0 1 2 3 4 5 6 7 0
20 40 60 80
100
*
Dias após a cirurgia
% Sobrevida
CCR4 -/- CLP (n=7) WT CLP (n=11) CCR4 -/- Sham (n=9) WT Sham (n=12)
Figura 16. Sobrevida de animais WT e CCR4-/- submetidos à sepse grave.
Animais WT e CCR4-/- foram submetidos ao CLP ou Sham operados e receberam antibioticoterapia com Ertapenen (75 mg/kg) 6, 24 e 48 horas depois da cirurgia. O dia da cirurgia foi considerado como dia zero. A sobrevida dos animais foi observada por 7 dias. O gráfico é representativo de 4 experimentos. *p<0,05 comparado ao grupo CLP do WT.
4.2. Migração celular após estímulo de sepse grave e moderada.
Uma resposta imune eficaz tem um papel essencial na contenção de uma infecção, e consequentemente na sobrevivência do indivíduo. Visto que os animais CCR4-/- são mais resistentes a sepse grave, fomos investigar a resposta local e sistêmica destes animais através de diversos parâmetros.
Para avaliarmos a migração de neutrófilos para o foco infeccioso após 6 horas da cirurgia, analisamos a celularidade presente na cavidade peritoneal de animais CCR4-/- e WT submetidos a diferentes intensidades da sepse a modo que podermos observar a falência de neutrófilos. Os grupos submetidos à sepse grave (L), moderada (SL) ou Sham foram quantificados através da contagem total e diferencial de leucócitos por microscopia óptica.
Os grupos SL dos animais WT e CCR4-/- apresentaram uma migração de neutrófilos aumentada para a cavidade peritoneal quando comparados aos grupos
Sham de ambas as linhagens. Corroborando com dados já publicados de nosso grupo, o grupo L dos animais WT apresentaram falência na migração de neutrófilos para a cavidade, quando comparado ao grupo SL dos animais WT. Entretanto, a migração de neutrófilos para a cavidade no grupo L dos animais CCR4-/- foi surpreendentemente elevada quando comparamos aos grupos L dos animais WT (Figura 17). Em todos os grupos não observamos diferenças na quantidade de células mononucleares entre os animais WT e CCR4-/- (dados não mostrados).
Estes resultados sugerem que os animais CCR4-/- submetidos ao modelo de sepse grave não sofrem falência na migração de neutrófilos. O aumento de neutrófilos na cavidade deve participar como um fator favorável na sobrevida destes animais durante a sepse.
Sham SL L Sham SL L
0 2 4 6 8 10 12 14 16
*
* #
WT CCR4
-/-**
( x1 0
6n e u tr ó fi lo s / ca vi d a d e )
Figura 17. Migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal durante a sepse.
Animais WT e CCR4-/- foram eutanaziados 6 horas depois de submetidos à sepse grave (L= 9 furos, n=5), sepse moderada (SL= 3 furos, n= 5) e falsos operados (Sham, n=3). A cavidade peritoneal foi lavada e do volume recuperado foram realizadas a contagem dos neutrófilos presentes. Os resultados foram expressos como média ± EPM. O gráfico é representativo de 2 experimentos. * p<0,05 comparados ao grupo Sham. ** p<0,05 comparado ao grupo SL do WT. # p<0,05 comparado ao grupo L do WT.
4.3. Avaliação do número de bactérias na cavidade peritoneal.
Com o intuito de caracterizar a resposta imune a infecção bacteriana nos animais CCR4-/-, avaliamos a carga bacteriana na cavidade peritoneal e no sangue de animais WT e CCR4-/- submetidos a sepse grave ou moderada. A quantificação foi realizada através de amostras do exsudato e do sangue obtidos 6 horas após a cirurgia. O grupo Sham foi excluído das analises por não apresentar nenhuma CFU detectável no lavado peritoneal e nem no sangue (dados não mostrados). No lavado peritoneal (Figura 18A) e no sangue (Figura 18B) do grupo L dos animais CCR4-/- observamos redução do número de CFU quando comparado ao grupo L dos animais WT. Quando induzimos um estímulo moderado (grupo SL) não observamos diferenças entre as linhagens quanto ao número de bactérias presentes em ambos locais. Estes resultados indicam que os animais CCR4-/- apresentam uma menor carga bacteriana no peritônio e no sangue, sugerindo uma resposta imune mais eficiente destes animais na sepse grave.
