportunista que acomete as vias aéreas e que tornou- se uma importante causa de morte em casos de infecções pulmonares. Nas três últimas décadas, a incidência da mortalidade por sepse causada por fungos cresceu mais de 200% em pacientes imunocomprometidos (MARTIN et al., 2003), sendo os principais agentes a Candida albicans e o Aspergillus fumigatus. Em indivíduos imunossuprimidos eles podem se desenvolver em hifas e invadir o tecido, causando pneumonia grave e progressiva que pode se disseminar a outros órgãos (MEHRAD;
STRIETER & STANDIFORD, 1999). O diagnóstico é difícil e quando realizado tardiamente, o tratamento não é eficaz, consequentemente, a mortalidade pode chegar até 50% (MEERSSEMAN et al., 2007).
A primeira linha de defesa no pulmão contra o ASP é composta por macrófagos alveolares e neutrófilos. Animais depletados destas células inflamatórias são mais suscetíveis a infecções por fungo, pois não apresentam uma eliminação do patógeno de forma eficaz (MEHRAD; MOORE & STANDIFORD, 2000). Os conídios que chegam às vias aéreas são fagocitados e mortos por essas células através de uma via fagocítica oxidase-dependente. Já foi demonstrado que animais tratados com anti-CCL2, ou animais depletados de neutrófilos com o bloqueio de TNF-α, ou animais deficientes de TLR2 são mais suscetíveis a desenvolverem IPA por não eliminarem a infecção (MORRISON et al., 2003; BALLOY et al., 2005; BENJAMIM et al., 2005).
BENJAMIM et al., utilizando o modelo do CLP, demonstraram que após a instilação intrapulmonar de células dendríticas obtidas da medula óssea de camundongos falso-operados houve proteção dos camundongos pós-sépticos desafiados a uma infecção secundária por A. fumigatus. Portanto, o
restabelecimento da função das células dendríticas pode ser uma estratégia interessante para reverter a imunossupressão induzida pela sepse (BENJAMIM, 2005). Além das células dendríticas, a sepse induz alteração de função dos monócitos/macrófagos, linfócitos e neutrófilos (Figura 06).
Figura 06. Seqüência de eventos que induzem a imunossupressão observada após a sepse. A evolução de uma peritonite aguda afeta desde a resposta imune inata inicial do hospedeiro contra os patógenos localmente, como sistemicamente, incluindo os órgãos distais do foco infeccioso, p.e. o pulmão. Dentro do pulmão, o perfil de diversas moléculas como os TLRs, citocinas e quimiocinas estão alteradas, importantes no desenvolvimento de um quadro de imunossupressão (BENJAMIM;
HOGABOAM & KUNKEL, 2004).
Visto que vários estudos demonstram que a sepse induz alteração de função em diversas células como células dendríticas, monócitos/macrófagos e neutrófilos, o nosso grupo foi investigar o papel dos linfócitos na evolução da sepse até a imunossupressão. Além da célula Th2, existe um subtipo de linfócito T, que são capazes de modular a intensidade de uma resposta inflamatória. Essas células são chamadas de T regulatórias (Tregs).
1.3. CÉLULAS T REGULATÓRIAS (Tregs)
Em uma resposta imune existe uma população de linfócitos T CD4+CD25+ que pode agir como células efetoras ou supressoras da resposta imune apresentando um perfil de citocinas com características distintas das células Th1 ou Th2. Estas células Tregs expressam na superfície o CD4 e o CD25, e exclusivamente o fator de transcrição Foxp3 no citoplasma, sendo este considerado atualmente o melhor marcador para células Tregs naturais. As células Tregs são produzidas desde o terceiro dia de vida dos camundongos no timo, estão presentes em 5-10% dos CD4 periféricos e podem inibir a ativação de diversas células efetoras. As Tregs são capazes de inibir desde uma resposta imune inata, como por exemplo a migração de neutrófilos até uma resposta imune adaptativa através da inibição da proliferação de células T (Figura 07).