SL L SL L 0
20 40 60 80
WT CCR4
-/-*
**
x 1 0
7C F U / c a v id a d e
SL L SL L
0 50 100 150 200
x 1 0
5C F U /m L d e s a n g u e
**
WT CCR4
-/-*
Figura 18. Quantificação do número de CFU no lavado peritoneal e sangue de animais submetidos a sepse moderada (SL) ou a sepse grave (L).
(A) Os lavados peritoneais dos animais WT e CCR4-/- do grupo L (n=6) e do SL (n=6) foram coletados após 6 horas da cirurgia e diluídos 100, 1000 e 10000 vezes.
(B) O sangue dos animais foi coletado por punção cardíaca e foi diluído 10 e 100 vezes. As diluições do lavado peritoneal e do sangue foram semeadas diretamente em Ágar Mueller Hinton e incubadas por 24 horas a 37°C. As unidades formadoras de colônias (CFU) foram contadas e os resultados foram expressos em valores individuais e a mediana. * p<0,05 comparados ao grupo SL. ** p<0,05 comparado ao grupo L do WT.
4.4. Quantificação de citocinas locais.
A partir do exsudato peritoneal recolhido após 6 horas da cirurgia de animais WT e CCR4-/- submetidos ao Sham, SL ou L, algumas citocinas e quimiocinas que são importantes no recrutamento e ativação de células inflamatórias, como o TNF-α, IL-10 e o MIP-2, foram quantificadas. No exsudato de animais CCR4-/- do grupo L
A B
observamos quantidades reduzidas do TNF-α (Figura 19A) e de MIP-2 (Figura 19B) em relação ao grupo L do WT. O mesmo pôde ser observado nos grupos SL entre o CCR4-/- e o WT em ambas citocinas. Mesmo não apresentando diferenças estatísticas significativas entre os animais, a concentração destas citocinas parece estar menor no peritônio dos animais CCR4-/-. No grupo Sham dos WT observamos quantidades extremamente baixas de TNF-α enquanto no grupo Sham dos animais CCR4-/- apresentaram quantidades basais elevadas e similares ao grupo SL. E quanto ao MIP-2, os grupos Sham de ambas as linhagens não foram quantificados.
Assim como o TNF-α e o MIP-2, animais CCR4-/- submetidos ao SL apresentaram quantidades reduzidas da citocina IL-10 comparados aos animais WT.
Surpreendentemente, os animais CCR4-/- do grupo L apresentaram altas concentrações de IL-10 no peritônio, quando comparados aos animais WT (Figura 19C). Os nossos dados sugerem que os animais CCR4-/- desenvolvem uma resposta inflamatória local mais branda e controlada do que os animais WT.
Sham SL L Sham SL L
0 20 40 60 80 100 120
W T
CCR4-/-TNF-α (pg/mL)
ShamSL L ShamSL L
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
W T
CCR4-/-*
IL-10 (pg/mL)
SL L SL L
0 400 800 1200 1600 2000
W T
CCR4-/-MIP-2 (pg/mL)
A B C
Figura 19. Quantificação de citocinas presentes no exsudato na sepse.
Animais WT e CCR4-/- foram eutanaziados 6 horas após serem submetidos ao CLP, L (n=4-6), SL (n=4-6) ou falsos operados (Sham, n=4). A cavidade foi lavada e as amostras do exsudato obtido foram quantificadas por ELISA para as citocinas (A) TNF-α, (B) MIP-2 e (C) IL-10. Os dados são representativos de 2 experimentos e expressos como média ± EPM. * p<0,05 comparado ao grupo L do WT.
4.5. Determinação da atividade da mieloperoxidase no pulmão.
Para caracterizar se a inflamação evoluiu para um quadro sistêmico, decorrente da infecção induzida pelo CLP, avaliamos a presença de infiltrados neutrofílicos no pulmão de animais WT e CCR4-/- após 6 horas da cirurgia. Para quantificarmos este infiltrado tecidual, determinamos o número de células presentes no tecido pulmonar através da quantificação da atividade de uma enzima específica nos neutrófilos, a mieloperoxidase (MPO). Os pulmões dos animais CCR4-/- e WT foram macerados e tratados a fim de obtermos a enzima mieloperoxidase livre para a quantificação de sua atividade. Nossos dados demonstram que o grupo L de animais CCR4-/- possui um menor infiltrado de células, comparado aos animais WT do grupo L. Essa diferença não foi observada nos grupos SL entre os animais WT e CCR4-/- (Figura 20). Assim, os animais CCR4-/- submetidos à sepse grave (grupo L) possuem uma reação inflamatória sistêmica mais branda do que nos animais WT provavelmente devido a uma melhor resposta inflamatória local.
0 2 4 6 8 10 12 14
WT CCR4
-/-SL L -/-SL L
*
**
Neutrófilos (x 103 celúlas / mg de pulmão)
Figura 20. Determinação do infiltrado neutrofílico pela atividade da MPO.
Animais WT e CCR4-/- foram eutanaziados após 6 horas de terem sido submetidos a sepse grave (L; n=5) ou moderada (SL; n=5). O pulmão foi obtido para determinar a atividade da enzima mieloperoxidase (MPO). ** p<0,01 comparado ao grupo L dos animais WT.
4.6. Quantificação de citocinas sistêmicas.
Como os animais CCR4-/- apresentam uma menor inflamação pulmonar, em seguida, quantificamos as quantidades de TNF-α e IL-10 presentes no plasma após 6 horas da cirurgia nos animais WT e CCR4-/- submetidos ao Sham, SL ou L. No sangue de animais CCR4-/- dos grupos Sham e SL podemos observar quantidades de TNF-α (Figura 21A) e IL-10 (Figura 21B) mais altas do que nos animais WT, apesar de não serem estatisticamente diferentes. No grupo L dos CCR4-/- havia uma menor quantidade das citocinas IL-10 e TNF-α quando comparado ao grupo L dos animais WT. Esses dados sugerem uma participação do CCR4 no controle da produção de TNF-α e IL-10 na resposta inflamatória da sepse grave. A menor liberação destes mediadores inflamatórios pode ter influenciado para a maior sobrevida observada nos animais deficientes de CCR4.
Sham SL L Sham SL L
0 20 40 60 80 100
WT
CCR4-/-TNF-α (pg/ml)
Sham SL L Sham SL L
0 200 400 600 800 1000
WT
CCR4-/-*
IL-10 (pg/ml)
A B
Figura 21. Quantificação de citocinas no plasma de animais sépticos.
Animais WT e CCR4-/- foram eutanaziados 6 horas após serem submetidos ao grupo L (n=6), SL (n=6) ou falsos operados (Sham, n=4). O sangue foi coletado contendo anticoagulante e centrifugado para obtenção do plasma. As amostras foram quantificadas por ELISA para (A) TNF-α e (B) IL-10. Os dados foram representativos de 2 experimentos e expressos como média ± EPM. * p< 0,05 quando comparado ao grupo L dos WT.
4.7. Avaliação do leucograma e celularidade da medula óssea.
Como controle dos nossos experimentos, avaliamos se os animais CCR4-/- possuem diferenças na quantidade de neutrófilos presentes no sangue e na medula óssea, podendo influenciar na migração celular e na contenção da infecção. Para tal, foi feita a análise da celularidade do sangue e da medula óssea por microscopia óptica. A porcentagem e o número de neutrófilos observados entre os animais CCR4-/- e WT não apresentaram diferença no esfregaço de sangue (Figura 22A) e nem na medula óssea (Figura 22B). Visto que não houve diferenças na quantidade de neutrófilos entre os animais CCR4-/- e WT podemos sugerir que o aumento da migração de células para o foco infeccioso após 6 horas da cirurgia nos CCR4-/- não se deve a alterações na produção dos neutrófilos nestes animais.
WT CCR4
-/-0 10 20 30 40
% de Neutrófilos
WT CCR4
-/-0 1 2 3 4 5 6 7 8
Neutrófilos (x106 células / fêmur )
A B
Figura 22. Leucograma e contagem de neutrófilos na medula óssea.