Tregs
Figura 07. Alvos das células Tregs.
(Fonte: Laboratório de Inflamação e Câncer – UFRJ; 2008)
O mecanismo de supressão das células Tregs ocorre por diversas vias, incluindo a secreção local de citocinas como IL-10 e TGF-β, a competição pela IL-2 impedindo a proliferação de célula T efetora, ou por contato célula – célula, através da ligação de moléculas de superfície das células regulatórias e efetoras, como o CTLA-4 e CD80/CD86, respectivamente (VON BOEHMER, 2005). Recentemente foram descritos novos mecanismos de supressão pelas células Tregs, por exemplo, através da liberação de adenosina e o cAMP (DEAGLIO et al., 2007). As células Tregs podem agir de forma sistêmica ou local. A sua presença em tecidos especializados como fígado e olhos é capaz de controlar imunopatologias e proteger estes órgãos (SUVAS et al., 2004).
Durante uma infecção aguda, as células Tregs naturais devem contribuir no controle da resposta inflamatória. Conforme o processo inflamatório evolui e torna-se crônico, com a participação das células Th1 e/ou Th2, outros processos regulatórios participam modulando a resposta. No inicio da infecção, as células Tregs naturais evitam um excessivo dano tecidual. Conforme a infecção evolui a um processo crônico, independente da intensidade do processo inflamatório, são formadas novas células Tregs Foxp3+ convertidas que junto com as células Tregs antígenos- específicos acumulam-se no sítio de infecção (Figura 08)(BELKAID, 2007). As células Tregs no local recrutam e formam mais células supressoras com um papel regulatório importante no desenvolvimento do processo crônico. E esse acúmulo de células também pode permanecer após a instalação da fase crônica da infecção.
Figura 08. Envolvimento das Tregs em diferentes estágios patológicos.
(BELKAID, 2007).
Trabalhos recentes têm demonstrado que essas células proliferam frente a antígenos próprios como também a antígenos expressos por micróbios, como por exemplo, Leishmania major, Helicobacter hepaticus, Listeria monocytogenesis e Candida albicans (WALKER, 2004). Durante a infecção de camundongos com Candida albicans, reduções de células Tregs naturais causam um melhor controle da infecção, mas em contrapartida também causam aumento de uma inflamação gastrointestinal (MONTAGNOLI et al., 2002).
Em 2004, um estudo demonstrou que após 28 dias do quadro infeccioso, pacientes sépticos que não sobreviveram apresentavam maior porcentagem de células Tregs no sangue do que os pacientes sépticos sobreviventes, além de apresentarem menor expressão de HLA-DR. No ano seguinte, o mesmo grupo demonstrou que esse aumento pode ser explicado devido às células Tregs CD4+CD25+ serem mais resistentes a apoptose durante o choque séptico comparado as CD4+CD25- (MONNERET et al., 2003; VENET et al., 2004). Em um modelo murino de CLP foi observado um aumento de células CD4+CD25+ esplênicas quando comparados aos animais Sham-operados. Observou-se também que as
células Tregs esplênicas de animais sépticos possuem maior capacidade supressora e apresentam maior expressão de IL-10 intracelular após serem estimuladas, indicando que, além das células Tregs naturais, as células Tregs induzidas também participam na sepse. O autor ainda demonstrou que o tratamento de animais sépticos com anti-CD25 e anti-IL-10 não melhorou a sobrevida dos animais sépticos (SCUMPIA et al., 2006). A transferência adotiva de células Tregs CD4+CD25+ estimuladas in vitro com anti-CD3 e anti-CD28 para animais submetidos ao CLP melhorou a sobrevida e diminuiu a quantidade de unidades formadoras de colônia (CFU) presente no sítio de infecção (HEUER et al., 2005).