O sangue e a medula óssea de animais WT e CCR4-/- foram coletados. (A) As células no esfregaço sanguíneo foram diferenciadas pela morfologia em microscopia. (B) A medula óssea destes animais foram citocentrifugadas e coradas para análise da contagem diferencial através da morfologia. Os dados foram representativos de 2 experimentos e expresso como média ± EPM (n=3 / grupo).
4.8. Presença das células Tregs no sangue periférico e órgãos linfóides durante a sepse grave.
Diversos modelos experimentais demonstram que a presença das células Tregs (CD4+Foxp3+) no local pode regular a magnitude da resposta imune contra a infecção. Dessa forma, fomos investigar o papel do CCR4 sobre a localização destas células no sangue periférico e nos diferentes tecidos linfóides durante a sepse. No sangue, observamos que as porcentagens de células Tregs do grupo sepse grave CCR4-/- estavam elevadas em relação aos outros grupos (Figura 23A).
Este aumento foi de 45% nas porcentagens de células Tregs no sangue entre os grupos CLP do CCR4-/- e os WT. Os animais WT submetidos à sepse grave (CLP) não apresentaram diferenças entre os grupos CLP e Sham, diferente do observado nos animais CCR4-/-.
No baço, o aumento na porcentagem de células Tregs entre os grupos CLP dos animais CCR4-/- e WT foi de 70% (Figura 23B). O linfonodo não apresentou diferenças nas porcentagens de células Tregs entre os grupos CLP do CCR4-/- e WT (apenas uma discreta redução de 4%). Mas quando comparamos entre os grupos CLP e Sham, os animais CCR4-/- apresentaram menor aumento do que observado nos animais WT (Figura 23C). Os aumentos observados no baço e no sangue, mas não no linfonodo, dos animais CCR4-/- do grupo CLP em relação aos WT podem estar contribuindo para um controle de uma resposta inflamatória sistêmica exarcebada e conseqüentemente, favorecendo a sobrevida.
1° dia
A
B
C
Figura 23. População de células Tregs no sangue periférico, baço e linfonodo mesentérico 1 dia após a cirurgia. Animais WT e CCR4-/- foram eutanaziados 1 dia após a cirurgia, as células foram marcadas para CD4 e Foxp3 e analisadas por citometria de fluxo. (A) O sangue coletado foi marcado, os eritrócitos foram retirados com solução de lise e então as células foram fixadas. (n=4 /grupo). (B) O baço foi macerado, os eritrócitos foram retirados com solução de lise, as células marcadas e depois fixadas. (n=3-4 /grupo) (C) O linfonodo mesentérico foi macerado, marcado e
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0
WT
Sham CLP Sham CLP CCR4
-/-% de células CD4+Foxp3+
0 1 2 3 4 5 6 7
WT
Sham CLP Sham CLP CCR4
-/-% de células CD4+Foxp3+
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
W T
Sham CLP Sham CLP CCR4
-/-% de células CD4+Foxp3+
C
fixado. (n=3-4 /grupo). O conjunto de dot plot (esquerda) representa uma amostra de cada grupo e o gráfico (direita) foi expresso como média ± EPM.
4.9. Sobrevida dos animais WT e CCR4-/- submetidos ao CLP ou Sham operados desafiados com conídios de ASP.
Com o intuito de caracterizar a imunossupressão pós-sepse grave, desafiamos os animais CCR4-/- e WT após 4 dias do CLP ou Sham-operados com 7,5x107 conídios de ASP. O desafio com um patógeno é uma ferramenta importante para demonstrar a susceptibilidade à infecção secundária. Após o desafio (considerado como dia zero), a sobrevida foi acompanhada por 7 dias. Os animais do grupo Sham do WT e CCR4-/- apresentaram 100% de sobrevivência nos três primeiros dias após o desafio, mas apenas 22% dos animais do grupo Sham do CCR4-/- morreram no quarto dia após o desafio. Os animais do grupo CLP dos WT apresentaram uma redução significativa na sobrevivência, a sua taxa de sobrevida foi de 34%. O grupo CLP dos CCR4-/- apresentou 90% de sobrevida e não foi diferente dos grupos Sham de ambas as linhagens (Figura 24). Portanto, os animais CCR4-/- submetidos a sepse grave possuem maior resistência frente a infecções secundárias por conídios de ASP comparados aos animais WT pós-sépticos.
0 1 2 3 4 5 6 7 0
20 40 60 80 100
*
CCR4-/- Sham (n=9)
W T Sham (n=7) W T CLP (n=9) CCR4-/- CLP (n=11)
Dias após a infecção secundária
% sobrevida
Figura 24. Curva de sobrevida dos animais WT e CCR4-/- desafiados com ASP depois de submetidos ao CLP ou Sham-operados. Animais WT e CCR4-/- foram submetidos ao CLP ou Sham-operados e tratados com antibióticos 6, 24 e 48 horas após a cirurgia. Quatro dias após a cirurgia, os animais foram desafiados i.t. com 7,5x107 conídios de ASP. A partir deste dia (dia 0), a mortalidade foi acompanhada por 7 dias. * p< 0,01 comparados aos grupos Sham dos WT e CCR4-/- e ao grupo CLP dos CCR4-/-.
4.10. Avaliação da migração celular para o pulmão frente a um estímulo infeccioso.
Para caracterizarmos a resposta imune dos animais CCR4-/- frente à infecção secundária, analisamos a migração celular para o espaço broncoalveolar e a integridade do tecido pulmonar. A análise foi realizada 14 e/ou 48 horas após o desafio com o fungo. Primeiramente, fomos avaliar a migração celular nos animais após 14 horas (Figura 25A) e 48 horas (Figura 25B) do desafio com o fungo (barra preta) ou após administração de salina como controle (barra branca). Após 14 e 48 horas do desafio, a migração de neutrófilos induzida pelo fungo não foi diferente entre os grupos CLP dos animais WT e dos CCR4-/-, embora o grupo CLP dos CCR4-/- tenha apresentado uma ligeira diminuição na migração de neutrófilos quando comparado ao grupo CLP dos WT. Por outro lado, o grupo CLP dos animais
WT apresentou aumento da migração de neutrófilos para o BAL quando comparado ao grupo Sham, tanto 14 ou 48 horas após o desafio. Este aumento não foi observado nos animais CCR4-/-. Portanto, os nossos dados sugerem que a migração celular para o BAL é similar entre as linhagens. Este fato não parece ser importante na participação da resistência dos animais CCR4-/- frente a uma infecção secundária.
0 10 20 30 40 50
Sham CLP
WT CCR4
-/-Sham CLP neutrófilos (x105 células / cavidade)
0 10 20 30 40
50 Salina
ASP
Sham CLP
WT CCR4
-/-Sham CLP neutrófilos (x105 células / cavidade)
A B
Figura 25. Migração de neutrófilos para o BAL após 14 ou 48 horas do desafio com ASP ou salina em animais submetidos ou não ao CLP. Animais WT e CCR4-/- foram submetidos ao CLP ou Sham. Após 4 dias da cirurgia, os animais foram desafiados i.t. com 7,5x107 conídios de ASP (barra preta) ou salina (barra branca). O BAL foi coletado após 14 horas (A) e 48 horas (B) do desafio (n = 1-3 / grupo).
4.11. Análise histológica do pulmão de animais WT e CCR4-/- submetidos à sepse e desafiados com ASP.
Para avaliarmos a integridade do pulmão dos animais WT e CCR4-/-, o órgão foi recolhido após 48 horas do desafio e congelado. O pulmão do grupo CLP dos
animais CCR4-/- apresentou um menor infiltrado inflamatório em volta dos vasos e menor espessamento dos septos dos alvéolos quando comparados ao grupo CLP dos animais WT. Também observamos que ambos os grupos Sham dos animais WT e CCR4-/- apresentaram pequeno infiltrado celular, porém sem diferenças aparentes entre estes grupos (Figura 26). Os pulmões dos animais CCR4-/- apresentam melhor integridade estrutural e menor influxo celular. Estes fatores podem ter um papel importante na resistência à infecção secundária.