Algumas quimiocinas estimulam a migração de ambas às células CD4+CD25+ e CD4+CD25-. As CD25+ expressam especificamente CCR4 e CCR8 (IELLEM et al., 2001) e migram em resposta aos seus ligantes CCL17 e CCL1, respectivamente (COLANTONIO et al., 2002). Em um estudo clínico observou-se que os 104 indivíduos com carcinoma de ovário apresentavam células Tregs preferencialmente se movendo e acumulando nos tumores e ascites, mas raramente entrando nos linfonodos drenantes e que esse recrutamento era mediado pela produção de CCL22 pelas células tumorais e macrófagos residentes naquele microambiente (CURIEL et al., 2004). Estudos realizados em camundongos mostram que ligantes do CCR5 atraem preferencialmente as células Tregs CD25+, que de fato expressam este receptor na superfície (BYSTRY et al., 2001). A falta do CCR5 preveniu fracamente a letalidade por doenças de enxerto vs. hospedeiro (WYSOCKI et al., 2005). Em modelo de infecção com Paracoccidioides brasiliensis, o CCR5 foi importante para a migração das Tregs para o sítio de infecção. No local, essas Tregs diminuem a resposta imune ao fungo favorecendo a formação tardia do granuloma (CAVASSANI et al., 2006). Assim como o CCR5, o CCR7 é importante para as células Tregs migrarem para os linfonodos. Estas células suprimem uma resposta de células T no local e assim, evitam o desenvolvimento de uma doença inflamatória intestinal (SCHNEIDER et al., 2007). Já o receptor CXCR4 é importante para reter células Tregs na medula óssea (ZOU et al., 2004).
As células Tregs também são importantes na tolerância. O recrutamento das células Tregs Foxp3+ para o enxerto de transplante cardíaco tratado com CD154 (CD40L) é dependente de CCR4. A presença das células Tregs no órgão
transplantado induz a tolerância (LEE et al., 2005). Bloquear o CCR4 e o CCR6 bloqueia parcialmente a migração das células T virgem e Tregs, entretanto o bloqueio do CCL2, CCL5 e CXCR3 inibe a migração das células CD4+CD25- sem inibir a migração das células Tregs. Esse dado sugere que as Tregs possuem um perfil de receptores diferente das outras células, embora apresentem também receptores em comum com outras células que direcionam a migração para sítios inflamatórios (CHEN & BROMBERG, 2006). O CCR4 está expresso em 75% das células Tregs periféricas em humanos, estas células já parecem estar capazes para suprimir a proliferação de células CD8. Quando as células T CCR4+ foram depletadas observou-se uma maior polarização Th1 de linfócitos T CD4 virgens e um aumento na função das células CD8 contra antígenos tumorais (BAATAR et al., 2007). Esses dados suportam a idéia de que as quimiocinas participam na função e na migração das células Tregs.
As Tregs são fortes candidatas a desempenharem um papel decisivo na imunossupressão seguida da sepse grave, visto que essas células possuem um papel modulador na resposta inflamatória e essa alteração pode afetar a infecção e o dano tecidual. Os mecanismos envolvidos na imunossupressão ainda estão pouco esclarecidos, entretanto, dados obtidos em nosso laboratório sugerem que o CCR4 tem um papel importante sobre a disposição e função das células Tregs no organismo durante a sepse e a imunossupressão.
2. OBJETIVOS
O objetivo do nosso estudo é caracterizar o papel do CCR4 sobre as células Tregs em diferentes fases da sepse, inclusive na imunossupressão pós-sepse. A partir deste objetivo, nos propomos a investigar se os animais CCR4-/- são mais resistentes à sepse e como as células Tregs poderiam participar desta resistência.
2.1. Objetivos Específicos
1 – Caracterizar a resposta inflamatória local e sistêmica dos animais WT e CCR4-/- na sepse grave ou moderada através da migração celular, quantificação de citocinas e mieloperoxidase no tecido pulmonar.
2 – Caracterizar o papel do CCR4 na localização das células T regulatórias no pulmão e nos principais tecidos linfóides de diferentes fases da sepse grave.