Figura 26. Analise histológica do pulmão de animais WT e CCR4-/- desafiados com ASP. Animais WT e CCR4-/- foram submetidos ao CLP ou Sham. Após 4 dias da cirurgia, os animais foram desafiados i.t. com 7,5x107 conídios de ASP. O pulmão foi coletado e congelado após 48 horas do desafio (n = 3-4 / grupo). Os cortes foram de 5 µm de espessura e corados por H&E. Aumento utilizado foi de 20X. As setas vermelhas indicam regiões com infiltrado celular.
WT
CCR4-/-
Sham CLP
4.12. Presença das células Tregs no sangue periférico e órgãos linfóides 5 dias após CLP.
A maior resistência dos animais CCR4-/- durante a fase inicial da sepse grave parece estar relacionada com as alterações nas porcentagens das células Tregs CD4+Foxp3+ no sangue, no baço e no linfonodo. Para avaliarmos se, assim como na fase aguda da sepse, o CCR4 pode influenciar a população das células Tregs pelos órgãos linfóides, fomos analisar a presença destas células Tregs CD4+Foxp3+ no sangue, baço e no linfonodo mesentérico 5 dias após a cirurgia. Um perfil distinto na disposição das células Tregs nos órgãos linfóides pode estar participando na supressão da resposta imune e influenciando na resistência dos camundongos CCR4-/- ao ASP.
No sangue periférico 5 dias após a cirurgia, observamos que os animais CCR4-/- do grupo CLP apresentaram uma redução de 17% de células Tregs em relação ao grupo CLP dos WT. Nos grupos Sham não observamos diferenças (menor que 1%) entre o CCR4-/- e o WT (Figura 27A). No baço observamos um aumento de 45% de células CD4+Foxp3+ do grupo CLP dos animais CCR4-/- em relação aos WT. Entretanto, as porcentagens de células Tregs do grupo Sham tanto dos CCR4-/- como dos WT apresentaram-se elevadas em relação ao grupo do CLP (Figura 27B). No linfonodo mesentérico, também observamos um aumento de 30%
na porcentagem de células CD4+Foxp3+ do grupo CLP dos animais CCR4-/- em relação aos WT (Figura 27C). Porém, nenhuma das diferenças foi estatisticamente significativa.
Visto que a disposição das células Tregs encontradas não apresentaram alterações nos animais CCR4-/-, o nosso grupo foi avaliar a presença direta das células Tregs no tecido pulmonar.
5° dia A
B
C
Figura 27. Presença de células Tregs no sangue periférico, baço e linfonodo mesentérico após 5 dias da cirurgia. Animais WT e CCR4-/- foram eutanaziados 5 dias após a cirurgia e as células foram marcadas para CD4 e Foxp3 e analisadas por citometria de fluxo. (A) O sangue coletado foi marcado, os eritrócitos foram retirados com solução de lise e então as células foram fixadas. (n=4 /grupo). (B) O baço foi macerado, os eritrócitos foram retirados com solução de lise, as células marcadas e depois fixadas. (n=3-4 /grupo) (C) O linfonodo mesentérico foi macerado, marcado e fixado. (n=3-4 /grupo). O conjunto de dot plot (esquerda)
WT
CCR4-/-
Sham CLP
Sham CLP Sham CLP 0.00
0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50
WT CCR4
-/-% de células CD4+ Foxp3+
CCR4-/- WT
Sham CLP Sham CLP 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
WT CCR4
-/-% de células CD4+Foxp3+
WT
CCR4-/-
Sham CLP Sham CLP 0
1 2 3 4 5 6 7 8
WT CCR4
-/-% de células CD4+ Foxp3+
Foxp3
representa uma amostra de cada grupo e o gráfico (direita) foi expresso como média
± EPM.
4.13. Presença de células Tregs no pulmão de animais pós-sépticos desafiados com ASP ou salina.
O próximo passo foi avaliar a presença de células Tregs no pulmão dos animais WT e CCR4-/-, e se o perfil a ser observado se correlaciona com a resistência a imunossupressão. Após 72 horas do desafio com ASP ou salina (Controle), o pulmão de animais WT e CCR4-/- submetidos ao Sham ou CLP foram retirados e digeridos com colagenase para obtenção de uma suspensão celular.
Cada grupo foi incubado com anticorpos conjugados a esferas magnéticas contra CD4 a fim de purificarmos as células CD4+ para analisar as células CD4+Foxp3+ por citometria de fluxo.
Nos grupos de animais que receberam salina como controle (Figura 28A), observamos um aumento da porcentagem de células Treg nos grupos CLP comparado ao grupo Sham, em ambas as linhagens, embora nos animais CCR4-/- a porcentagem de células Tregs foram menores quando comparados aos animais WT.
Mas quando desafiamos os animais com ASP (Figura 28B) observamos que a porcentagem de células Tregs do grupo CLP dos animais CCR4-/- aumentou em relação aos animais WT. E ainda observamos que a proporção de células Tregs diminuiu no grupo CLP comparado ao Sham dos animais WT. Os nossos dados sugerem que o aumento de células Tregs no local de infecção após 3 dias do desafio com ASP poderiam estar favorecendo a uma resposta contra o fungo e participando na sobrevida. A partir destes dados, fomos então investigar a função das células Tregs.
Figura 28. Presença de Tregs no pulmão de animais WT e CCR4-/- submetidos ao CLP e desafiados com ASP. Animais WT e CCR4-/- foram submetidos ao CLP ou Sham. Após 4 dias da cirurgia, os animais foram desafiados i.t. com salina (A) ou 7,5x107 conídios de ASP (B). Após 3 dias do desafio, um “pool” dos pulmões foram unidos em uma única amostra e digeridos por colagenase IV. As células CD4 foram purificadas por imunomagnetos e analisada para CD4+Foxp3+ por citometria de fluxo. O conjunto de dot plot (esquerda) representa uma amostra de cada grupo com o porcentual de CD4+Foxp3+ expresso e este valor foi expresso em gráfico (direita).
4.14. Inibição da migração de neutrófilos para o espaço broncoalveolar via Tregs obtidas de animais WT e CCR4-/- submetidos ou não ao CLP.
Para avaliarmos a função das células Tregs “in vivo” sobre a migração de leucócitos a um foco infeccioso, desafiamos os animais com 5x107 conídios de ASP i.t. e co-injetamos células Tregs obtidas dos animais WT e CCR4-/- submetidos ao CLP ou Sham-operados.
Os animais que receberam somente o desafio com o ASP tiveram um grande aumento do número de neutrófilos para o espaço broncoalveolar. Os animais que só receberam salina (grupo SAL) não apresentaram migração, como esperado. Quando os animais foram desafiados com o ASP e receberam células Tregs obtidas do grupo CLP dos animais CCR4-/- não observamos uma inibição da migração de neutrófilos para o local, nem de mononucleares (dados não mostrados). Entretanto, os animais que receberam células Tregs do grupo CLP dos WT apresentaram uma clara inibição da migração de neutrófilos (Figura 29). Animais que receberam células Tregs provenientes do grupo Sham do WT e CCR4-/- não foram capazes de inibir a migração de células (dados não mostrados). Esses dados sugerem que as Tregs do grupo CLP dos animais CCR4-/- não apresentam atividade supressora no que diz respeito a inibição da migração de neutrófilos para o espaço broncoalveolar.
0.0 0.5 1.0 1.5
SAL ASP
Tregs obtidas de:
CCR4 CLP
+ Treg:
*
WT CLP
N e u tr ó fi lo s (x 1 0
5c é lu la s/ ca vi d a d e )
Figura 29. Migração de neutrófilos para o lavado broncoalveolar de animais desafiados com ASP na presença ou ausência das células Tregs. Células Tregs foram obtidas de animais WT ou CCR4-/- após 4 dias de serem submetidos ao CLP ou Sham. Animais recipientes WT foram divididos em 4 diferentes grupos. Um grupo foi desafiado i.t. com salina e os outros com 5x107 conídios de ASP. Cada grupo de animais que receberam ASP também receberam concomitantemente salina ou co-injeções de 5x104 células Tregs CD4+CD25+ obtidas dos seguintes grupos: do grupo CLP dos WT ( , n= 6) e do grupo CLP dos CCR4-/- ( ; n = 6). Após 24 horas do desafio, fizemos o BAL e analisamos a contagem total e diferencial de leucócitos, distinguindo em células mononucleares ou neutrófilos. O gráfico representa o número de neutrófilos na cavidade expresso como média ± EPM. * p=0,0571 quando comparado ao grupo de animais que receberam células Tregs do grupo CLP dos CCR4-/- e p<0,05 quando comparado ao grupo que recebeu somente ASP.