3. Avaliar a sobrevida dos animais C57BL/6 (WT) e os CCR4-/- após o CLP e após o desafio com ASP.
4. Analisar a migração celular e a integridade pulmonar após o desafio com ASP em animais WT e CCR4-/- após a sepse.
5. Analisar a capacidade supressora das células T regulatórias obtidas de animais WT e CCR4-/- sépticos sobre a migração de células inflamatórias “in vivo” e
“in vitro”, e na inibição da produção de ROS pelos neutrófilos.
3. METODOLOGIA
3.1. Animais.
Camundongos selvagens C57BL/6 (WT), pesando entre 20-24g, de ambos os sexos, foram gentilmente doados pelo biotério da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) e comprados do biotério central da Universidade Federal Fluminense (UFF). Os animais foram mantidos sob condições controladas com ciclo de claro/escuro e acesso livre a ração e água. Os camundongos deficientes homozigotos para o receptor CCR4 (CCR4-/-) com fundo genético dos WT, também foram mantidos nas mesmas condições no biotério da FIOCRUZ.
Os procedimentos com os animais de experimentação foram realizados de acordo com as diretrizes da Comissão de Uso de Animais (CEUA) do centro de ciências da saúde (CCS) da UFRJ, conforme o protocolo n° DFBCICB 028.
3.2. Modelo de ligação do ceco e perfuração (CLP).
Para avaliar a sepse grave e a imunossupressão, animais WT e CCR4-/- foram previamente anestesiados intraperitonealmente com cetamina 112,5 mg/kg e xilazina 10 mg/kg. Após estarem anestesiados, a cavidade abdominal foi aberta com uma incisão de 1,5 cm, o ceco foi identificado, exposto para fora da cavidade e ligado com linha de algodão (4-0), de forma a não obstruir a passagem entre íleo e ceco. Em seguida, o ceco foi perfurado nove ou três vezes com uma agulha de 21G para induzir a sepse grave (grupo CLP ou em alguns experimentos foi designado como grupo L) ou uma sepse moderada (grupo SL), respectivamente. O ceco foi recolocado na cavidade abdominal que foi fechada com auxílio de grampo cirúrgico 9 mm. Após o procedimento cirúrgico, os animais receberam a administração subcutânea de solução salina (1,0 mL), para reposição volêmica. Os animais controles ou falso operados (grupo Sham) foram abertos e o ceco exposto, mas não foi ligado e perfurado (BAKER et al., 1983).
Os animais submetidos ao CLP ou Sham receberam tratamento com antibióticos (Ertapenem, Merck) que foi preparado no dia do uso em solução salina estéril na concentração de 75 mg/kg. O antibiótico foi administrado intraperitonealmente nos animais CLP e Sham após 6, 24 e 48 horas da cirurgia.
Os animais foram acondicionados em caixas apropriadas para a observação diária da evolução da sepse, durante o período de sete dias (Figura 09). No gráfico, o dia da cirurgia foi considerado o dia zero.
Desenho Experimental:
Figura 09. Sobrevida ao CLP.
3.3. Avaliação da resposta imune inata em animais WT e CCR4-/- depois de 6 horas de submetidos a uma sepse grave e moderada.
Animais WT e CCR4-/- foram submetidos a uma sepse moderada (SL) ou grave (L). Como controles, os animais foram falso operado (Sham). Os animais foram eutanaziados após 6 horas da cirurgia pela administração de uma injeção letal de hidrato de cloral (800 mg/kg via i.p) (Figura 10).
Para avaliarmos a resposta imune local, a cavidade peritoneal foi lavada com 2 mL de PBS gelado e o volume foi recolhido. A partir dos exsudatos coletados foram realizados diversos ensaios como: contagem total e diferencial de leucócitos, a quantificação de citocinas e de CFU.
Para avaliarmos a resposta imune sistêmica, o sangue foi coletado por punção cardíaca com auxílio de seringa contendo anticoagulante (EDTA 5% em