4.15. Inibição da migração de neutrófilos “in vitro” via Treg obtidas de animais WT e CCR4-/- submetidos ou não ao CLP.
Para investigarmos qual o papel do CCR4 na inibição direta das células Tregs de animais pós-sépticos sobre os neutrófilos realizamos um ensaio de migração “in vitro”. Neutrófilos isolados da medula óssea de um animal selvagem e células Tregs obtidas de grupos CLP e Sham de animais WT e CCR4-/- foram pré-incubados e depois colocados para migrar numa câmara de quimiotaxia. As células Tregs obtidas de animais CCR4-/- do grupo CLP apresentaram uma fraca capacidade de inibir a migração de neutrófilos quando comparado com células Tregs provenientes dos animais WT do grupo CLP. Os neutrófilos incubados com células Tregs provenientes dos animais WT do grupo Sham também não inibiram a migração do neutrófilo frente a um gradiente quimiotático potente como o LTB4 (Figura 30).
0 4 8 12 16 20 24
RPMI
Tregs obtida de:
WT Sham CCR4 CLP
+ Treg Superior
LTB4
WT CLP
Inferior
RPMI RPMI
Poço
In d e x q u im io tá ti co
Figura 30. Inibição da migração de neutrófilos “in vitro” via Tregs obtidas de animais WT e CCR4-/-. Neutrófilos obtidos da medula óssea de animais WT foram pré-incubados por 2 horas a 37°C com células Tregs CD4+CD25+ obtidas de animais do grupo Sham ( ) ou CLP ( ) dos WT ou células do grupo CLP ( ) dos animais CCR4-/-, na razão de 40 vezes. Após a pré-incubação, as células foram incubadas em placas de 24 poços por 2 horas a 37°C frente ao LTB4. Como controle negativo ( ), os neutrófilos foram pré-incubados com apenas RPMI e incubados para migrar sem um agente quimiotático. No controle positivo ( ), os neutrófilos foram pré-incubados com RPMI e pré-incubados para migrar frente ao LTB4. A migração de neutrófilos foi avaliada pela contagem de células que migraram para o poço inferior (n=2). O index quimiotático foi calculado através de cada valor obtido dividido pela média dos valores do controle negativo. Os resultados foram expressos no gráfico como média ± EPM.
4.16. Inibição da produção de ROS por neutrófilos estimulados com PMA pelo SN de Tregs obtidas de animais WT e CCR4-/- submetidos ou não ao CLP.
Para investigarmos o mecanismo de ação das células Tregs sobre as funções dos neutrófilos, estes obtidos da medula óssea de animais WT foram pré-incubados por 2 horas com o SN das células Tregs obtidas do grupo Sham ou CLP de animais WT ou CCR4-/- por 18 horas. Em seguida, os neutrófilos foram estimulados com PMA para induzir a produção de ROS, o qual marcamos através de uma sonda fluorescente. A quantificação de ROS gerada foi realizada por citometria de fluxo.
O SN das células Tregs obtidas do grupo Sham de ambas as linhagens e do grupo CLP dos animais CCR4-/- não apresentaram uma forte inibição na produção de ROS dos neutrófilos estimulados quando comparados ao SN das células Tregs obtidas de animais WT do grupo CLP. O SN deste grupo apresentou uma inibição de quase 100% em relação aos neutrófilos sem estímulo (Figura 31). Assim, o sobrenadante obtido das células Tregs dos animais CCR4-/- pós-sépticos não parece apresentar um fator solúvel capaz de modular a produção de ROS em neutrófilos estimulados com PMA, como foi observado para os neutrófilos incubados no sobrenadante das células Tregs dos animais pós-sépticos WT.